專利名稱：嗜麥芽假單胞菌制劑(疫苗)及其制造方法
一、[技術(shù)領(lǐng)域]嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltrophilia)又稱嗜麥芽窄食單胞菌制劑(疫苗)及其制造方法屬微生物工程領(lǐng)域。利用這種細菌體或代謝產(chǎn)物(多糖)等生產(chǎn)特異性治療或預(yù)防特效藥物。
二、[背景技術(shù)]嗜麥芽假單胞菌制劑(疫苗)及其制造方法，本申請通過上網(wǎng)檢索未見有同類項目或技術(shù)，據(jù)所知與本申請最接近的現(xiàn)有技術(shù)，可見《中國生物制品規(guī)程》2000年版，“綠膿桿菌制造及檢定規(guī)程”P262-266，和“假單胞菌制劑制造及檢定規(guī)程”P272-276。但綠膿桿菌制劑或假單胞菌制劑僅限于治療腫瘤用途，而對嗜麥芽假單胞菌的預(yù)防和治療無效，因此本發(fā)明均無可取代，表明本申請具有新穎性。
(一)一般情況嗜麥芽假單胞菌與其他綠膿假單胞菌是廣泛存在于自然界和臨床常見的致病菌，一般認為條件致病菌，由于本菌具在天然的耐藥性，對抗生素可產(chǎn)生耐藥，因此開發(fā)特異性細菌免疫制劑代替抗生素化學療法當今受到極大重視，實踐證明用上述細菌制劑或其中提取物制劑，用于臨床治療和預(yù)防假單胞菌感染已取得較好效果。
已往理論認為假單胞菌均為低毒條件致病菌，其實本菌在住院病人中是一個高危潛在的致病菌，ICU病房中有40-50％病人均受該菌感染，從多年對假單胞菌感染防治研究中發(fā)現(xiàn)，假單胞菌雖多數(shù)是低毒細菌，但嗜麥芽假單胞菌是一株毒力較強的致病菌。
從假單胞菌感染發(fā)病率可以發(fā)現(xiàn)在近今十年中占全部臨床致病菌感染30％多，盡管國內(nèi)外生產(chǎn)的抗生素日新月異，包括頭孢類、奎諾酮類、氨基糖類，但本菌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，尤其嗜麥芽假單胞菌死亡率甚高，占所有假單胞菌感染死亡率35％左右。而從最近上網(wǎng)查找的資料情況，國內(nèi)外尚未見專一特異性對嗜麥芽假單胞菌的特效制劑面市，據(jù)此認為，當前抓緊開發(fā)對本菌特效制劑是當務(wù)之急，臨床十分需要這一類藥物。
嗜麥芽假單胞菌感染死亡率高的原因，動物實驗證明，嗜麥芽假單胞菌的毒力比一般其他綠膿假單胞菌的毒力強，對當今各類抗生素耐藥達90％以上，本菌除產(chǎn)生B奈酰胺酶還可產(chǎn)生誘導酶和超廣譜酶，所以嗜麥芽假單胞菌是一種臨床非常難治的致病菌。本制劑菌種是從醫(yī)院病患者隨機獲得的一株嗜麥芽假單胞菌，嗜麥芽假單胞菌制劑研究成功有望徹底解決當前對住院ICU患者的最大死亡威脅從多年全國住院感染性疾病學術(shù)會議中根據(jù)不完全統(tǒng)計，對住院獲得性假單胞菌感染加上自然假單胞菌感染年發(fā)病率約1000萬人次，而其中嗜麥芽假單胞菌感染病例約占三分之一，即每年約為300-400萬人次，說明假單胞菌感染病特別對住院病人深受其害，甚至病人在住院期間不間斷地多次假單胞菌不同菌種反復(fù)感染，以致死于本菌嚴重毒血癥告終。這是國內(nèi)外近10年來對院內(nèi)感染的突出難題，要解決本菌的防治問題唯一辦法就是開發(fā)嗜麥芽假單胞菌制劑，這一制劑安全、高效，無耐藥性，是一種最具特異性防治藥物。
(二)嗜麥芽假單胞菌的文獻出處1、嗜麥芽假胞菌是1960年由Hugh和Rysehemkow首次發(fā)現(xiàn)并命名嗜麥芽假單胞菌。HughR，Ryschemkow E.An alcaligenes Like Pseudomonas species(abstract).Bacteriol Proc，1960，6078.
2、SMA 1983年Swings等人認為本菌的基因及生化有別于假單胞菌將之重新歸類于黃單胞菌屬，即嗜麥芽黃單胞菌，1995年再次更名為嗜麥芽窄食單胞菌。Swings J，De VosM，Vanden Mooter M，et al.Transfer of Pseudomonas maltophilia(Hugh 1981)Comb Nov.Int J SystBacteriol，1983，33409-413.
3、嗜麥芽假單胞菌是廣譜抗生素大量使用之后新發(fā)現(xiàn)的病原菌，多侵犯危重病人或免疫功低下的病人，可引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、呼吸道、尿道和傷口感染等，并可從這些病人的血液、痰液、傷口、肺心病等培養(yǎng)分離獲得嗜麥芽假單胞菌菌種。本人承諾，從本發(fā)明申請之日起20年內(nèi)，可向有關(guān)公眾發(fā)放“嗜麥芽假單胞菌”菌種，特此聲明。專利權(quán)人余國華。
4、Mett H.Rostas，Schacher B，etat.Outer Member Penneability and B-Lactamase Contemt inPseudomonas Malto Philia Clincae isolates and Labcratory mutants.Rev Infect Dis，1988，10765-769.
5、Davin-Regli A，Bollet C.Sufftay JP，et al，Use of random amplified polymorphic DNArorepidemiological typing of stenotrophomonas maltophilia.J Hosp Infect 1996 32(1)396、Von Graevenitz A.Acinetobacter，Alcaliyenes，Moraxella and other nonfermentatiye Gramnegative bacteria InMurry PR(ed).Manual of Clinial Microbiology.6thed.WashingtonDCAmerican Society for Microbiology 19955207、Fujita J，Yamadori I，Xu G，et al.Clinical features of stenotrophomonas maltophiliapneumonia in immunocomproised pat inents.Respir Med，1996，9035-38.
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10、Muder RR，Harris AP，Muller S，et al.Bacteremia due to stenotrophomonas(xanthomonas)maltophiliaa prospective，multicenter study of 91 episodes.Clin Infect Dis，1996，55508-512.本發(fā)明的嗜麥芽假單胞菌的來源是從“八五”國家玫關(guān)期間收集全國從住院病人分離的360株嗜麥芽假單胞菌中隨機抽取的其中一株菌種，經(jīng)培養(yǎng)傳代并凍干(牛奶)制備主種子批和工作種子批用于制造制劑(疫苗)，保存?zhèn)溆谩?br> (三)本菌株的形態(tài)及生物學特征1嗜麥芽假單胞菌生物學特征將待檢假單胞菌種接種于PH7.2-7.4的肉湯瓊脂、營養(yǎng)瓊脂或其它適宜培養(yǎng)基，均為革蘭氏陰性桿菌，最適宜溫度35℃-37℃，可產(chǎn)生菌毛無定形排列，或能溶血和產(chǎn)生綠色素。
菌種名稱形態(tài)和培養(yǎng)特征嗜麥芽假單 形態(tài)為長或略呈彎曲的革蘭氏陰性桿菌，菌落光滑有光澤，白色或淡黃色，胞菌 最適宜生長溫度37℃，在血瓊脂平板上不溶血，在普通脂平板培養(yǎng)基可形成不透明淡黃色菌落，氧化酶陰性。2嗜麥芽假單胞菌生化反應(yīng)菌種用Vek法國梅里埃全自動微生物系統(tǒng)鑒定，鑒定確認為嗜麥芽假單胞菌，結(jié)果如下菌種嗜芽假單胞菌
99％ Pseudomonas maltrophilia3血清凝集試驗用嗜麥芽假單胞菌37℃培養(yǎng)18-20小時的培養(yǎng)物，以1％甲醛滅活，用無菌生理氯化鈉溶液稀釋，使其含菌10×108/ml與假單胞菌免疫診斷血清(做定量凝集試驗)。充分混合后，置37℃過夜，以肉眼見到凝集(+)之血清最高稀釋度為凝集效價。
4毒力試驗嗜麥芽假單胞菌分別用37℃培養(yǎng)18-20小時的瓊脂培養(yǎng)物，以無菌生理氯化鈉溶液稀釋成含菌1.2×109/ml、8×108/ml、4×108/ml、2×108/ml等濃度菌液，腹腔注射體重14-16g小鼠，每個濃度菌液使用5只小鼠，每只0.5ml，觀察3-7天，計算LD50結(jié)果。
5毒性試驗分別采用嗜麥芽假單胞菌37℃培養(yǎng)18-20小時的瓊脂培養(yǎng)物混懸于生理氯化鈉溶液內(nèi)，56℃加溫2小時(或其也方法)殺菌，不加防腐劑。殺菌試驗合格后，分別將每種假單胞菌液稀釋成1ml含菌6.0×109、3.0×1091.5×109共3個濃度，每一假單胞菌濃度懸液0.5ml腹腔注射體重16-18g小鼠5只，觀察3天，注射7.5×108至3.0×109個滅活菌體的小鼠觀察結(jié)果。
從臨床血液、痰液、體液等標本分離嗜麥芽假單胞菌，直接將標本接種于肉湯、血平板和嘜康凱氏培養(yǎng)(見“全國臨床檢驗操作規(guī)程”中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司編.1991年一版P379-381)，然后按操作規(guī)程方法進行細菌分離鑒定，即可獲得純嗜麥芽假單胞菌。
三、[發(fā)明內(nèi)容](一)存在問題嗜麥芽假單胞菌是廣譜抗生素大量使用后新發(fā)現(xiàn)的病原菌，侵犯重危病人，可引起菌血癥、心內(nèi)膜尖、呼吸道、尿道和傷口等。研究結(jié)果表明，本菌對頭孢霉素類抗生素、頭霉素類，一代、二代、三代頭孢菌素(除CAZ和CFP)，加酶抑制劑復(fù)合抗生素(除外TIM)，單環(huán)β-內(nèi)酰胺藥，亞胺培南等其活性很低，其敏感率僅為0.6-23.10％，說明嗜麥芽假單菌對當今的抗生素廣泛耐藥，而高效治療藥物和預(yù)防問題未見面市，本發(fā)明是針對解決嗜麥芽假單胞菌感染的預(yù)防和治療以及抗生素耐藥性問題獲得“八五”玫關(guān)的重大科研成果獎，具有創(chuàng)造性和實用性。雖然嗜麥芽假單胞菌是早已為人所知的一種微生物，由于它的毒性較強或各種原因，但在現(xiàn)有技術(shù)人們不知道用它可以制造出對嗜芽假單胞感染能防能治兼對腹水癌、肺癌有特殊療效的藥物。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明其特征是通過制造一種嗜麥芽假單胞菌制劑(疫苗)達到對本菌感染特異性預(yù)防和治療為目的兼有對某些惡性腫瘤治療效果，至今在國內(nèi)外尚屬首創(chuàng)研究證明，其技術(shù)特征是由已知的任何一種嗜麥芽假單胞菌制成嗜麥芽假單胞菌制劑(疫苗)加入乳糖或甘露醇、右旋糖酐組合凍干粉針劑產(chǎn)品均可達到上述同樣效果。
嗜麥芽假單胞制劑(疫苗)制造方法其特征是由本菌經(jīng)過培養(yǎng)或發(fā)酵收集培養(yǎng)物、代謝產(chǎn)物、裂解產(chǎn)物、制取菌體制劑、活性蛋白制劑、多糖蛋白制劑或亞單位等生產(chǎn)系列制劑(疫苗)包括針劑、粉針劑、氣霧劑、栓劑、含服片劑等常用劑型。
1、菌體制劑(疫苗)嗜麥芽假單胞菌固體培養(yǎng)采用35-38℃恒溫培養(yǎng)16-20小時培養(yǎng)物，在70-100℃，30-60分鐘加熱滅菌或用0.5-0.6甲醛滅活，于0.8-1.1％甲醛恒溫36-38℃，7天脫毒，使制劑(疫苗)達到最佳抗原性和免疫原性，能保證制品的有效性與安全性。
2、多糖蛋白制劑(疫苗)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)8-18小時，加甲醛溶液，其最終濃度為0.5-2.0％(ml/ml)，經(jīng)去核酸處理，用十六烷基溴化銨或其他適宜的沉淀劑沉淀。用冷酚提取，氯化鈣或其他適宜溶液透析。制取精制提純多糖。
由嗜麥芽假單胞菌制造菌體制劑和多糖蛋白，還可制造活性蛋白內(nèi)毒素蛋白，微粒蛋白，外毒素蛋或亞單位制品等，用于防治本菌感染和治療惡性腫瘤。
本發(fā)明制造菌體制劑(疫苗)和多糖蛋白制劑的方法，亦可應(yīng)用于制造其他微生物疫苗和多糖等制品的生產(chǎn)，如制造傷寒桿菌制劑(疫苗)炭疽菌制劑(疫苗)肉毒桿菌制劑(疫苗)和腦膜炎球菌多糖制劑(疫苗)等系列產(chǎn)品。
(三)、發(fā)明效果本發(fā)明的用途是一種特異性針對嗜麥芽假單胞菌以毒攻毒，能防能治的生物制品，應(yīng)用后，可使機體產(chǎn)生特異性抗體，即產(chǎn)生自動免疫，從而達到預(yù)防和治療以及提高抗生素治療效果，尤其不會導致細菌對制品產(chǎn)生耐藥性。除對嗜麥芽假單胞菌有效外，研究證明對小鼠腹水腫瘤和血癌有抑制作用。本發(fā)明主要對機體產(chǎn)生特異和非特異性免疫，提升體液免疫和細胞免疫，因此除對嗜麥芽假單胞菌預(yù)防和治療以及對腫瘤有一定治療價值。本發(fā)明的另一優(yōu)點是藥物生產(chǎn)成本比抗生素低得多，相對價格便宜，患者易于接受，可大大減輕病人經(jīng)濟負擔。
1、效力試驗免疫接種和毒菌攻擊實驗評價制劑(疫苗)的保護效果用終濃度不超過1.1±0.1％的甲醛溶液殺菌，以不加防腐劑的菌液用無菌生理鹽水制劑(疫苗)稀釋，使其含嗜麥芽假單胞菌2×109/ml億。選體重14-16克小鼠，每只皮下注射菌液0.5ml，間隔5天注射一次，共注射3次，未次免疫后7-10天，用3個LD50毒菌攻擊，同時應(yīng)用同批飼養(yǎng)或體重與免疫相同的小鼠至少10只作對照，分別于腹腔注射3個LD50嗜麥芽假單胞毒菌，觀察3天，對照組小鼠死亡數(shù)90％，制劑(疫苗)免疫組小鼠保護率100％。
2、抗原性試驗結(jié)果選體重2公斤左右的家兔至少3只，嗜麥芽假單胞菌單價免疫菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集試驗，測定效價，2/3家兔血清凝集效價在1∶2560。
以上表明本發(fā)明制造方法，生產(chǎn)的制劑(疫苗)產(chǎn)品動物試驗證明臨床療效顯著。從檢驗報告結(jié)果可見，按中華人民共和國衛(wèi)生部藥鑒局的各項新藥產(chǎn)品指標，均符合有關(guān)質(zhì)量標準和合格規(guī)定。
3、交叉免疫力試驗用終濃度不超過1.1±0.1％的甲醛溶液殺菌，以不加防腐劑的菌液稀釋，使期含嗜麥芽假單胞菌2×109/ml。選體重14-16克小鼠，每只皮下注射菌液0.5ml，間隔5天注射一次，共注射3次，末次免疫后7-10天，分別用不同的綠膿假單胞菌3個LD50毒菌攻擊，同時應(yīng)用同批飼養(yǎng)或體重與免疫相同的小鼠至少10只作對照，分別于腹腔注射3個LD50毒菌，觀察3天，結(jié)果對照組小鼠保護率為15％，免疫組小鼠保護率為87.5％。說明嗜麥芽假單胞菌制劑對綠膿假單胞菌有廣譜免疫作用。
嗜麥芽假單胞菌制劑免疫與綠膿假單胞菌毒菌攻擊免疫力試驗結(jié)果
4、抑瘤試驗抑瘤試驗結(jié)果，抑瘤率81.2％。
嗜麥芽假單胞菌制劑(疫苗)及制造方法Repuirements for Pseudomonas maltrophilia Preparation1.定義、組成及用途本品系用嗜麥芽假單胞菌株培養(yǎng)后，取菌苔制成懸液，用甲醛滅活，以PBS稀釋，每小瓶2ml含菌2×109加右旋糖酐60mg凍干制成，用于嗜麥芽假單胞菌感染和惡性腫瘤的輔助治療。
2制造
2.1基本要求2.1.1設(shè)施與生產(chǎn)管理按中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求實施。
2.1.2原料及輔料應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》的要求。未納入上述標準的化學試劑，應(yīng)不低于化學純。
2.1.3生產(chǎn)用水生產(chǎn)用水應(yīng)符合國家飲用水標準，純化水及注射用水應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》標準。
2.1.4生產(chǎn)用器具直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃等器具，必須嚴格清洗及去熱源處理或滅菌下理。
2.1.5生產(chǎn)及檢定用動物家兔、小鼠、豚鼠應(yīng)符合清潔級或SPF級標準。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源制造用廣州嗜麥芽假單胞菌種應(yīng)經(jīng)國家藥品管理當局批準，由國家藥品檢定機構(gòu)或國家指定的單位保管和分發(fā)。
2.2.2種子批的建立生產(chǎn)用菌種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。原始種子批應(yīng)驗明其記錄、歷史、來源和生物學特性，從原始種子批傳代、護增凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。
2.2.3種子批菌種檢定2.2.3.1將待檢菌種接種于PH7.2-7.4的肉湯瓊腸、馬丁瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基，應(yīng)為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，最適宜溫度35℃，約0.5um×1.5um，可產(chǎn)生菌毛，菌落光滑，有光澤邊緣整齊白灰色或淡黃色。
2.2.3.2生化反應(yīng)麥芽糖、丙二酸鹽枸椽酸鹽及DNA試驗呈陽性，氧化酶陰性反應(yīng)。
2.2.3.3血清凝集試驗用35℃培養(yǎng)18-20小時的培養(yǎng)物，以1％甲醛滅活，用無菌生理氯化鈉溶液稀釋，使其含菌10×108ml，與嗜麥芽假單胞菌免疫診斷血清(效價2560-5210)做定量凝集試驗，充分混合后，置37℃過夜，以肉眼見到凝集(+)之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)效價。凝集效價應(yīng)不低于原血清效價之半。
2.2.3.4毒力試驗用35℃培養(yǎng)18-20小時的瓊脂培養(yǎng)物，以無菌生理氯化鈉溶液稀釋成含菌2×107/ml、1×107/ml、5×106/ml、2.5×106/mlt等濃度菌液，腹腔注射體重14-16g小鼠，每個濃度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，觀察3-7天，計算LD50。一個LD50含菌數(shù)應(yīng)不低于5×106。
2.2.3.5毒性試驗用35℃培養(yǎng)18-20小時的瓊脂培養(yǎng)物混懸于生理氯化鈉溶液內(nèi)，60℃加溫2小時(或其他方法)殺菌，不加防腐劑。殺菌試驗合格后，稀釋成每1ml含菌4.0×109、2.0×109、及1.0×109、共3濃度，每個濃度菌懸液0.5ml腹腔注射體重15-18g小鼠15只，觀察3天，注射1.0×109至2.0×109個死菌體的小鼠應(yīng)全部生存。
2.2.3.6免疫力試驗用終濃度不超過1.1±0.10％的甲醛溶液殺菌，以不加防腐劑的菌液稀釋，使其含菌2.0×109ml。選體重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，間隔5天注射1次.共注射3次，末次免疫后7-10天，用3個LD50的毒菌攻擊。同時應(yīng)用同批飼養(yǎng)或體重與免疫組相同的小鼠死亡數(shù)應(yīng)不低于80％，免疫組小鼠保護率應(yīng)不低于70％。
2.2.3.7抗原性試驗選體重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力試驗用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集試驗，測定效價。2/3家兔血清凝集價應(yīng)不低于1∶2560。
2.2.4菌種傳代及保存2.2.4.1菌種應(yīng)凍干保存于2-8℃，主種子批自啟開后傳代不得超過6次。
2.2.4.2生產(chǎn)前應(yīng)檢查菌種的全部特性，合格后方可用于生產(chǎn)。
2.3原液制備2.3.1生產(chǎn)用種子將工作種子批菌種啟開后，接種于營養(yǎng)瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基，置35-36℃培養(yǎng)，一般不超過18小時，傳代不得超過5代，由此制備適宜數(shù)量的生產(chǎn)用工作種子，用于生產(chǎn)。
2.3.2生產(chǎn)用培養(yǎng)基用PH7.2-7.4的營養(yǎng)瓊脂或國家藥品管理當局批準的其他培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中不應(yīng)含有對人體有害或其他過敏原物質(zhì)。
2.3.3菌種接種和培養(yǎng)采用克氏瓶涂種法，置35℃培養(yǎng)18-20小時，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行純菌劑的原液放置20-26℃ 14-16天離心洗滌后保存于2-8℃。
2.3.4收獲和殺菌培養(yǎng)結(jié)束后，于采集的培養(yǎng)物中加入適量PBS至甲醛終濃度不超過1％，加殺菌劑的原液放置20-26℃ 14-16天離心洗滌后保存于2-8℃。
2.3.5無菌試驗取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和馬丁培養(yǎng)基及普通瓊脂斜面各3管。置35℃培養(yǎng)5天，如有本菌生長，重新殺菌后加倍量復(fù)試一次，如有雜菌生長應(yīng)廢棄。
2.4原液檢定按3.1項進行。
2.5半成品配制可用單批或多批檢定合格的原液合并，用PBS稀釋加入3.0％右旋糖酐，經(jīng)除菌過濾，加入原液使每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
2.6半成品檢定按3.2項進行。
2.7分批按本版規(guī)程通則《生物制品分批規(guī)程》進行。
2.8分裝、凍干按本版規(guī)程通則《生物制品分裝規(guī)程》進行。
2.9規(guī)格本品規(guī)格為每小瓶2ml，含菌1.8×109-2.2×109，內(nèi)含右旋糖酐50mg。
2.10包裝按本版規(guī)程通則《生物制品包裝規(guī)程》進行。
3檢定3.1原液檢定3.1.1細菌形態(tài)應(yīng)正常3.1.2無菌試驗按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A項進行。
3.1.3濃度測定按“中國藥品生物制品檢定所細菌濁度標準”進行測定。
3.1.4原液保存原液濃度應(yīng)不高于1.0×1011/ml，保存于2-8℃。
原夜自采集殺菌之日起至制劑稀釋時，不得少于2個月，保存期自采集殺菌之日起不超過6個月。
3.2半成品檢定3.2.1無菌試驗按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A項進行。
3.2.2制劑濃度每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
3.3成品檢定3.3.1鑒別試驗與相應(yīng)高效價血清進行凝集試驗，應(yīng)呈強凝集反應(yīng)。
3.3.2外觀為白色凍干粉針劑、溶解后不應(yīng)含有搖不散的凝塊或異物。
3.3.3化學檢定按本版規(guī)程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.3.3.1PH值為6.4-7.4。
3.3.3.2游離甲醛應(yīng)小于0.06g/L。
3.3.3.3右旋糖酐按現(xiàn)行《中國藥典》進行。含30g/L。
3.3.4無菌試驗按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A項進行3.3.5異常毒性試驗按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。小鼠注射0.5ml，豚鼠注射1.5ml。
3.3.6濃底測定按“中國藥品生物制品檢定所細菌濁度標準”進行濃度測定，每小瓶2ml含菌應(yīng)為2.0×109，誤差不得超過10％。
3.3.7菌型及純菌染色鏡檢至少觀察10個視野，應(yīng)為革蘭氏陰性短小無芽胞桿菌，不應(yīng)有雜菌。
3.3.8抑瘤試驗取體重為18-20g的BALB/c小鼠腹腔接種S180細胞，5天后取小鼠腹水瘤細胞，臺酚蘭染色并計數(shù)，配制細胞濃度為2.5×106/ml的細胞液，按5.0×105(0.2ml)鼠的劑量腹股溝皮下接種18-20g的BALB/c小鼠(植瘤)至少30只，隨機分為治療與對照兩組，治療組在植瘤后隔日腋部皮下注射本品0.5ml/鼠，共注射8次，對照組注射等量無菌生理氯化鈉溶液，末次注射后5天，處死小鼠，取瘤并稱重，計算制劑的抑瘤率，計算公式如下。
抑瘤率超過50％，方為合格。
4保存、運輸及有效期于2-8℃避光保存和運輸，自效力檢定合格之日起有效期為3年。
使用說明組成和性狀本品系用嗜麥芽假單胞菌經(jīng)培養(yǎng)殺菌后稀釋至一定濃義制備而成，成品外觀白色。
規(guī)格本品規(guī)格為每小瓶2ml，含菌2.0×109。
質(zhì)量標準本品依據(jù)《中國生物制品規(guī)程》生產(chǎn)和檢定，質(zhì)量符合要求。
藥理作用本菌株是病患者分離的嗜麥芽假單胞菌，本菌在目前所有致病性假單胞菌中毒力最強，毒性最小和免疫力最好的假單胞菌，動物試驗證明；對動物免疫系統(tǒng)有明顯提高機體免疫作用，激活吞噬細胞功能和產(chǎn)生高效特異性抗體，以及對腫瘤有明顯的抑制作用。
適應(yīng)癥接種后能改善機體免疫狀況，可用于治療嗜麥芽假單胞菌感染和惡性腫瘤患者的輔助治療，降低本病的發(fā)病率和死亡率。
用法與劑量用無菌注射用水2ml溶解，上臂皮下注射，隔日注射1次，10次為1個療程，第1次注射1ml，以后每次注射雙臂皮下各1ml。兒童減半。
嗜麥芽假單胞多糖制劑、疫苗及制造方法Repuirements for Ps.maltrophilia Typhoid Vaccine1定義、組成及用途本品系用嗜麥芽假單胞菌經(jīng)培養(yǎng)的提純精制的多糖制成，用于住院病人預(yù)防和治療住院獲得性嗜芽單胞和其他綠膿假單胞菌感染，以及惡性腫瘤的輔助治療。
2制造2.1基本要求2.1.1設(shè)施與生產(chǎn)質(zhì)量管理按中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求實施。
2.1.2原料及輔料應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》的要求，未納入上述標準的化學試劑，應(yīng)不低于化學純。
2.1.3生產(chǎn)用水生產(chǎn)用水源應(yīng)符合國家飲用水標準純化水及注射用水應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》標準。
2.1.4生產(chǎn)用器具直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃器具，必須嚴格清洗并作去熱原質(zhì)處理和滅菌處理。
2.1.5生產(chǎn)及檢定用動物小鼠、豚鼠應(yīng)符合清潔級標準。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源制造多糖疫苗用的菌種(嗜麥芽假單胞菌)及檢定用的診斷血清，應(yīng)經(jīng)國家藥品管理當局批準，并由國家藥品檢定機構(gòu)或國家指定單位分發(fā)。
2.2.2種子批的建立生產(chǎn)用菌種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。原始種子的比應(yīng)驗明其記錄、歷史、來源和生物特性。從原始種子批傳代、擴增后凍干保存的為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。
2.2.3種子批的檢定檢定菌種可用PH7.2-7.4肉湯瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基。
2.2.3.1形態(tài)及培養(yǎng)特征將待檢的菌種接種于改良半綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基，35-37℃培養(yǎng)16-20小時，涂片鏡檢應(yīng)為革蘭氏陰性桿菌，菌形整齊。在普通瓊脂平板上應(yīng)為圓形、中等大小、無色半透明、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的菌落。
2.2.3.2生化反應(yīng)待檢的菌中氧化酶陰性，麥芽糖陽性，L精氨酸水解，液化明膠。用Viek法國梅里埃全自動生化系統(tǒng)鑒定，確認為嗜麥芽假單胞菌(99％ Sgenotl opomonas maltophilia)。
2.2.3.3血清學特性用35-37℃培養(yǎng)16-20小時活的培養(yǎng)物與嗜麥芽假單胞菌血清做玻片凝集試驗，應(yīng)有強凝集(+++)，與對照血清不凝集或僅有較弱凝集。
用上述培養(yǎng)物，以PBS稀釋成含菌6.0×108/ml制成經(jīng)100℃ 30分鐘加熱殺菌或用終濃度為0.5％(ml/ml)甲醛溶液殺菌處理的菌液(亦可用活菌)，分別與嗜芽假單胞血清(用甲醛殺菌或活菌菌液)血清(用加熱殺菌菌液)作定量凝集效價應(yīng)不低于血清原效價之半。
2.3原液制備2.3.1生產(chǎn)用種子啟開工作種批菌種，接種于改良半綜合培養(yǎng)基或其他適家養(yǎng)基，35-37℃培養(yǎng)，一般不超過20小時?？墒褂霉腆w或液體培養(yǎng)基傳代，由此制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用工作種子，但傳代不得超過5代。
2.3.2生產(chǎn)用培養(yǎng)基生產(chǎn)嗜麥芽假單胞菌多糖疫苗用改良半綜合培養(yǎng)基或國家藥品管理當局批準的其他培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不應(yīng)含有能加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成份，也不能含有對人體有害或其他過敏原物質(zhì)。
2.3.3菌種接種和培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于培養(yǎng)基中接種菌后，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行細菌濃度測定及純菌試驗，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)出污染雜菌，應(yīng)廢棄。
2.3.4收獲和殺菌培養(yǎng)物于對數(shù)生期后期、靜止期前期收獲，一般培養(yǎng)8-12小時為宜(根據(jù)菌種接種量及所用培養(yǎng)種類而異)。加入甲醛溶液殺菌，期最終濃度為0.5％-2.0％(ml/ml)。
2.3.5提純和精制2.3.5.1去核酸殺菌完成后，離心去菌體收集上清液，加入十六烷基三甲溴化銨，充分混勻，形成沉淀放置適當時間離心，收集沉淀物。用蒸餾水溶解沉淀，并加入適量1mol./L氯化鈉(或2mol./L氯化鈣)溶液，搖動或攪拌1小時，使多糖與十六烷基三甲溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25％(ml/ml)，冷庫靜置1-3小時或過夜，離心去沉淀，收集澄清的上清液。
2.3.5.2沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80％(ml/ml)，充分振搖，使多糖沉淀，離心收集沉淀，然后用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即為多糖制品，保存于-20℃以下，待進一步提純。
2.3.5.3多糖的的精制將精制品溶解小于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml 1/10飽和醋酸鈉溶液)提取3-5次，離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，必要時或有條件時也可用其他方法去除內(nèi)毒素活性。再加入乙醇至最終濃度為75％-80％(ml/ml)。離心收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用無熱原質(zhì)蒸餾水溶解，經(jīng)除菌過濾后，取樣進行無菌試驗、血清學試驗及各項生化測定。提取過程應(yīng)盡量在15℃以下進行。提純多糖應(yīng)保存于-20℃以下。
2.3.5.4再制提純多糖的蛋白，核酸含量及其他指標若達不到要求，可再制一次。
2.4原液檢定按3.1項進行
2.5原液保存原液應(yīng)保存于-20℃以下，自收菌之日起有效期為5年。
2.6半成品配制可用單批或多批多糖合并，在無菌條件下，用無熱原PH6.5-7.5PBS稀釋，每人用劑量含多糖應(yīng)不低于30ug。
2.7半成品檢定按3.2項進行2.8分批按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品分批規(guī)程》進行。
2.9分裝按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品分裝規(guī)程》進行。
2.10規(guī)格本品規(guī)格為每瓶5ml、1ml或0.5ml；每人用劑量0.5ml，含嗜麥芽假單胞菌多糖應(yīng)不低于30ug。
2.11包裝按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品包裝規(guī)程》進行。
3檢定3.1原液檢定3.1.1化學檢定按《中國生物制品規(guī)格》年版規(guī)程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.1.1.1固體總量測定每批多糖應(yīng)按干烤法測定固體總量，計算干重。
3.1.1.2蛋白質(zhì)含量每批提純多糖的蛋白質(zhì)含量應(yīng)小于10mg/g，按Lowry法測定，用牛血清白蛋白作對照。
3.1.1.3核酸含量每批提純多糖的核酸含量應(yīng)小于20mg/g，用紫外分光度法測定，核酸在260nm波長處的吸收系數(shù)(E1cm1％)為200。
3.1.1.4O-乙?；棵颗峒兌嗵堑腛-乙?；繎?yīng)不低于2mmol/g，按Hestrin法測定。
3.1.1.5分子大小測定每批提純多糖的分子大小應(yīng)用瓊脂糖CL-4B凝膠過濾法測定。KD值在0.25以前的洗脫液多糖回收率應(yīng)在50％以上。
3.1.2特異性測定每批提純多糖應(yīng)采用瓊脂擴散試驗方法進行血清學特異性試驗，嗜芽假單胞菌多糖與嗜麥芽假單胞菌特異性血清48小時內(nèi)形成明顯沉淀線，與對照血清不形成沉淀線。
3.2半成品檢定無菌試驗按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A項進行。
3.3成品檢定3.3.1鑒別試驗每批疫苗至少取1瓶進行鑒別試驗，按3.1.2項進行。
3.3.2外觀應(yīng)為無色透明液體，無異物。
3.3.3化學檢定按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.3.3.1PH值為6.5-7.5。
3.3.3.2防腐劑含量如加苯酚防腐劑，其含量為2.5-5.0g/L。
3.3.4無菌試驗按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A項進行。
3.3.5異常毒性試驗按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品異常毒性試驗規(guī)程》進行。
3.3.6熱原質(zhì)試驗按《中國生物制品規(guī)程》年版規(guī)程通則《生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程》進行，家兔注射量為0.025ug/kg體重。
3.3.7多糖含量測定每批疫苗應(yīng)檢查多糖含量，采用火箭電泳法測定，每人用劑量多糖含量應(yīng)不低于30ug。
4保存、運輸及效期于2-8℃避光保存和運輸，自稀釋之日起有效期為2年。
5使用說明組成和性狀本品系用嗜芽假單胞菌經(jīng)培養(yǎng)后提純精制的多糖稀釋制成，為無色透明液體，不含有異物或凝塊。
規(guī)格本品規(guī)格為每瓶5ml、1ml或0.5ml；每人用劑量0.5ml，含嗜麥芽假單胞菌多糖應(yīng)不低于30ug。
質(zhì)量標準本品依據(jù)《中國生物制品規(guī)格》年版生產(chǎn)和檢定，質(zhì)量符合要求。
作用和用途本疫苗接種后，可使機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。用于預(yù)防和治療嗜麥芽假單胞菌和其他綠膿假單胞菌感染。
接種對象重點用于住院病人預(yù)防和治療住院獲得性嗜麥芽假單胞菌和其他綠膿假單胞菌感染。
用法與劑量(1)途徑上臂外側(cè)三角肌經(jīng)消毒后肌內(nèi)注射。
(2)劑量每人0.5ml.
(3)免疫次數(shù)預(yù)防用1-2次，治療用5-6次。
禁忌有下列情況者，不得使用本疫苗(1)發(fā)熱、嚴重心臟病、高血壓、肝、腎臟病及活動性結(jié)核。
(2)孕婦、有經(jīng)及哺乳期婦女。
(3)有過敏反應(yīng)病史者。
(實施例1)菌種名稱及來源制造嗜麥芽假單胞菌種 經(jīng)國家藥品管管當局批準，由國家藥品檢定機構(gòu)或國家指定的單位保管和分發(fā)。
種子批的建立生產(chǎn)用菌種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。從主種子批制備工作種子批。工作種子批用于生產(chǎn)。種子批菌種檢定形態(tài)及培養(yǎng)檢定將待檢菌種接種于PH7.2-7.4的肉湯瓊腸、馬丁瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基，應(yīng)為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，最適宜溫度35℃，約0.5цm×15цm，可產(chǎn)生菌毛，菌落光滑，有光澤邊緣整齊白灰色或淡黃色。
生化反應(yīng)丙二酸鹽枸椽酸鹽及DNA試驗呈陽性，氧化酶陰性反應(yīng)。
血清凝集試驗用35℃培養(yǎng)18-20小時的培養(yǎng)物，以1％甲醛滅活，用無菌生理氯化鈉溶液稀釋，使其含菌10×108ml，與嗜麥芽假單胞菌免疫診斷血清(效價2560-5120)做定量凝集試驗，充分混合后，置37℃過夜，以肉眼見到凝集(+)之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)效價。凝集效價就不低于原血清效價之半。
毒力試驗用35℃培養(yǎng)18-20小時的瓊脂培養(yǎng)物，以無菌生理氯化鈉溶液稀釋成含菌2×107ml、1×107ml、5×106ml、2.5×106ml等濃度菌液，腹腔注射體重14-10g小鼠，每個濃度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，觀察3-7天，計算LD50。一個LD50含菌數(shù)應(yīng)不低于5×106。
毒性試驗用35℃培養(yǎng)18-20小時的瓊脂培養(yǎng)物懸于生理氯化鈉溶液內(nèi)，60℃加溫2小時(或其他方法)殺菌，不加防腐劑。殺菌試驗合格后，稀釋成每1ml含菌4.0×109、2.0×109及1.0×109共3濃度，每個濃度菌懸液0.5ml腹腔注射體重15-18g小鼠15只，觀察3天，注射1.0×109至2.0×109個死菌休的小鼠應(yīng)全部生存。
免疫力試驗用終濃度不超過1.1％±0.10％的甲醛溶液殺菌，以不加防腐劑的菌液稀釋，使其含菌2.0×109ml。選體重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，間隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7-10天，用3個LD50的毒菌攻擊。同時應(yīng)用同批飼養(yǎng)或體重與免疫組相同的小鼠至少10只作對照，分別于腹腔注射3個LD50毒菌，觀察3天，對照組小鼠死亡數(shù)應(yīng)不低于80％，免疫組小鼠保護率應(yīng)不低于70％。
抗原性試驗選體重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力度驗用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集試驗，測定效價。2/3家兔血清凝集價應(yīng)不低于1∶2560。生產(chǎn)前應(yīng)檢查菌種的全部特性生產(chǎn)用種子將工作種子批菌種啟開后，接種于營養(yǎng)瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基，置35-36℃培養(yǎng)，一般不超過18小時。
菌種接種和培養(yǎng)采用克氏瓶涂種法，置35℃培養(yǎng)18-20小時，在培養(yǎng)過種中及殺菌前取樣進行純菌試驗，涂片做革蘭氏染色鏡檢。
收獲和殺菌培養(yǎng)結(jié)束后，于采集的培養(yǎng)物中加入適量PBS至甲醛終濃度不超過1％，加殺菌劑的原液放置20-26℃，14-16天離心洗滌后保存于2-8℃。
單批或多批檢定合格的原液合并，用PBS稀釋加入3.0％右旋糖酐，經(jīng)除菌過濾，加入原液使每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
原液檢定細菌形態(tài)應(yīng)正常，無雜菌。
原液自采集殺菌之日起至制劑稀釋時，不得少于2個月，保存期采集殺菌之日起不超過6個月。
制劑濃度每2ml含菌1.8×109-2.2×109?；蛩璨煌瑵舛群透鞣N制型。
濃度測定按“中國藥品生物制品檢定所細菌濁度標準”進行濃度測定，每小瓶2ml含菌應(yīng)為2.×109，誤左不得超過10％。
抑瘤試驗取體重為18-20gBALB/C小鼠腹腔接種S180細胞，5天后取小鼠腹水瘤細胞，臺酚蘭染色并計數(shù)，配制細胞濃度為2.5×106/ml的細胞液，按5.0×105(0.2ml)/鼠的劑量腹股溝皮下接種18-20g的BALB/C小鼠(植瘤)至少30只，隨機分為治療與對照兩組，治療組在植瘤后隔日腋部皮下注射本品0.5ml/鼠，共注射8次，對照組注射等量無菌生理氯化鈉溶液，末次注射后5天，處死小鼠，取瘤并稱重，計算制劑的抑瘤北，計算公式如下。
抑瘤率超過50％，方可合格。
(實施例2)菌種名稱及來源制造多糖疫苗用的菌種(嗜麥芽假單胞菌)及檢定用的診斷血清，應(yīng)經(jīng)國家藥品管理當局批準，并由國家藥品檢定機構(gòu)或國家指定單位分發(fā)。
生產(chǎn)用菌種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。擴增后凍干保存的為主種子批。從主種子批制備工作種子批。
工作種子批用于生產(chǎn)。
種子批的檢定檢定菌種可用PH7.2-7.4的肉湯瓊脂基或其他適宜培養(yǎng)基。
形態(tài)及培養(yǎng)特征將待檢的菌種接種于改良半綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基，35-37℃培養(yǎng)16-20小時，涂片鏡檢應(yīng)為革針陰性桿菌，菌形整齊。在普通瓊脂平板上應(yīng)為圓形、中等大小、無色透明、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的菌落。
生化反應(yīng)待檢的菌種氧化酶陰性，麥芽糖陽性，L精氨酸水解，液化明膠。用Vilek法國梅里埃全自動生化系統(tǒng)鑒定，確認為嗜麥芽假單胞菌(99％ Stenotl ophomonas maltophilia)。
血清學特性用35-37℃培養(yǎng)16-20小時活的培養(yǎng)物與嗜麥芽假單胞菌血清做玻片凝集試驗，應(yīng)有強凝集(+++)，與對照血清不凝集或僅有車水馬龍弱凝集。
用上述培養(yǎng)物，以PBS稀釋成含菌6.0×108/ml制成經(jīng)100℃ 30分鐘加熱殺菌或用終濃度為0.5％(ml/ml)甲醛溶液殺菌處理的菌液(亦右用活菌)，分別與嗜芽假單胞菌血清(用甲醛殺菌或活菌菌液)血清(用加熱殺菌菌液)作定量凝集試驗。充分混勻后，放37℃過夜以肉眼觀察結(jié)果，凝集(+)之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)效價。凝集效價不低于血清原效價之半。
生產(chǎn)用種子啟開工作種子批菌種，接種于改良半綜合培養(yǎng)基或其他適宜養(yǎng)基，35-37℃培養(yǎng)，一般不超過20小時，可使用固體或液體培養(yǎng)基傳代，由此制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用工作種子，但傳代不進超過5代。
生產(chǎn)用培養(yǎng)基生產(chǎn)嗜芽假單胞菌多糖疫苗用改良半綜合培養(yǎng)基或國家藥品管理當局批準的其他培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不應(yīng)含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分，也不能含有對人體有害或其他過敏原物質(zhì)。
菌種接種和培養(yǎng)采用罐液體培養(yǎng)，于培養(yǎng)基中接中接種菌種后，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行細菌濃度測定及純菌試驗，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。
收獲和殺菌培養(yǎng)物于對數(shù)生長期后期、靜止期前期收獲，一般培養(yǎng)8-12小時為宜(根據(jù)菌種接種量及所用培養(yǎng)基種類而異)。加入甲醛溶液殺菌，其最終濃度為0.5％-2.0％(ml/ml)。
提純和精制去核酸殺菌完成后，離心去菌體收集上清液，加入十六烷基三甲溴化銨，充分混勻，形成沉淀放置適當時間離心，收集沉淀物。用蒸餾水溶解沉淀，并加入適量lmol/L氯化鈉(或2mol/L)溶液，搖動或撐拌1小時，使多糖與十六烷基三甲溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25％(ml/ml)，冷庫靜置1-3小時或過夜，離心去沉淀，收集澄清的上清液。
沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80％(ml/ml)，充分振搖，使多糖沉淀，離心收集沉淀，然后用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即為多糖制品，保存于-20℃以下，待進一步提純。
多糖的精制將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml 1/10飽和醋酸鈉溶液)提取3-5次，離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，必要時或有條件時也可用其他方法去除內(nèi)毒素活性。再加入乙醇至最終濃度為75％-80％(ml/ml)。離心收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用無熱原質(zhì)蒸餾水溶解，經(jīng)除菌過濾后，取樣進行無菌試驗、血清學試驗及各項生化測定。提取進程應(yīng)盡量在15℃以下進行。提純多糖保存于-20℃以下。
原液應(yīng)保存于-20℃以下，自收菌之日起有效期為5年。
可用單批或多批多糖合并，在無菌條件下，用無熱原PH6.5-7.5PBS稀釋，每人劑量含多糖應(yīng)不低于30ug。
化學檢定每批多糖應(yīng)按干烤法則定固體總量，計算干重。
蛋白質(zhì)含量每批提純多糖的蛋白質(zhì)含量應(yīng)小于10mg/g，按Lowry法測定，用牛血清白蛋白作對照。
核酸含量每批提純多糖的核酸含量應(yīng)小于20mg/g，用紫外分光度法測定，核酸在260nm波長處的吸收系數(shù)(E1cm1％)為200。
O-乙酰基含量每批提純多糖的O-乙?；繎?yīng)不低于2mmol/g，按Hestrin法測定。
每批提純多糖的分子大小應(yīng)用瓊脂糖CL-4B凝膠過濾法測定。KD值在0.25以前的洗脫液多糖回收率應(yīng)在50％以上。
特異性測定每批提純多糖應(yīng)采用瓊脂擴散試驗方法進行血清學特異性試驗，嗜芽假單胞菌多糖與嗜芽假單胞菌特異性血清48小時內(nèi)形成明顯沉淀線，與對照血清不形成沉淀線。
防腐劑含量如加苯酚防腐劑，其含量為2.5-5.0g/L。
多糖含量測定每批疫苗應(yīng)檢查多糖含量，采用火箭電泳法測定，每人用劑量多糖含量不低于30Ug。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種嗜麥芽假單胞菌制劑疫苗及其制造方法，其特征是由嗜麥芽假單胞菌制造嗜麥芽假單胞菌制劑疫苗，同時加入乳糖或甘露醇、右旋糖酐組合成產(chǎn)品，作醫(yī)藥用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1嗜麥芽假單胞菌制劑、疫苗產(chǎn)品、其特征是一種嗜麥芽假單胞菌制劑、疫苗和嗜麥芽假單胞菌多糖或多糖蛋白制劑疫苗，包括液體注射劑、凍干粉針劑、氣霧劑、栓劑或含服片劑等常用劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1嗜麥芽假胞菌制劑、疫苗的制造方法、其特征是通過嗜麥芽假單胞菌固體培養(yǎng)，控制在35-38℃恒溫培養(yǎng)16-20小時、在70-100℃、30-60分鐘滅菌或0.5-0.6甲醛滅活，于0.8-1.1％甲醛溶液中控溫36-37℃，脫毒7天，最后制成嗜麥芽假單胞菌制劑、疫苗產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3嗜麥芽假單胞菌制劑、疫苗的制造方法，其特征是通過采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)8-10小時，用甲醛溶液滅菌，其最終濃度為0.5-2.0％(ml/ml)，經(jīng)過去核酸處理，用十六烷基溴化銨或其他適宜沉淀劑沉淀，然后用冷酚提取，氯化鈣或其他適宜的溶液透析，得嗜麥芽假單胞菌精制提純多糖，由此進一步組合成產(chǎn)品，本方法同時可用于制造炭疽菌疫苗和其他微生物多糖制劑、疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-2嗜麥芽假單胞菌制劑、疫苗產(chǎn)品的用途，其特征是用于防治嗜麥芽假單胞菌和綠膿假單胞菌感染以及治療腹水癌和血癌等。
全文摘要
本發(fā)明公開一種對嗜麥芽假單胞菌(又稱嗜麥芽窄食單胞菌)和綠膿假單胞菌以及惡性腫瘤患者提高體液免疫和細胞免疫的生物制品，其特征是由嗜麥芽假單胞菌制備而成，嗜麥芽假單胞菌制劑(疫苗)和嗜麥芽假單胞菌多糖制劑(疫苗)產(chǎn)品它可以被制備成各種常用的免疫制劑或免疫調(diào)節(jié)劑型，本發(fā)明藥物具有預(yù)防和治療嗜麥芽假胞菌和綠膿假單胞菌感染以及治療腹水癌、血癌的特殊效果。
文檔編號A61P31/04GK1781552SQ20041005242
公開日2006年6月7日 申請日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月30日
發(fā)明者余國華 申請人:余國華