專利名稱：：固氮嗜麥芽窄食單胞菌株c4y41及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明專利屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一株固氮嗜麥芽窄食單胞菌株C4Y4及其應用。
背景技術(shù)：
：目前全世界約有5000萬hm2的熱帶人工林，且每年增加300萬hm2左右(Binkleyetal.，2004)。其中，桉樹(Eucalyptussp.)占熱帶人工林總面積的40%左右，木材產(chǎn)量占50%以上，正發(fā)揮著越來越重要的作用。中國的桉樹人工林面積已達170萬hi^，桉樹已成為我國三大造林樹種之一，造林面積僅次于印度和巴西，居世界第三位。桉樹速生、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，最優(yōu)雜交家系年平均生長量可達69.8mVhm2，最優(yōu)無性系年平均生長量達64.8m3/hm2。桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶動了交通運輸業(yè)、造紙、人造纖維、人造板工業(yè)等的發(fā)展，同時為社會提供了大量的勞動就業(yè)機會，為社會穩(wěn)定起到了重要的作用。桉樹人工林也存在很多問題，例如(1)生產(chǎn)力問題。桉樹人工林2、3、4代木材蓄積量分別比第l代下降了20.9%，38.7%和50.5%;生物量分別下降了19.6%，26.7%和44.6%。可見，桉樹人工林的地力衰退問題是相當嚴重的。許多桉樹林輪伐期只需45年。這意味著被帶走的養(yǎng)分越來越多。除了過度收獲外，全墾整地和不合理施肥也會導致桉樹人工林地力衰退。(2)水分問題。20世紀80年代以來，桉樹人工林是否較其他樹種人工林消耗更多的土壤水分成為關(guān)注的焦點。對比觀測地下水位，發(fā)現(xiàn)桉樹林地下水位深911m、裸地為14m、混交林為34m。桉樹是不具有固氮自肥能力的非豆科植物，目前桉樹人工林的速生高產(chǎn)完全依賴施用N、P、K復合肥，導致土壤微量元素缺乏，土壤肥力降低，出現(xiàn)生產(chǎn)力下降；大量施用化學肥料，導致土壤板結(jié)，土壤結(jié)構(gòu)被破壞，林地保水能力差而出現(xiàn)的水分問題。這是實現(xiàn)桉樹可持續(xù)發(fā)展的最大障礙。然而通過人工接種固氮菌，建立桉樹根際聯(lián)合固氮體系，使原本不能共生固氮的桉樹獲得固氮能力，將空氣中的分子態(tài)氮變?yōu)榭晒╄駱湮绽玫陌睉B(tài)氮，促進桉樹生長。這對于日趨貧瘠的桉樹林地土壤改良，地力保持具有重要意義和應用前旦豕。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供經(jīng)過篩選、具有高效固氮活性、對桉樹苗木有明顯促生作用的一株固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41新菌種。本發(fā)明還有一個目的是提供該菌株菌液的培養(yǎng)方法和應用于桉樹苗木的接種方法，公開該菌株的應用。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的野外調(diào)查，發(fā)現(xiàn)羅漢松在自然界中普遍具有結(jié)瘤現(xiàn)象。且從羅漢松根瘤中分離出內(nèi)生細菌，經(jīng)過鑒定，其中的一些內(nèi)生細菌具有固氮酶活性，用這些菌株接種后能促進苗木生長。為利用這些菌株接種植物、促進植物生長的應用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明人已作過廣泛深入的研究，從非豆科植物羅漢松根瘤分離純化獲得內(nèi)生細菌，對其生物學特性、生理生化特性、固氮結(jié)瘤能力、接種苗木促進生長等系統(tǒng)試驗和檢測。本發(fā)明所述的固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41已于2009年10月23日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址中國科學院微生物研究所)，保藏編號CGMCCNo.3349?！?固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41的分離從小葉羅漢松側(cè)根上采集有根瘤的細根，用自來水沖洗干凈后，用75%乙醇對根瘤表面進行消毒lmin，再用0.1%的酸性氯化汞消毒56min。將根瘤置于滅過菌的研缽中輕輕研磨。取汁液用劃線法接種于已加剛果紅的YMA培養(yǎng)基上，2『C培養(yǎng)2天左右，挑選不吸剛果紅的菌落，重復劃線篩選，然后根據(jù)菌落大小、形狀、表面光澤、隆起程度、透明程度、邊緣形狀和菌落顏色的差別，挑選單菌落，經(jīng)過光學顯微鏡檢查得到所需的純化完全的菌株。所述YMA培養(yǎng)基成分及含量為磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.lg，甘露醇10.0g，酵母膏0.4g，瓊脂粉15g，水1000ml，自然p朋.8，121。C蒸汽滅菌20min。二.固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41的性質(zhì)1.形態(tài)特征在YMA培養(yǎng)基上，菌株的菌落為圓形、乳白色、產(chǎn)粘液、邊緣整齊。有鞭毛，可運動。無芽孢。2.培養(yǎng)特性該菌的最適生長條件為pH=7.27.4，溫度28°C。能利用廣泛的碳源和氮源。3.生理特性經(jīng)革蘭氏染色反應鏡檢為陰性，呈直桿狀。4.功能特性對固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y4116SrDNAPCR序列進行測定，測序結(jié)果如序列表所示，將菌株的16SrDNA序列在美國國立生物信息中心NCBI網(wǎng)上進行BLAST比較，找到與Genbank中同源性最高的相關(guān)序列，確定該菌株為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。用乙炔還原法檢測菌株有固氮酶活性，其酶活為0.0190.030翻1.g-、h—、接種到桉樹苗木能促進苗木生長，其中苗高增加2.2022.12%，地徑增加22.1536.84%%，生物量增加40.4760.81%，葉綠素含量增加12.6834.07%，葉片硝酸還原酶活性增加21.8236.69%。具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。實施例11、固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41菌株的分離、純化從小葉羅漢松側(cè)根上采集有根瘤的細根，用自來水沖洗干凈后，用75%乙醇對根瘤表面進行消毒lmin，再用0.1%的升汞消毒56min。將根瘤連同細根置于滅過菌的研缽中研磨，加少量無菌水，研勻后加蓋靜置，澄清片刻。取上清液用劃線法接種于已加剛果紅的YMA培養(yǎng)基上，2『C培養(yǎng)2天左右，挑選不吸剛果紅的菌落，重復劃線篩選培養(yǎng)，然后再選擇圓形、乳白色、產(chǎn)粘液、邊緣整齊的菌落。顯微鏡檢測有鞭毛，可運動，無芽孢。得到純化完全的菌種。所述YMA培養(yǎng)基成分及含量為磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.lg，甘露醇10.0g，酵母膏0.4g，瓊脂粉15g，水lOOOml，自然p朋.8，121。C蒸汽滅菌20min。2、固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41回接試驗試驗用Jenson液體培養(yǎng)基的成分及含量為磷酸氫鈣1.Og，磷酸氫二鉀0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，三氯化鐵0.lg，水1升。每升加lml微量元素母液，所述微量元素母液含量如下硼0.05%，錳0.05%，鋅0.005%，鉬0.005%，銅0.002%。選飽滿小葉羅漢松種子，先在75%的酒精中處理lmin，水洗56次，然后用0.1X的升汞表面滅菌6min，水洗67次，在無菌水中浸種過夜。將吸漲的種子移入無菌瓊脂培養(yǎng)基中，25t:恒溫培養(yǎng)催芽。將胚根長至45cm的小葉羅漢松幼苗轉(zhuǎn)移到盛有Jensen培養(yǎng)液的封口三角瓶中，每瓶加2ml菌液，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，以不加菌液為空白對照。對照與接種處理各設(shè)20個重復。接菌的小葉羅漢松幼苗培養(yǎng)至6個月時，采用日本產(chǎn)GA-9A氣相色譜儀，用乙炔還原法測定幼苗根系的固氮酶活性，測得其酶活為0.0190.030nmol.g—、h—、實施例2用浸根法接種固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41對桉樹苗木影響的試驗本試驗在位于南寧市郊廣西國營高峰林場苗圃進行。試驗用苗木來自廣西國營高峰林場組培廠生產(chǎn)的廣林巨尾桉9號(GLGU9)無性系組培瓶苗。把組培瓶苗移出瓶后，先用自來水將培養(yǎng)基清洗干凈，再用甲基托布津消毒，濾干苗木體表的消毒液后備用。浸根法接種將以上處理的幼苗在移植到營養(yǎng)杯之前，用固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41菌液浸泡苗木根部2030min，然后定植到營養(yǎng)杯，共接種苗木5000株，營養(yǎng)杯土為黃心土。苗木按常規(guī)育苗方法管理。三個月后測定苗木平均株高、地徑、生物量、葉綠素含量和葉片硝酸還原酶活性。結(jié)果見表l。表1浸根法接種C4Y41對桉樹苗木的影響測定指標苗高(cm)地徑C鵬)生物量(g/株)葉綠素含量(%)硝酸還原酶活性(4gN02/g.h)接種8.81.22.2490.49711.439CK7.20.91.3980.4349.390+CK(o/o)22.1225.0060.8114.6821.82從表1可見，接種C4Y41菌株能明顯增加桉樹苗木的株高、地徑和單株生物量，促進了苗木的生長，還能提高苗木葉片的葉綠素含量和硝酸還原酶活性。方差分析結(jié)果表明，處理間的苗高差異達到極顯著水平(F=7.5120**>FO.01=5.06);地徑差異達到顯著水平(F=5.0060*>FO.05=3.11);生物量差異達到極顯著水平(F=15.3470**>FO.01=5.06);硝酸還原酶活性差異達到極顯著水平(F=122.9640**>FO.01=5.06)。實施例3用噴霧法接種固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41對桉樹苗木影響的試驗本試驗在位于南寧市郊南寧蔬菜研究所苗圃進行。5試驗用苗木來自廣西國營高峰林場組培廠生產(chǎn)的廣林巨尾桉9號(GLGU9)無性系組培瓶苗。把組培瓶苗移出瓶后，先用自來水將培養(yǎng)基清洗干凈，再用甲基托布津消毒，濾干苗木體表的消毒液后備用。噴霧接種法在苗木移植入營養(yǎng)杯后，用噴壺將固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41菌液均勻噴霧于定植在營養(yǎng)杯的桉樹苗木上，共接種苗木2萬株，6小時內(nèi)不澆水。營養(yǎng)杯土為黃心土。苗木按常規(guī)育苗方法管理。三個月后測定苗木平均株高、地徑、生物量、葉綠素含量和葉片硝酸還原酶活性。結(jié)果見表2。表2噴灑法接種C4Y41對桉樹苗木的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表2可見，用噴灑法接種C4Y41菌株也能明顯增加桉樹苗木的株高、地徑和單株生物量，促進了苗木的生長，還能提高苗木葉片的葉綠素含量和硝酸還原酶活性。方差分析結(jié)果表明，處理間的苗高差異達到極顯著水平(F=6.1890**>F0.01=5.06);地徑差異達到極顯著水平(F=5.9330**>F0.01=5.06);硝酸還原酶活性差異達到極顯著水平(F=67.4260**>F0.01=5.06)。實施例4用固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41和根瘤菌雙接種對桉樹苗木影響的試驗本試驗在位于南寧市郊小高峰苗圃進行。試驗用苗木來自廣西國營高峰林場組培廠生產(chǎn)的廣林巨尾桉9號(GLGU9)無性系組培瓶苗。把組培瓶苗移出瓶后，先用自來水將培養(yǎng)基清洗干凈，再用甲基托布津消毒，濾干苗木體表的消毒液后備用。雙接種法用固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41和豆科植物根瘤菌液混合，配成混合菌液，然后再以浸根方法接種，共接種苗木2萬株。營養(yǎng)杯土為黃心土。苗木按常規(guī)育苗方法管理。三個月后測定苗木平均株高、地徑、生物量、葉綠素含量和葉片硝酸還原酶活性。結(jié)果見表3。表3C4Y41和根瘤菌雙接種對桉樹苗木的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表3可見，用C4Y41和根瘤菌雙接種也能明顯增加桉樹苗木的株高、地徑和單株生物量，促進了苗木的生長，還能提高苗木葉片的葉綠素含量和硝酸還原酶活性。方差分析結(jié)果表明，處理間的地徑差異達到極顯著水平(F=18.072**>F0.01=2.96);生物量差異達到極顯著水平(F=12.4830**>F0.01=2.96);葉綠素含量達到差異顯著水平(F=2.6510*>F0.05=2.15);硝酸還原酶活性差異達到極顯著水平(F=10.8670**>FO.01=2.96)。以上實施例2、3、4表明，在桉樹育苗其間，接種固氮菌株C4Y41能明顯促進苗木的生長，苗高、地徑、生物量、葉綠素含量、硝酸還原酶活性均高于對照。葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，植物葉片葉綠素含量的多少影響到植物光合作用的效果，進而影響到植物體光合產(chǎn)物的積累以及植物自身的固氮效果，對植物生長起到非常重要的作用。硝酸還原酶是硝酸鹽同化中第一個酶，也是限速酶，處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置。它與植物吸收利用氮肥有關(guān)，對植物生長有著重要影響，因而硝酸還原酶活性被當作植物吸收利用氮素等營養(yǎng)以及生長的指標之一。桉樹幼苗接種固氮菌后，葉綠素含量明顯增加，硝酸還原酶活性顯著提高，因而促進了苗木的生長，接種的幼苗苗高生長、地徑生長及生物量明顯提高。可見固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41適合應用于桉樹苗木的育苗。序列表〈110>廣西大學〈120〉固氮嗜麥芽窄食單胞菌C4Y41及其應用〈160>1〈210>1〈211>1440〈212>DNA〈213>嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)〈220〉〈400〉1cggcgtacgtagcgttagatccgggctcgggccggcgteccaaggtegggteacctttgg60tttgtttttgagcggggaggaacteggaagaatcccctttgttttgtgggattttgtggg120gaaacttaaaateateaggcaatttttggttttgtgaaagcaggggatcttcggaccttg180cgcgattgaatgagccgatgtcggattegctegttggcggggteaaggcccaccaaggcg240acgatccgtegctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccaga300ctcctecgggaggcagcagtggggaat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