一種檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐 藥基因的引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基糖苷類抗生素是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類抗生素，包括 鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素等，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可把氨基糖苷類抗生素分為鏈霉胺類 和2-脫氧鏈霉胺類。
[0003] 氨基糖苷類抗生素抗菌譜較廣，對許多革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及結(jié)核分枝桿菌 有抗菌作用，可以作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的多個環(huán)節(jié)并破壞細(xì)菌 細(xì)胞膜的完整性。此外，氨基糖苷類抗生素還可通過離子吸附作用附著于細(xì)菌菌體表面，造 成細(xì)胞膜缺損，使膜通透性增加；氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致翻譯錯誤所形成的異常蛋白質(zhì)也 可能插入細(xì)胞膜，增加膜的通透性。
[0004] 氨基糖苷類抗生素是廣譜、高效抗生素，適合治療由革蘭陰性菌引起的嚴(yán)重感染， 對腸桿菌科細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌活性，同時對假單胞菌屬、氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等細(xì)菌也 有一定作用，但對腸球菌屬和鏈球菌屬無效。
[0005] 隨著氨基糖苷類抗生素廣泛而大量的使用，細(xì)菌對該類抗生素逐漸產(chǎn)生了抗藥 性，耐藥菌的出現(xiàn)較大的限制了該類藥物的應(yīng)用，從而導(dǎo)致治療失去效果?？股啬退幮允?由抗生素藥物的不當(dāng)使用造成的，細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥主要由氨基糖苷修飾酶 引起，其耐藥機(jī)制主要由靶位改變、通透性降低或轉(zhuǎn)運(yùn)能力喪失、鈍化酶的產(chǎn)生等。臨床上 細(xì)菌對氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥的最重要原因是鈍化酶的產(chǎn)生，即抗生素的氨基或羥基被酶修 飾后與核糖體結(jié)合不緊密而不能進(jìn)入下一階段發(fā)揮抗菌作用，使得細(xì)菌在抗生素存在的情 況下仍能存活。在細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)對抗生素進(jìn)行修飾的氨基糖苷類鈍化酶主要有氨基糖苷乙酰 轉(zhuǎn)移酶（aac)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（aph)、氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶（ant)等，而在嗜水氣單胞 菌中存在的鈍化酶主要是aac(6'）_Iz和aph。
[0006] 細(xì)菌耐藥性檢測可以分為常規(guī)表型檢測（即藥敏試驗）和耐藥基因檢測，其中，前 者首先需要從臨床樣品中分離純化菌株，而有許多生長緩慢或?qū)I養(yǎng)有特殊需求的菌株無 法通過常規(guī)藥敏試驗檢測其耐藥性。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌耐 藥基因檢測中并取得了很大進(jìn)展，其操作相對簡單，可在實驗室內(nèi)實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確檢測。但 是，針對嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因還沒有開發(fā)出成熟的PCR試劑盒，目前的檢測 方法效率比較低、檢測精度差、特異性不強(qiáng)。為了克服上述缺陷，本發(fā)明設(shè)計了用于嗜水氣 單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測的引物組合物，能夠快速、準(zhǔn)確地對耐藥基因進(jìn)行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、準(zhǔn)確、操作簡便的檢測試劑盒，實現(xiàn) 對嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因aac(6'）_Iz、aph的快速檢測。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下引物對：
[0009] (1)擴(kuò)增aac(6'）-Iz耐藥基因的引物對，其核苷酸序列如SEQIDN0:1和SEQID NO:2所示；
[0010] (2)擴(kuò)增aph耐藥基因的引物對，其核苷酸序列如SEQIDNO: 3和SEQIDNO: 4所 示；
[0011] 上述2對引物對在一次檢測中共同使用。
[0012] 上述檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物在制備嗜水氣單胞菌氨基糖 苷類耐藥基因的檢測試劑盒中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0013] -種嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒，試劑盒包括如下試劑：
[0014] (1)PCR反應(yīng)液：該P(yáng)CR反應(yīng)液中含有DNA聚合酶1U、10XPCR反應(yīng)緩沖液、 Mg2+1. 5mM、dNTP200μΜ;
[0015] (2)引物混合液：將SEQIDNO: 1-4所示的4種引物混合，用ddH20溶解，每條引物 的濃度為2. 5μΜ;
[0016] (3)陽性對照：分別含有aac(6'）-Iz、aph耐藥基因的嗜水氣單胞菌基因組DNA的 水溶液；
[0017] (4)陰性對照：大腸桿菌基因組DNA的水溶液。
[0018] 本發(fā)明的一個方面是提供了一種檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物 組合物，其特征在于，包括如下引物對：
[0019] ⑴擴(kuò)增aac(6'）_Iz耐藥基因的引物對，其核苷酸序列為
[0020] FI：5, -CCCATCTCAACGCCTTTC-3r(SEQIDN0:1)；
[0021] R1 ：5, -AAGAAGACGACCCGCTCC-3r(SEQIDNO:2)；
[0022] 和 / 或
[0023] (2)擴(kuò)增aph耐藥基因的引物對，其核苷酸序列為
[0024] F2 ：5, -GCGATTCCCTCTTGTTG-3r(SEQIDNO:3)；
[0025] R2 :5'-GCAGGCGAAGGTCTCA-3'(SEQIDN0:4);上述 2 對引物對在一次檢測中單 獨(dú)或共同使用。
[0026] 本發(fā)明的另一個方面是提供了一種上述檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因 的引物組合物在制備檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的試劑中的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明的再一個方面是提供了一種嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑 盒，其特征在于，所述是試劑盒包含如上所述的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的 引物組合物。
[0028] 進(jìn)一步地，該試劑盒還包括如下試劑：
[0029] (1)PCR反應(yīng)液：該P(yáng)CR反應(yīng)液中含有DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP;
[0030] (2)陽性對照：分別含有aac(6'）-Iz、aph耐藥基因的嗜水氣單胞菌基因組DNA的 水溶液；
[0031] (3)陰性對照：大腸桿菌基因組DNA的水溶液；
[0032] 所述引物組合物中的引物以ddH20溶解，每種引物的濃度為2. 5μΜ。
[0033] 進(jìn)一步地，陽性對照中含耐藥基因的嗜水氣單胞菌基因組DNA濃度為10ng/μL， 陰性對照中大腸桿菌基因組DNA的濃度為20ng/μL。
[0034] 本發(fā)明的再一個方面是提供了一種上述嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測 試劑盒在檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因中的應(yīng)用
[0035] 本發(fā)明的再一個方面是提供了一種非診斷和治療目的的檢測嗜水氣單胞菌氨基 糖苷類耐藥性的方法，將樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以上述的引物組合物對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，所得 PCR樣品進(jìn)行檢測，具有擴(kuò)增結(jié)果的即為樣品具有耐藥性，否則測對氨基糖苷類敏感。
[0036] 本發(fā)明的再一個方面是提供了一種非診斷和治療目的的檢測嗜水氣單胞菌氨基 糖苷類耐藥性的方法，將樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括如下步驟：
[0037] (a)PCR反應(yīng)液的制備：從_20°C冰箱中取出試劑盒的各組分，室溫融化，放冰盒上 備用。加樣前10分鐘內(nèi)，按檢測樣本數(shù)（η)配置PCR反應(yīng)液XμL;
[0038] (b)X= (9μLPCR反應(yīng)液+4μL引物組合物混合液+5μLddH20)X(樣本數(shù)η+1 份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照）；
[0039] 振蕩混勻后，3000rpm離心10s，按每份18uL分裝到0. 2mLPCR反應(yīng)管中備用；
[0040] (c)加樣：向分裝好試劑的反應(yīng)管中，分別加入細(xì)菌樣本DNA模板2yL，陽性對照 孔加入2μL陽性對照品，陰性對照孔加入2μL陰性對照品，空白對照孔加入2μLddH20,加 樣過程要求冰上操作，3000rpm離心10s，放入PCR儀進(jìn)樣槽；
[0041] (d)PCR擴(kuò)增：進(jìn)行嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測，反應(yīng)條件如下：94°C 預(yù)變性3111丨11;941€3〇8,581€3〇8,72 1€3〇8,30個循環(huán)；72°(：1〇111丨11;4°(：1〇111丨11 ;反應(yīng)體積設(shè) 為20μL，設(shè)定后運(yùn)行；
[0042] (e)凝膠電泳檢測：采用常規(guī)方法制備1. 2%瓊脂糖凝膠后放入加有ΤΑΕ緩沖液的 電泳槽中待用；將PCR樣品取出后加入3μL上樣緩沖液后混勻，取5μL樣品加入膠孔中于 90V電壓下電泳30min，電泳完成后取出凝膠置于凝膠成像儀中拍照并記錄結(jié)果；結(jié)果中具 有條帶說明樣品對氨基糖苷類藥物耐藥，不具有條帶則表明對氨基糖苷類藥物敏感；
[0043] 所述引物組合物如上所示。
[0044] 上述嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒在檢測嗜水氣單胞菌氨基糖 苷類耐藥基因中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0045] 有益效果：
[0046] (1)通過在NCBI的嗜水氣單胞菌ATCC7966株基因序列庫中檢索氨基糖苷類耐藥 基因序列并設(shè)計特異性引物，能夠?qū)κ人畾鈫伟鷄ac(6'）_Iz、aph等氨基糖苷類耐藥基 因進(jìn)行快速檢測。
[0047] (2)本發(fā)明所述的引物序列和試劑盒具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、成本低廉等優(yōu)點， 可用于輔助臨床快速診斷嗜水氣單胞菌氨基糖苷類抗生素的耐藥情況，為臨床治療提供參 考依據(jù)。
【附圖說明】
[0048] 圖1為陽性對照品和空白對照品檢測結(jié)果圖，其中，M:DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道 1 :陽性對照品；泳道2 :空白對照品。
[0049] 圖2為陰性對照品檢測結(jié)果圖，其中，M:DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1-5分別以殺鮭 氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、大腸桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。
[0050] 圖3為2例嗜水氣單胞菌氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測結(jié)果圖，其中M:DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1、2分別以2株嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
【具體實施方式】
[0051] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā) 明，不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0052] 實施例1 :合成引物對
[0053] 檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類2種耐藥基因aac(6'）_Iz、aph的核苷酸序列。2 對特異性引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成：
[0054] 擴(kuò)增aac(6'）_Iz耐