基于兩步法pcr的甲烷/氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及是一種可以廣泛應用于各種生態(tài)環(huán)境樣 品中特定功能微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 依賴于培養(yǎng)的實驗方法曾經(jīng)作為傳統(tǒng)微生物學的主要研究手段?？墒黔h(huán)境微生物 樣品通常情況下微生物的種類數(shù)目龐大而每一種的豐度較低，大部分微生物難以摸索培養(yǎng) 條件甚至無法獲得純培養(yǎng)，所以不依賴培養(yǎng)的分子檢測手段已經(jīng)成為研究環(huán)境微生物群落 結(jié)構(gòu)的主流方法，而針對特定基因的PCR并分析序列信息是其中的一種重要手段。常規(guī)實 驗方法是對環(huán)境樣品進行總微生物基因組DNA抽提，之后針對某個基因進行PCR擴增，并通 過測序得到多種類群微生物該基因的序列，然后進行序列分析以獲得環(huán)境中與該基因相關(guān) 的微生物群落結(jié)構(gòu)信息。常用的PCR目的基因包括16SrRNA基因和各種功能基因。
[0003]甲燒氧化細菌（methaneoxidizingbacteria,Μ0Β)和氨氧化細菌（ammonia oxidizingbacteria,Α0Β)作為全球碳循環(huán)/氮循環(huán)過程中的重要微生物，在農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)和環(huán)境保護等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。它們的功能基因，顆粒性甲烷單加氧酶α 亞基（particulatemethanemonooxygenaseA,pmoA)和氨氧化單加氧酶α亞基(ammoniamonooxygenaseA,amoA)是研究這兩種微生物類群的標識基因，而且這兩類基 因是同源的。針對pmoA/amoA這兩種基因的引物有很多，但是除了A189和A682之外，其他 引物都不能同時擴增pmoA/amoA這兩種基因，而引物對A189/A682擴增效率較低，并已被證 實存在嚴重非特異擴增。
[0004] 為了設(shè)計能同時擴增pmoA/amoA這兩種基因的引物，我們需要尋找這兩個基因的 保守區(qū)，并引物序列中加入簡并。常規(guī)引物是某特定的核苷酸序列，而簡并引物則是許多特 定核苷酸序列的混合物。舉例說明，在簡并的符號中R和V各代表A/G或A/C/G，序列ARVC 就是指六種序列（AAAC，AGAC，AACT，AGCT，AAGT，AGGT)的等量混合?？墒且镏幸牒啿⒅?后，必然導致這些引物的混合物中有部分引物是不發(fā)揮作用，而且簡并的程度越大，不發(fā)揮 作用的引物就越多，發(fā)揮作用的引物含量指數(shù)減少；所以簡并程度的增加會使有效引物濃 度缺少，導致PCR擴增效率的下降。因PCR擴增效率的低下，高簡并引物未能在微生物群落 結(jié)構(gòu)研究中應用。
[0005] 本發(fā)明引入一種新的PCR策略，將PCR分為兩步，并在簡并引物的5 '端延伸20堿 基長度的序列，稱之為tag;tag序列本身沒有嚴格限制，但是應注意不能與目的基因匹配。 第一步PCR使用加tag的簡并引物并且其循環(huán)數(shù)較少。由于簡并的存在，引物擴增效率較 低，但是在前幾輪循環(huán)中還是可以擴增少量的目標基因片段，并且擴增出的片段兩端已經(jīng) 加長了tag以及其互補序列對應核苷酸。隨后純化PCR產(chǎn)物，去除引物，僅留下少量擴增得 到的加入了tag的片段，避免剩余引物在第二步擴增過程中的干擾。然后以此為模板，以 tag序列作為引物進行第二步PCR。因第二步PCR引物不含簡并，長度適中，情況和普通的 PCR-樣，所以能把上一輪PCR的產(chǎn)物大量擴增。如果在tag序列5 '端加barcode序列的 話，可根據(jù)barcode序列來區(qū)分不同樣品來源序列，所以可同時通過高通量測序來分析大 量樣品。綜上，這種加tag的簡并引物兩步PCR方法在兼顧擴增效率的前提下提高了引物 覆蓋度。
[0006] 加tag簡并引物的兩步法PCR是對傳統(tǒng)的一步法PCR的改進。加tag的簡并引 物的兩步法PCR也可以應用于其他功能基因相關(guān)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)研究，如硫酸鹽還原 菌，硝化細菌，反硝化細菌，產(chǎn)甲烷菌等對生態(tài)環(huán)境中起重要作用的功能微生物類群；并能 在此過程中發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)過的功能微生物種類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種能準確同時反映環(huán)境樣品中氨氧化或甲烷氧化相關(guān) 細菌的群落結(jié)構(gòu)的分析方法。
[0008] 本發(fā)明提供的關(guān)于微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法，是對環(huán)境樣品抽提DNA后，使用 加tag的簡并引物和tag引物對環(huán)境樣品DNA進行兩步法PCR擴增，并通過測序分析其菌 群組成。具體步驟如下： (1) 設(shè)計能覆蓋大部分氨氧化或甲燒氧化細菌pmoA/amoA相關(guān)基因的高簡并加tag引 物，具體來說： a. 確定檢測的目的基因，查找相關(guān)數(shù)據(jù)，在pmoA/amoA相關(guān)基因的上下游保守區(qū)域設(shè) 計高覆蓋度高簡并引物，使之能覆蓋大多數(shù)相關(guān)的微生物類群； b. 在所設(shè)計上下游引物序列的5'端各連接一段長為15-25個堿基的核苷酸序列，該序 列要避免與樣品DNA結(jié)合，稱之為tag序列； (2) 使用高簡并加tag的引物對環(huán)境樣品DNA進行PCR擴增； (3) 將PCR產(chǎn)物進行純化，去除未參加反應的剩余的引物； (4) 將純化產(chǎn)物作為模板，使用tag序列作為新的引物進行第二步PCR;如果要將多個 樣品同時進行高通量測序分析，可在tag序列5 '端加6-10堿基barcode序列來區(qū)分不同 樣品； (5) 對PCR產(chǎn)物進行相關(guān)的分子生物學分析(包括測序或指紋圖譜分析)，得到該環(huán)境樣 品的基于某特定基因的相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)信息。
[0009] 本發(fā)明中，所設(shè)計的高簡并引物，是從數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)各類微生物的目的功能基 因序列信息，進行比對，并在基因上下游找到對各類微生物相對保守的位點，然后設(shè)計簡并 引物提高覆蓋度。
[0010] 本發(fā)明中，所述tag序列要求與模板DNA不匹配，無其它要求，可以自主設(shè)計，其目 的是為了給第二輪PCR引入引物結(jié)合區(qū)。
[0011] 本發(fā)明中，所述使用高簡并加tag的引物對環(huán)境樣品進行PCR，也就是兩步法PCR 中的第一步PCR，對PCR的體系和程序并沒有特殊要求，循環(huán)數(shù)可以比較少，一般為2-10。經(jīng) 過摸索對大部分環(huán)境樣品適用的循環(huán)數(shù)為10。
[0012] 本發(fā)明中，所述PCR產(chǎn)物進行純化，可以使用PCR體系純化試劑盒，其目的是去除 第一步PCR反應中沒有參加反應的的加tag簡并引物。
[0013] 本發(fā)明中，所述tag序列作為新的引物進行第二輪的PCR，直接使用tag序列作為 普通引物，對PCR體系和程序沒有特殊要求，一般循環(huán)數(shù)為20-40,典型的循環(huán)數(shù)為35。
[0014] 本發(fā)明中，所述對PCR產(chǎn)物進行相關(guān)的分子生物學分析，包括對PCR產(chǎn)物的測序和 序列分析，這些步驟均與常規(guī)的基于PCR擴增的研究微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分子生物 學方法一樣。
[0015] 本發(fā)明使用加tag的簡并引物的兩步法PCR方法，可以顯著提高引物覆蓋度以及 PCR效率，是對常規(guī)的基于PCR擴增的研究Μ0Β/Α0Β相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分子生 物學方法的改進。
[0016] 本方法也可應用于其它功能微生物群落結(jié)構(gòu)分析。
[0017] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點： (1) 本發(fā)明可以顯著提高引物覆蓋度。加入了簡并的引物可以覆蓋更多的微生物類群， 提高保守程度比較低的目的基因的擴增效果，同時由于引物覆蓋度的提高，該方法也具有 發(fā)現(xiàn)新的微生物類群甚至新的功能基因的潛力； (2) 本方法可以保持PCR效率。使用tag作為引物進行的第二步PCR由于引物中不含 簡并，所以PCR效率可以得到保障，對豐度比較低的基因/微生物類群依然可以擴增得到。
【附圖說明】
[0018] 圖1為簡并引物加tag兩步法擴增的原理圖示。
[0019] 圖2為加tag簡并引物的兩步法PCR(純化/未純化）以及常規(guī)的一步法PCR應 用于環(huán)境樣品DNA的電泳照片。左右兩邊泳道為D2000marker，中間的泳道分為3組，自左 起分別為兩步法PCR純化，兩步法PCR不純化和一步法PCR。各組內(nèi)順序左起為A光灘表土 (tidalflat)，B湖泊沉積物（lakesediment)，C水稻田土（paddysoil)，D垃圾填埋場表 土（landfill)以及N陰對照（negativecontrol)。
[0020] 圖3為用質(zhì)?；旌蠘悠窓z驗加tag簡并引物的兩步法PCR保真性結(jié)果。其中，橫 坐標表示混合物中每種質(zhì)粒的濃度，縱坐標表示測序得到的序列數(shù)在混合物中的比例。4種 顏色表示4個混合物，4種形狀表示4種質(zhì)粒。
[0021] 圖4是將加tag簡并引物的兩步法PCR和常規(guī)一步法PCR應用于環(huán)境樣品的細菌 群落結(jié)果比較。分別為對高原土壤（mountainsoil)，稻田土壤（paddysoil)，淡水河沉積 物（riversediment)以及海水（coastalwater)這4種樣品的擴增結(jié)果，柱形的高度對應 該樣品含有的該類型微生物的數(shù)量。
【具體實施方式】
[0022] 使用兩步法PCR對多種環(huán)境樣品進行甲烷氧化相關(guān)微生物多樣性分析。
[0023] 1.設(shè)計第一步PCR的引物，即針對pmoA/amoA相關(guān)基因的高簡并加tag引物（引 物方向5' 一 3'） forward:A189-tag:GCCGGAGCTCTGCAGATATCGGNG