專利名稱：嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的制備方法,及在水產(chǎn)動物上的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物免疫技術(shù)，特別是一種適用于水產(chǎn)動物被動免疫預防和治療的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的制備方法、及它們在水產(chǎn)動物疾病防治上的應用。
背景技術(shù)：
卵黃抗體(IgY)作為新一類藥物和飼料營養(yǎng)添加劑已廣泛應用于預防和治療豬、牛等畜類及雞、鴨、鵝等禽類的細菌或病毒性疾病。研究證明提純卵黃抗體和蛋黃液可凍干保存或噴霧干燥保存，抗體活性不受損失，且耐酸、耐熱及性能穩(wěn)定。多價卵黃抗體無毒副作用，長期使用不會導致病原菌產(chǎn)生耐藥性，是一種應用前景廣泛的、性質(zhì)穩(wěn)定的免疫球蛋白。由于卵黃抗體在一定時間內(nèi)具有耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用，因此能通過經(jīng)口被動免疫途徑，有效地發(fā)揮其免疫學活性或生物學活性(Hatta H)。大部分IgY都是通過在口腔或胃腸道內(nèi)直接作用于病原細菌，阻止細菌對腸道細胞的黏附、侵入而發(fā)揮抗病、保健作用。
水產(chǎn)動物病害防后不同于陸生動物的一個主要區(qū)別是難以通過注射免疫的方式進行防治，卵黃抗體的上述特性有利于將卵黃抗體應用于水產(chǎn)疾病的防治。嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)動物的重要病原菌，胞外產(chǎn)物和外膜蛋白是其主要的致病因子之一，同時也是主要的保護性抗原。研制嗜水氣單胞菌主要的致病因子的卵黃抗體有可能通過阻斷嗜水氣單胞菌在腸道的黏附、侵入，抑制其繁殖，達到抑制嗜水氣單胞菌對動物侵染的作用。但到目前為止，制備卵黃抗體及卵黃抗體在水產(chǎn)疾病的防治上的應用尚處于起步階段，少見實際的報道。中國專利申請申請?zhí)枮?00510060325.X的專利申請?zhí)峁┝艘环N抗嗜水氣單胞菌免疫球蛋白制備技術(shù)，但是該技術(shù)的缺點在于1)所采用的抗原為全菌滅活抗原，抗原顆粒較大、成分復雜，抗原特異性較差，特異性抗體效價較低；2)采用福氏佐劑(FCA)作為免疫佐劑的缺點在于①FCA油能通過肌膜層造成組織損傷，局部形成結(jié)節(jié)和無菌性肉芽腫，損壞肉質(zhì)；②FCA含有分枝桿菌，能使結(jié)核菌素試驗呈陽性反應；③FCA可能有致癌作用；④粘稠，注射比較費力；⑤免疫佐劑福氏佐劑對動物的刺激性和毒副作用偏大，可導致蛋雞的產(chǎn)蛋率明顯下降，也不符合肉用動物的食品安全性要求，故臨床上被禁止使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提供一種制作簡單、成本低廉、穩(wěn)定高效價的、對動物刺激性小的、安全性好的、嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有特異性地針對各種主要保護性抗原的多價卵黃抗體的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體在水產(chǎn)動物疾病防治上的應用。
本發(fā)明提供了一種嗜水氣單胞菌各種主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其由下述方法制得首先從嗜水氣單胞菌中提取主要保護性抗原；將提取的各主要保護性抗原分別制成保護性抗原免疫刺激復合物ISCOMs；將各主要保護性抗原的免疫刺激復物分別對蛋雞進行免疫；取經(jīng)免疫一定時間后的經(jīng)同種保護性抗原免疫刺激復合物免疫的雞蛋取其蛋黃，在蛋黃中加入1-9倍生理鹽水或磷酸緩沖液(PBS)混合均勻，即為卵黃抗體懸液。
將嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原制成卵黃抗體產(chǎn)品，只需少量的主要保護性抗原制成的免疫刺激復合物免疫蛋雞，即可生產(chǎn)出大量的、高效價的卵黃抗體，因此有以下優(yōu)點一是對被免疫的蛋雞刺激性小，不影響產(chǎn)蛋率。二是卵黃抗體產(chǎn)量高，成本低，采收方便、生產(chǎn)效率高于血清抗體，便于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。三是以卵黃抗體阻斷病原微生物嗜水氣單胞菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的侵染效果好，且無公害，無殘留。卵黃抗體只針對特定的抗原，不會影響腸道內(nèi)的正常菌落。四是卵黃是動物飼料的常規(guī)營養(yǎng)添加成分，賦予卵黃防病、保健功能是飼料配方設(shè)計上的一種創(chuàng)新。五是卵黃抗體的防病、保健功能可以根據(jù)臨床需求進行設(shè)計，應用范圍廣。六是與主動免疫制劑相比(如疫苗)，卵黃抗體作用快捷、不存在安全性問題。七是對于免疫系統(tǒng)發(fā)育進化水平較低，以非特異性免疫為主的水產(chǎn)動物，卵黃抗體擁有獨特的優(yōu)勢。八是卵黃抗體制成干粉后性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存。
所述的嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原或為外膜蛋白(MOMP)、或為胞外產(chǎn)物(ECPs)、或為黏附素。
所述的胞外產(chǎn)物(ECPs)的制備方法為28℃ 200r/min搖床24h培養(yǎng)復蘇嗜水氣單胞菌，以1％的量接種于TSB培養(yǎng)液，200r/min 28℃培養(yǎng)約36h。10000r/min 4℃離心20min，取上清，0.45μm濾膜過濾，70％飽和硫酸銨沉淀，隔夜靜置，離心收集，沉淀用0.02mol/L Tris(PH7.5)重懸，4℃，對500mlTris緩沖液透析，每6小時更換液體1次，共三次，Bradford法測蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 所述的外膜蛋白(MOMP)的制備方法為接種細菌于含1％氯化鈉的TSB培養(yǎng)基中，30℃ 150r/min搖床約24h，10 000r/min，0.02mol/L Tris-HCL(pH7.5)洗滌3次，重懸于約10mL上述緩沖液中，200W超聲波破碎共約6min，7000r/min4℃，10min收集上清，添加N-十二烷基肌氨酸鈉(N-lauroylsarcosine sodium salt)使其終濃度為1.2％(W/V)，混勻，4℃，隔夜靜置。40 000r/min 4℃ 40min，下層沉淀即為主要外膜蛋白，蒸餾水重懸Bradford法測定蛋白濃度，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 所述的黏附素制備方法同外膜蛋白，或用基因工程技術(shù)表達的嗜水氣單胞菌粘附素(方法略)。
將嗜水氣單胞菌中的各主要保護性抗原制成疫刺激復合物ISCOMs的方法之一為1.濃縮保護性抗原至2mg/ml；2.用0.25M檸檬酸酸化處理2小時，使其pH降到2.5；3.加入Mega-10至終濃度為2％，37℃，作用4小時；4.加入Quil A至終濃度為0.05％～0.1％，然后加入膽固醇(事先用氯仿溶解)、卵磷脂至終濃度為125ug/ml；5.冰浴超聲波處理8～10mins，真空負壓去氯仿；6.用0.01M檸檬酸處理透析4h；7.用0.01M PBS(pH 7.2)透析72小時，每4小時換液一次，經(jīng)透析過的反應液即為保護性抗原ISCOMs。-20℃保存。
嗜水氣單胞菌各保護性抗原制成的免疫刺激復合物的鑒定方法、以胞外產(chǎn)物、外膜蛋白與黏附素三種制成的免疫刺激復合物為例胞外產(chǎn)物免疫刺激復合物、外膜蛋白和黏附素免疫刺激復合物的觀察與鑒定取三者的樣品10ul滴銅網(wǎng)，用2％磷鎢酸鈉染色，在JEM-120EX電鏡上觀察鑒定，胞外產(chǎn)物免疫刺激復合物、外膜蛋白免疫刺激復合物和黏附素免疫刺激復合物應為典型的籠格狀結(jié)構(gòu)，大小約為40nm(見圖1)。
將主要保護性抗原制成的免疫刺激復合物分別對蛋雞進行免疫的具體步驟可為對蛋雞進行免疫的方法為將各保護性抗原免疫刺激復合物對蛋雞進行一次或一次以上的免疫，每次的免疫劑量為30μg-60μg/只雞，兩次免疫之間的間隔為15天左右，收集最后一次免疫過后15-75天蛋雞所生的雞蛋。
所述的各保護性抗原免疫刺激復合物免疫蛋雞的最佳方法為采用對蛋雞進行三次免疫的方法進行第一次免疫劑量30μg-60μg/只雞，第一次免疫后15天進行第二次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞；第二次免疫后15天進行第三次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞，第三次免疫后第15天后開始連續(xù)60天收集雞蛋。
所述的從雞蛋中提取蛋黃的做法為對雞蛋外殼進行消毒后，再取蛋黃使用。
將雞蛋外殼消毒后、再取蛋黃可防止蛋殼上粘附的細菌污染蛋黃產(chǎn)品。
對雞蛋外殼進行消毒的方法有很多，它或者是用碘酒消毒雞蛋外殼后再取蛋黃、或者用1ppm易克林(10％雙鏈氯化聚胺鹽)或其他表面消毒劑消毒外殼后再取蛋黃。
一種含有嗜水氣單胞菌各種主要保護性抗原的多價卵黃抗體的制備方法，是按上述的方法制備出的各主要保護性抗原ISCOMs、將其分別對蛋雞進行免疫，分別取蛋黃，在所取的所有蛋黃中加1-9倍滅菌生理鹽水或磷酸緩沖液(PBS)制成懸液，將二種或二種以上卵黃抗體懸液等比例混合液即為嗜水氣單胞菌的主要保護性抗原多價卵黃抗體。
為表明本發(fā)明制備方法的先進性和良好效果，本發(fā)明對采用本方法制備的嗜水氣單胞菌主要保護性抗原卵黃抗體進行了效價測定及特異性測定。
對上述所制備的嗜水氣單胞菌主要保護性抗原卵黃抗體的效價進行如下測定1.上述所制備的卵黃抗體ELISA效價的測定將嗜水氣單胞菌的胞外產(chǎn)物、外膜蛋白和黏附素分別按10μg·mL-1蛋白質(zhì)濃度的量包被酶標板，每孔50μL，4℃過夜。甩干孔內(nèi)溶液，用含2％BSA的PBS-T溶液室溫封閉1小時，洗滌后加入待檢卵黃抗體樣品(從1∶20開始作倍比稀釋)，每孔50μL，室溫反應1小時，PBS-T洗滌3次，然后加入1∶20000稀釋的羊抗雞HRP標記抗體，每孔50μL，室溫反應1h，同上洗滌3次，用蒸餾水沖洗1次，最后加入50μL的底物OPD，室溫顯色15min，用2mol·L-1H2SO4終止反應。用酶聯(lián)儀在495nm處讀取OD值。抗體陽性判定標準為P/N≥2.1(即陽性孔/陰性對照孔比值≥2.1)。
2.采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western-blot)進行特異性測定采用不連續(xù)垂直凝膠電泳，3％濃縮膠，12％分離膠。蛋白質(zhì)采用考馬斯亮蘭R-250染色觀察、分析所提取的嗜水氣單胞菌的各蛋白質(zhì)組分。
免疫印跡上述菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE)電泳分離后的不經(jīng)考馬斯亮蘭R-250染色直接將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，取轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜，放置于3％BSA的PBAT緩沖液中，室溫緩慢振蕩封閉1小時，用PBAT洗滌3次，每次3分鐘后，加入1∶100稀釋卵黃抗體(一抗)，室溫緩慢振蕩1小時，用PBAT洗滌3次，每次3分鐘，然后加入1∶20000稀釋的HRP酶標記的羊抗雞血清IgG(二抗)，室溫緩慢振蕩1小時，用PBAT洗滌3次，每次3分鐘，用無菌水洗滌1次，最后加沉淀型底物DAB(Sigma)進行顯色。
凝膠電泳用未預覽蛋白標準M1(97kD，66kD，43kD，31kD，20.1kD，14.4kD)(華美)，印跡試驗采用預覽蛋白標準M2(175KD，83kD，62kD，48kD，33kD，25kD，17kD，7kD)(紐英倫生物技術(shù)公司)。
嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體在水產(chǎn)動物疾病防治上的應用。
下面以實驗為例，說明嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體在水產(chǎn)疾病防治動物上的應用。
飼喂多價卵黃抗體后動物的攻毒保護試驗1.小鼠的攻毒保護試驗試驗小鼠為昆明鼠，購自福建醫(yī)科大學實驗動物養(yǎng)殖場，規(guī)格20g/只。攻毒分試驗組和對照組兩組進行，每組13只小鼠。試驗組每天下午3點-6點用含10％多價卵黃抗體混合液的自來水給小鼠飲用，連喂12天。對照組飲用正常自來水。第13天試驗組和對照組小鼠各取2只采血，其余每只由腹腔注射5×107CFU的嗜水氣單胞菌(ZN1株)，每天觀察2次，連續(xù)7天，計算小鼠存活率。結(jié)果顯示，經(jīng)過多價卵黃抗體投喂的昆明鼠存活率為72.7％，而未投喂卵黃抗體的昆明鼠存活率僅27.3％。
表1實驗組和對照組小鼠攻毒后的存活率

2.鰻鱺的攻毒保護試驗實驗歐洲鰻鱺購自福建省長樂某鰻鱺養(yǎng)殖場，規(guī)格80g/尾。攻毒分試驗組和對照組兩組，每組10尾鰻魚。鰻鱺在實驗室40L水族箱中養(yǎng)殖，溫度22-25℃左右，每日換水1/3。試驗組每天上午和下午各飼喂含10％多價卵黃抗體混合液的黑子料，日投喂量為鰻魚體重的0.8-1.0％，連喂15天。對照組正常用自來水拌料投喂。投喂后第13天試驗組和對照組各取1尾鰻魚采集血清，其余的鰻魚每尾由腹腔注射1×108CFU的嗜水氣單胞菌(ZN1株)，每天觀察2次，連續(xù)2周，計算鰻魚存活率。結(jié)果顯示，經(jīng)過卵黃抗體投喂的鰻魚存活率為77.8％，而未投喂卵黃抗體的鰻鱺存活率僅44.4％。顯示卵黃抗體投喂組的歐鰻對嗜水氣單胞菌攻毒的抗性明顯增強。
表2實驗組和對照組鰻鱺攻毒后的存活率

由此可見，依據(jù)本方法制備的外膜蛋白卵黃抗體及胞外產(chǎn)物卵黃抗體經(jīng)飼料添加方式投喂動物，能夠賦予小鼠和鰻鱺抵抗嗜水氣單胞菌的浸染能力。
下面將對以外膜蛋白和胞外產(chǎn)物為抗原分別制成的卵黃抗體進行效價和特異性分析、并將兩者混合制成的多價卵黃抗體的抗病原理進行細致的闡述。
當將嗜水氣單胞菌的外膜蛋白(MOMP)、胞外產(chǎn)物(ECPs)或黏附素抗原免疫刺激復合物免疫蛋雞，第三次免疫后的15天起，每7天測一次，連續(xù)60天檢測卵黃抗體ELISA效價，同時用大腸桿菌菌毛蛋白制備的卵黃抗體作對照。
ELISA分析顯示，在第三次免疫后的15-60天內(nèi)所制備的嗜水氣單胞菌MOMP、ECPs及大腸桿菌菌毛蛋白卵黃抗體，對各自相應的免疫抗原反應滴度均達到1∶10280以上，見表3。其中嗜水氣單胞菌主要保護性抗原的卵黃抗體和大腸桿菌菌毛蛋白卵黃抗體能與嗜水氣單胞菌MOMP抗原發(fā)生反應，表明所制備的嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體可識別外膜蛋白的特定抗原成分，同時提示嗜水氣單胞菌的MOMP和大腸桿菌菌毛蛋白在抗原結(jié)構(gòu)上存在相似的抗原決定簇。
嗜水氣單胞菌ECPs卵黃抗體對ECPs的ELISA效價為1∶2560，低于該卵黃抗體對MOMP抗原的效價，嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體與ECPs抗原有弱交叉反應，由此推測ECPs抗原中也存在MOMP的成分，而且這些MOMP成分雖然含量不多，但抗原性較強；大腸桿菌菌毛卵黃抗體與嗜水氣單胞菌ECPs抗原不發(fā)生反應，推測ECPs抗原與大腸桿菌菌毛抗原不存在共同抗原決定簇，或共同抗原決定簇含量稀少，或ECPs抗原中含有的MOMP組分很少，見表3。
與嗜水氣單胞菌MOMP、ECPs和黏附素卵黃抗體在制備中用生理鹽水等量稀釋不同的是，卵黃抗體混合物在制備過程中，由于將2種卵黃抗體先混合和后再加等量生理鹽水的稀釋，因此單種成分的ELISA效價減半(表3)。這一結(jié)果也說明兩種方法都能有效制備卵黃抗體。卵黃抗體混合物制備過程簡單，在效價不變的同時保留了卵黃營養(yǎng)物質(zhì)，適合作為動物營養(yǎng)添加劑。
表3MOMP、ECP卵黃抗體抗體效價測定

免疫印跡(Western-blot)結(jié)果顯示，外膜蛋白(MOMP)卵黃抗體對7株不同血清型的嗜水氣單胞菌的外膜蛋白和黏附素特異條帶均能結(jié)合，說明所制備的卵黃抗體對不同血清型的嗜水氣單胞菌均具有廣譜性的抗原抗體反應特性(圖2)。
同時本發(fā)明制備的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原免疫刺激復合物具有如下優(yōu)點本實驗室通過對4種嗜水氣單胞菌菌株ACTT10501、L316、TPS30、WC-2的外膜蛋白(MOMP)制成的嗜水氣單胞菌外膜蛋白ISCOMs免疫復合物，分別對鰻魚進行免疫，免疫后40天對鰻魚進行嗜水氣單胞菌TPS30攻毒，結(jié)果顯示，經(jīng)嗜水氣單胞菌MOMP-ISCOMs免疫的鰻魚對嗜水氣單胞菌攻毒的保護率分別達到80％-100％，而未免疫的鰻魚保護率為0(董傳甫等，2005)。
嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物(ECPs)對鰻魚的免疫保護試驗也取得相似結(jié)果。方勤美等(2004)將嗜水氣單胞菌菌株TPS30的胞外產(chǎn)物(ECPs)制成的嗜水氣單胞菌ECPs-ISCOMs，分一次免疫組和二次免疫組對鰻魚進行免疫。于一次免疫后45天，或二次免疫后15，用嗜水氣單胞菌TPS30對免疫魚進行攻毒，結(jié)果顯示，一次免疫后保護率經(jīng)達到87.5％，二次免疫后保護率經(jīng)達到100％，而未免疫鰻魚攻毒后保護率為0。
但外膜蛋白、胞外產(chǎn)物或黏附素直接制成免疫制劑進行免疫存在以下幾個缺點1)需要提取大量胞外產(chǎn)物、外膜蛋白，大量制備免疫刺激復合物技術(shù)要求高、成本大；2)對水產(chǎn)動物進行注射免疫操作難度大，實用性差；直接免疫產(chǎn)生效應時間需二周以上。


圖1是免疫刺激復合物的電鏡觀察2是嗜水氣單胞菌外膜蛋白卵黃抗體對7種不同血清型的嗜水氣單胞菌MOMP的Western-blot染色結(jié)果。
具體實施例方式
實施例一
一種制備嗜水氣單胞菌外膜蛋白保護性抗原單價卵黃抗體的方法，首先從所述的嗜水氣單胞菌中獲得保護性抗原—外膜蛋白，所述的外膜蛋白為由下述方法制得接種細菌于含1％氯化鈉的TSB培養(yǎng)基中，30℃150r/min搖床約24h，10000r/min，0.02mol/L Tris-HCL(pH7.5)洗滌3次，重懸于約10mL上述緩沖液中，200W超聲波破碎共約6min，7000r/min 4℃，10min收集上清，添加N-十二烷基肌氨酸鈉(N-lauroylsarcosine sodium salt)使其終濃度為1.2％(W/V)，混勻，4℃，隔夜靜置。40 000r/min 4℃ 40min，下層沉淀即為主要外膜蛋白，蒸餾水重懸Bradford法測定蛋白濃度，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。接著將所獲得的主要外膜蛋白制成免疫刺激復合物ISCOMs，制成免疫刺激復合物的方法為1.濃縮保護性抗原至2mg/ml；2.用0.25M檸檬酸酸化處理2小時，使其pH降到2.5；3.加入Mega-10至終濃度為2％，37℃裂解4小時；4.加入Quil A至終濃度為0.05％～0.1％，然后加入膽固醇(事先用氯仿溶解)、卵磷脂至終濃度為125ug/ml；5.冰浴超聲波處理8～10mins，真空負壓去氯仿；6.用0.01M檸檬酸處理透析4h；7.用0.01M PBS(pH 7.2)透析72小時，每4小時換液一次，經(jīng)透析過的反應液即為外膜蛋白免疫刺激復合物ISCOMs，將其冷凍保存。
再將外膜蛋白免疫刺激復合物對蛋雞進行免疫，免疫為采用一次的免疫，取免疫一定時間后的蛋雞的雞蛋蛋黃(通常為15天以上)，在蛋黃中加入3倍左右的生理鹽水混合均勻，即為嗜水氣單胞菌的主要保護性抗原卵黃抗體。所述的卵黃抗體冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 本實施例未述部分與現(xiàn)有技術(shù)相同。
實施例二本實施例其余步驟與方法與實施例一相同，只是其中的將所獲得的主要外膜蛋白免疫刺激復合物免疫蛋雞的方法改為三次免疫進行，其具體方法為第一次免疫劑量30μg-60μg/只雞，第一次免疫后15天進行第二次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞；第二次免疫后15天進行第三次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞，第三次免疫后第15天后開始連續(xù)60天收集雞蛋。而從雞蛋中提取蛋黃的方法為用碘酒消毒雞蛋外殼后再取蛋黃。
實施例三本實施例的其余步驟與實施例二相同，只是其中提取蛋黃的方法為采用10％雙鏈氯化聚胺鹽對雞蛋外殼消毒后再取蛋黃。
實施例四本實施例的步驟與方法與實施例一相同，只是將其中的生理鹽水改為磷酸緩沖液。
實施例五本實施例與實施例一的方法與步驟基本相同，只是將其中的外膜蛋白改為胞外產(chǎn)物，一種制備嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物保護性抗原單價卵黃抗體的方法，首先從嗜水氣單胞菌中獲得胞外產(chǎn)物，其方法采用常規(guī)的方法進行，具體為28℃200r/min搖床24h培養(yǎng)復蘇嗜水氣單胞菌，以1％的量接種于TSB培養(yǎng)液，200r/min 28℃培養(yǎng)約36h。10000r/min 4℃離心20min，取上清，0.45μm濾膜過濾，70％飽和硫酸銨沉淀，隔夜靜置，離心收集，沉淀用0.02mol/L·Tris(PH7.5)重懸，4℃對Tris緩沖液充分透析，Bradford法測蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。將所獲得的胞外產(chǎn)物按照實施例一的方法制得嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物卵黃抗體。
本實施例未述部分與實施例一相同。
實施例六本實施例與實施例一的方法與步驟基本相同，只是將其中的外膜蛋白改為黏附素，一種制備嗜水氣單胞菌黏附素保護性抗原單價卵黃抗體的方法，將所獲得的黏附素按照實施例一的方法制得嗜水氣單胞菌黏附素卵黃抗體。
實施例七一種制備嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原多價卵黃抗體的制備方法，其中的主要保護性抗原為外膜蛋白、胞外產(chǎn)物和黏附素，三者先按上述實施例中的方法分別制成免疫刺激復合物后，對蛋雞進行免疫，將所獲得的雞蛋分別取蛋黃后，混合再加入3倍的生理鹽水進行混合，即為嗜水氣單胞菌主要保護性抗原卵黃抗體混合物。
實施例八將實施例七所獲得的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原多價卵黃抗體應用于鰻魚及其他魚類的防治。將制備的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原卵黃抗體混合物按3％的比例添加入鰻魚飼料，混合后投喂，15天為一療程。也可作為鰻魚飼料添加劑長期服用。其使用方法可參照普通的鰻魚飼料添加劑的方法使用。
實施例九其與實施例八基本相同，只是將其中的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原多價卵黃抗體改為單價的卵黃抗體。
權(quán)利要求
1.一種嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其由下述方法制得首先從嗜水氣單胞菌中提取主要保護性抗原；將提取的各主要保護性抗原分別制成保護性抗原免疫刺激復合物ISCOMs；將各主要保護性抗原的免疫刺激復物分別對蛋雞進行免疫；取經(jīng)免疫一定時間后的經(jīng)同種保護性抗原免疫刺激復合物免疫的雞蛋取其蛋黃，在蛋黃中加入1-9倍生理鹽水或磷酸緩沖液(PBS)混合均勻，即為卵黃抗體懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述的嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原或為外膜蛋白、或為胞外產(chǎn)物、或為黏附素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其特征在于將各保護性抗原免疫刺激復合物對蛋雞進行一次或一次以上的免疫，每次的免疫劑量為30μg-60μg/只雞，兩次免疫之間的間隔為15天左右，收集最后一次免疫過后15-75天蛋雞所生的雞蛋。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其特征在于對蛋雞進行三次的免疫，第一次免疫劑量30μg-60μg/只雞，第一次免疫后15天進行第二次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞；第二次免疫后15天進行第三次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞，第三次免疫后第15天后開始連續(xù)60天收集雞蛋。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其特征在于從雞蛋中提取蛋黃的方法為對雞蛋外殼進行消毒后，再取蛋黃使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的制備方法，其特征在于用碘酒消毒雞蛋外殼后再取蛋黃、或者用1ppm易克林。
7.一種含有嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原的多價卵黃抗體的制備方法，是按權(quán)利要求1所述的方法制備出各主要保護性抗原ISCOMs、再將其分別對蛋雞進行免疫，分別取蛋黃，在所取的所有蛋黃中加1-9倍生理鹽水或磷酸緩沖液(PBS)制成懸液，將二種或二種以上卵黃抗體懸液等比例混合液即為嗜水氣單胞菌的主要保護性抗原多價卵黃抗體。
8.一種如權(quán)利要求1或7所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價或多價卵黃抗體在水產(chǎn)動物疾病防治上的應用。
9.一種如權(quán)利要求1或7所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價或多價卵黃抗體作為水產(chǎn)動物飼料添加劑的應用。
10.一種如權(quán)利要求8所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、或多價卵黃抗體在鰻鱺疾病防治上的應用。
11.一種如權(quán)利要求9所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、或多價卵黃抗體作為鰻鱺飼料添加劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的制備方法，及在水產(chǎn)動物疾病防治上的應用。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過將嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原制成卵黃抗體產(chǎn)品。只需少量的保護性抗原制成的免疫刺激復合物免疫蛋雞，即可生產(chǎn)出大量的、高效價的卵黃抗體，所生產(chǎn)的卵黃抗體阻斷病原微生物嗜水氣單胞菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的侵染效果好，且無公害，無殘留。卵黃抗體只針對特定的抗原，不會影響腸道內(nèi)的正常菌落。卵黃是動物飼料的常規(guī)營養(yǎng)添加成分，賦予卵黃防病、保健功能是飼料配方的一種創(chuàng)新，其作用快捷、不存在安全性問題。對于免疫系統(tǒng)發(fā)育進化水平較低，以非特異性免疫為主的水產(chǎn)動物，卵黃抗體擁有獨特的優(yōu)勢。
文檔編號A61P31/04GK101074260SQ20071000872
公開日2007年11月21日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者林天龍, 宋鐵英, 俞伏松, 曾麗莉 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所, 林天龍, 宋鐵英, 俞伏松, 曾麗莉