專利名稱：抗黑腐病花椰菜品種早期篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的分子標(biāo)記輔助早期篩查抗黑腐病花椰菜新品種的試劑盒及其利 用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
花椰菜黑腐病是由黃單胞桿菌屬甘藍(lán)黑腐黃單胞菌甘藍(lán)黑腐致病變種[ZaW/jo/m)w^ ca/ ^e欲!;ypv. cflw; e欲W Pam.) Dowson]侵入所致，屬于世界性的重要細(xì)菌性病害?；ㄒ撕?腐病主要危害葉片或花球。幼苗受害時(shí)，子葉染病呈水漬狀，逐漸變褐枯死；真葉染病，病菌 由水孔侵入的引起葉緣發(fā)病，呈V字形病斑。成株期發(fā)病，病菌從葉緣水孔和傷口侵入，除葉 緣形成向內(nèi)擴(kuò)展的V字形枯斑外，病菌沿葉脈向下擴(kuò)展,形成較大壞死區(qū)或不規(guī)則黃褐色大 斑，病斑邊緣葉片組織淡黃色。該病流行時(shí)，葉緣多處受侵，造成外葉局部或全部腐爛，使葉 片失去管和作用功能。病斑干枯或形成穿孔后，病菌進(jìn)入莖部維管束后，在莖部逐漸蔓延，可 及葉柄與葉脈處，引起植株萎蔫?；ㄇ蚴芎r(shí)，病菌先從花梗侵入，顏色變成灰黑色，并逐漸 蔓延到花球，呈灰黑色干腐狀。最后植株全部死亡。
近年來，菜田復(fù)種指數(shù)普遍提高，加之生態(tài)條件改變和境外大量引種及廣泛種植,又隨著 連作年限時(shí)間的延長(zhǎng)，花椰菜黑腐病植株發(fā)病率越來越高，危害日趨嚴(yán)重，且黑腐病危害期長(zhǎng)， 在花椰菜的整個(gè)生長(zhǎng)期均可發(fā)生，該病大流行使蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降，給生產(chǎn)造成巨 大損失。嚴(yán)重年份發(fā)病率高達(dá)60% 80%,直接影響花椰菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，給花椰菜的生產(chǎn)造 成極大危害和經(jīng)濟(jì)損失。
我國(guó)十分重視花椰菜的抗黑腐病育種，通過常規(guī)育種，與抗病品種雜交和多代自交，選 育出一批具有高抗和中抗的花椰菜品種，在生產(chǎn)上發(fā)揮了重要的作用，但由于選育周期較長(zhǎng)， 而且還消耗了大量的土地、人力和物力，所篩選出的品種遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上的需要。因此， 依托生物技術(shù)，充分利用DNA分子標(biāo)記遺傳穩(wěn)定性高，不受取材部位、時(shí)間、發(fā)育時(shí)期和環(huán) 境的影響，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少的優(yōu)勢(shì)，建立能在苗期就可對(duì)花椰菜抗、感黑腐病性狀進(jìn)行大 規(guī)模篩查的方法，對(duì)抗黑腐病花椰菜新品種的選育具有重要意義。
有關(guān)花椰菜黑腐病的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少，利用分子標(biāo)記輔助花椰菜進(jìn)行抗病育種方面 的研究未見報(bào)道。利用特異分子標(biāo)記進(jìn)行早期篩選的關(guān)鍵是篩選到與抗病相關(guān)的特異標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服常規(guī)抗黑腐病花椰菜選種技術(shù)的不足，提供一種快速、早期、大規(guī) 模篩選抗黑腐病花椰菜新品種或單株的試劑盒及其利用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法。
3本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
抗黑腐病花椰菜品種早期篩査試劑盒，它是由特異引物1 : TACTGGTGGCTGTAGATTATGT和特異引物2: AATGGCAAGGGTTCAAGGGTAGG; dNTP、 Taq聚合酶、PCR緩沖液、DNA模板、無菌去離子水、6x上樣緩沖液及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker組 成。
一種使用上述試劑盒在苗期對(duì)抗黑腐病花椰菜品種進(jìn)行篩査的方法，它包括如下步驟 (l)一步法提取花椰菜基因組DNA; (2)基因組DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(3) PCR擴(kuò)增在PCR擴(kuò)增專用的薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP、特異引物l、特 異引物2、花椰菜基因組DNA、 Taq聚合酶、無菌水補(bǔ)至25微升，將裝有上述液體的PCR 專用薄壁離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件為94'C變性180秒，后進(jìn)行94。C變性30秒， 52'C退火45秒，72'C延伸120秒的擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為35個(gè)，最后在72'C延伸480秒，擴(kuò) 增完成。(4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配置1.2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入 溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴(kuò)增產(chǎn)物及5微升標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker中分別加入1微升6x 上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點(diǎn) 樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長(zhǎng)265nm)或 在凝膠成像儀器上進(jìn)行觀察；(5)依照標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產(chǎn)物 的遷移位置判斷未知花椰菜抗、感黑腐病情況。
利用該技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果與田間的吻合率達(dá)％%，而且具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，不受生長(zhǎng) 季節(jié)、環(huán)境條件等影響的特點(diǎn)，再定苗移栽前即可檢測(cè)，節(jié)省了大量土地、人力和物力，縮 短了選種的時(shí)間，在花椰菜抗病育種上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖l是花椰菜已知抗、感黑腐病的電泳檢測(cè)結(jié)果 圖2是未知抗病性花椰菜田間隨機(jī)檢測(cè)的電泳檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明 實(shí)施例1
利用已知抗黑腐病和感黑腐病花椰菜植株進(jìn)行檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)提取抗、感黑腐病花椰菜基因組DNA: 取幼嫩花椰菜葉片100mg，用剪刀將其剪碎 置于組織研磨器中，加入100pL提取緩沖溶液(1%SDS， 10mmol/L Tris,0.3mol/L EDTA，l%PVPP,pH8.0)，充分研磨成勻漿，然后加入400pL提取緩沖溶液，混勻后置9(TC水 浴中溫育20分鐘，期間要不時(shí)的顛倒搖勻，取出后置于冰浴中5分鐘，4'C保存?zhèn)溆谩?2)DNA濃度的測(cè)定可采用兩種方法進(jìn)行， 一是利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量，二是利用自制的已
知標(biāo)準(zhǔn)的凝膠平板測(cè)量， 一般的濃度要求在200ng以上/pL即可。(3) PCR擴(kuò)增在PCR 擴(kuò)增專用的薄壁離心管中加入10xPCR緩沖溶液2.5pL、 10mmol/LdNTP0.5nL 、 10^irnol/L 特異引物1和2各lpL、花椰菜基因組DNA400ng、 T叫聚合酶2單位、無菌水補(bǔ)至25pL， 將裝有上述液體的PCR專用薄壁離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件為94'C變性180秒， 后進(jìn)行94'C變性30秒，52'C退火45秒，72'C延伸120秒的擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為35個(gè)，最 后在72。C延伸480秒，擴(kuò)增完成。(4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配置1.2%的 瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴(kuò)增產(chǎn)物及5微升標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性 Marker中分別加入1微升6x上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE 電泳液的瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外 燈下(紫外波長(zhǎng)265nm)或在凝膠成像儀器上進(jìn)行觀察；(5)依照標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker帶在凝膠 上的遷移位置和PCR產(chǎn)物的遷移位置判斷花椰菜抗、感黑腐病情況。如圖1所示泳道1.-10 為已知抗黑腐病的花椰菜植株；11-20是己知感病的花椰菜植株，21為試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng) 性Marker為1700bp，圖2是田間隨機(jī)取材檢測(cè)的結(jié)果，隨機(jī)取樣的單株隨后進(jìn)行大田抗黑 腐病性狀觀察大田觀察結(jié)果證實(shí)，有1700bp帶的是抗黑腐病的花椰菜植株，無1700bp帶 的是感病的花椰菜植株。
權(quán)利要求
1. 抗黑腐病花椰菜品種早期篩查試劑盒，其特征在于它由特異引物1、特異引物2、dNTP、Taq聚合酶、PCR緩沖液、DNA模板、無菌去離子水、6×上樣緩沖液及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker組成。
2. —種使用權(quán)利要求1的在苗期對(duì)抗黑腐病花椰菜品種進(jìn)行篩査的方法，其特征是它包括如下步驟(1) 一步法提取花椰菜基因組DNA; (2)基因組DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(3) PCR擴(kuò)增在PCR擴(kuò)增專用的薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP、特異引物l、特 異引物2、花椰菜基因組DNA、 Taq聚合酶、無菌水補(bǔ)至25微升，將裝有上述液體的PCR 專用薄壁離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件為94'C變性180秒，后進(jìn)行94'C變性30秒， 52。C退火45秒，72X:延伸120秒的擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為35個(gè)，最后在72'C延伸480秒，擴(kuò) 增完成。(4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配置1.2°/。的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入 溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴(kuò)增產(chǎn)物及5微升標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker中分別加入1微升6x 上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點(diǎn) 樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長(zhǎng)265nm) 或在凝膠成像儀器上進(jìn)行觀察；(5)依照標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker條帶在凝膠上的遷移位置和PCR 產(chǎn)物的遷移位置判斷未知花椰菜抗、感黑腐病情況。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)對(duì)花椰菜抗黑腐病新品種進(jìn)行早期篩查的試劑盒和使用該試劑盒的檢測(cè)方法。試劑盒由dNTP、Taq聚合酶、PCR緩沖液、DNA模板、無菌去離子水、6×上樣緩沖液及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker組成。檢測(cè)方法包括以下步驟(1)花椰菜基因組DNA的一步法提取；(2)基因組DNA提取結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(3)PCR擴(kuò)增；(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)；(5)結(jié)果判讀依照標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產(chǎn)物的遷移位置判斷未知花椰菜抗、感黑腐病情況。利用該試劑盒篩查鑒定抗黑腐病花椰菜新品種或株系的結(jié)果與田間抗病性狀吻和率達(dá)96％以上。該試劑盒檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，不受生長(zhǎng)季節(jié)、環(huán)境條件等因素的影響，且可在苗期就能完成篩查、鑒定，節(jié)省了大量土地、人力、物力，并大大縮短了選種時(shí)間，在花椰菜抗黑腐病育種上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101423868SQ20081015401
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者瑜 古, 孫德嶺, 宋文芹, 王春國(guó), 擘 郝, 陳成彬 申請(qǐng)人:南開大學(xué)