專利名稱：：水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調(diào)節(jié)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調(diào)節(jié)基因，屬農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，專用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種和防治植物病蟲害。水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)包括兩個致病變種水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，簡稱Xoo)和水稻細(xì)條斑病菌(Xanthomonasoryzaepvoryzicola，簡稱Xooc)。水稻黃單胞菌hrp(hypersensitiveresponseonnonhostplantsandpathogenicityonhostplants)基因決定該種病原細(xì)菌在非寄主植物(如煙草)上激發(fā)過敏反應(yīng)(hypersensitiveresponse，HR)和在寄主植物水稻(如汕優(yōu)63)上的致病性(pathogenicity)。水稻黃單胞菌hrp基因成簇(cluster)排列，hrp基因簇調(diào)節(jié)基因位于hrp基因簇之外。水稻黃單胞菌hrp基因或其調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，則都會改變兩致病變種激發(fā)非寄主產(chǎn)生HR和在寄主水稻上具致病性的能力。水稻黃單胞菌既有其致病性，又有其誘導(dǎo)抗病性。水稻黃單胞菌hrp基因可激發(fā)非寄主植物產(chǎn)生HR和決定其對寄主水稻的致病性。HR是一種抗病表型。國外已對Erwiniaamylovora、Pseudomonassyringae、Ralstoriasolanacearum和Xanthomonascaampestris中的hrp基因以及以據(jù)其進(jìn)行的可能上述研究領(lǐng)域和應(yīng)用開發(fā)領(lǐng)域進(jìn)行了專利保護(hù)，國內(nèi)仍未見水稻黃單胞菌中hrp基因克隆和hrp基因的報道。本發(fā)明的目的是提供水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調(diào)節(jié)基因，用于克隆水稻黃單胞菌或其它植物病原細(xì)菌hrp基因和分析水稻黃單胞菌或其它植物病原細(xì)菌hrp基因結(jié)構(gòu)與功能，并為用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種和防治植物病蟲害而構(gòu)建遺傳重組體提供基因資源。本發(fā)明所提供的水稻黃單胞菌(X.oryzae)hrp基因包括1.水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，簡稱Xoo)hrp基因克隆pUHRX245及其亞克隆(1)Xoo的hrp基因克隆pUHRX245是以載體pUFR034+36.8-kbhrp基因片段構(gòu)建而成的。(2)36.8-kbhrp基因片段，經(jīng)EcoRI酶切后構(gòu)建于載體pUFR034上形成4個亞克隆pHRE17、pUHRE13.5、pHRE3.3和pHRE3，分別含17.0、13.5、3.3和3.0-kbDNA片段；經(jīng)KpnI酶切后構(gòu)建形成4個亞克隆pHRK20、pHRK6、pHRK5.8和pHRK3.8，分別含20、6.0、5.8和3.8-kbDNA片段。(3)13.5-kb片段經(jīng)BamHI酶切后構(gòu)建得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6三個亞克隆，所含插入DNA片段分別為2.3、5.2和6.0-kb。(4)6.0-kb片段經(jīng)SacI酶切后構(gòu)建成2個亞克隆pHRS2.7和pHRS3.3，分別含2.7-kb和3.3-kbDNA片段。(5)3.3-kb片段經(jīng)SacI和KpnI雙酶切后構(gòu)建成2個亞克隆pSK1.1和pSK2.2，分別含1.1-kb和2.2-kbDNA片段。2.水稻細(xì)條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，簡稱Xooc)hrp基因克隆pUHRS138及其亞克隆(1)Xoochrp基因克隆pUHR138是以載體pUFR034+39.3-kbhrp基因片段構(gòu)建而成的。(2)39.3-kbhrp基因片段經(jīng)EcoRI酶切后構(gòu)建成3個亞克隆pHRE18.6、pHRE12.3和pHRE8.4，分別含18.6、12.3和8.4-kbDNA片段；經(jīng)EcoRI部分酶切后獲得pE20.7亞克隆，含20.7-kb(12.3+8.4-kb)DNA片段。(1)20.7-kb片段經(jīng)KpnI部分酶切后構(gòu)建成6個亞克隆pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分別含12.3(5.7+6.6-kb)、8.4(5.2+3.2-kb)、6.6、5.7、5.2和3.2-kb片段。(2)6.6-kb片段經(jīng)BamHI和KpnI雙酶切后構(gòu)建成2個亞克隆pBK2.1和pBK4.5，分別含2.1和4.5-kb兩個片段。4.5-kb片段上有3個SacI酶切位點(diǎn)和1個EcoRI酶切位點(diǎn)。本發(fā)明所提供的水稻黃單胞菌hrp基因的調(diào)節(jié)基因包括1.來自Xoohrp基因的調(diào)節(jié)基因hrpXoo，其核苷酸序列為5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’其中，GAGCTSacI酶切位點(diǎn)；AGAGAGAG；核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CCGGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；GGTACCKpnI酶切位點(diǎn)；alpha-helix-turn-alpha-helix；終止密碼子。2.來自Xoochrp基因的調(diào)節(jié)基因hrpXooc，其核苷酸序列為5’AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’其中，GACAGA......ATGCGCC啟動子區(qū)域；GAGCTSacI酶切位點(diǎn)；AGAGAGAG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CCGGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；alpha-helix-turn-alpha-helix；翻譯終止密碼子。3.來自Xoochrp基因的調(diào)節(jié)基因hrpGXooc，其核苷酸序列為3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′其中，AAGG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CGCGCGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；翻譯終止密碼子。本發(fā)明所提供的水稻黃單胞菌hrp基因克隆、亞克隆及其調(diào)節(jié)基因的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于依據(jù)水稻黃單胞菌hrp基因克隆、亞克隆及其調(diào)節(jié)基因，可以對其hrp基因的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析，以揭示水稻黃單胞菌的致病機(jī)制、誘導(dǎo)抗病機(jī)制以及與水稻互作的分子機(jī)制。其實(shí)踐價值表現(xiàn)在對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重大病害減災(zāi)手段的革新上，如依據(jù)本發(fā)明所提供的hrp基因克隆、亞克隆及hrp基因調(diào)節(jié)基因?yàn)榛蛸Y源，構(gòu)建遺傳重組體，如重組防病微生物、轉(zhuǎn)基因植物、定向表達(dá)有機(jī)體等。本發(fā)明所用水稻黃單胞菌Xoo(JXOIII)和Xooc(RS105)為公知公用菌株。圖1.Xooc基因文庫構(gòu)建流程示意2.水稻黃單胞菌基因文庫構(gòu)建所用載體的物理圖譜E.EcoRI，Ss.Sacl，KKpnI，Sm.SmalI，B.BamHI，X.XbaI，S.SalI，P.PstI，Sp.SphI，H.HindIII，Bg.BglII。圖3.水稻白葉枯病菌(Xoo)hrp基因克隆pUHRX245所含36.8-kbhrp基因片段的限制性酶切圖譜圖4.Xoohrp基因克隆pUHRX245的亞克隆及其功能互補(bǔ)作用圖5.Xoo基因文庫構(gòu)建流程示意6.水稻細(xì)條斑病菌(Xooc)hrp基因克隆pUHRS138所含39.3-kbhrp基因片段的限制性酶切圖譜圖7.Xoochrp基因克隆pUHRS138的亞克隆及其功能互補(bǔ)作用實(shí)施例1水稻白葉枯病菌hrp基因克隆、亞克隆和調(diào)節(jié)基因hrpXoo1.水稻白葉枯病菌基因文庫的構(gòu)建構(gòu)建流程圖如圖1。提取Xoo基因組總DNA，經(jīng)EcoRI部分酶切后回收23-48-kb片段，以pUHR034質(zhì)粒(物理圖譜如圖2)為載體，提取pUFR034質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI完全酶切后并去磷酸化。用T4DNA連接酶對去磷酸化的載體pUFR034與經(jīng)EcoRI部分酶切而回收得到的Xoo基因組總DNA23-48kb片段進(jìn)行連接，得到多聯(lián)體DNA。提取溶源菌BHB2688、BHB2690中λ噬菌體蛋白，也稱包裝蛋白。用包裝蛋白包裝多聯(lián)體DNA形成成熟的噬菌體顆粒。噬菌體可容納的最大、最小DNA片段分別為52-kb和38-kb。pUFR034的大小為8.7-kb。因此，以pURF034為載體構(gòu)建的Xoo文庫的外源片段，最大為52-8.7＝43.3(-kb)，最小為38-8.7＝29.3(-kb)。用成熟的噬菌體感染宿主菌S17-1，得到感染子。單菌落感染子(也稱克隆)，其形式為S17-1/pUFR034∷Xoo基因組DNA片段。為便于書寫，以后將根據(jù)含有某種性狀的DNA片段的感染子重新命名，如本實(shí)驗(yàn)例中所得hrp基因表型的克隆，則命名為pUHRX245。提取20個克隆中的質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI完全每切后計算外源插入片段的平均大小。本實(shí)施例中外源DNA片段大小平均為33-kb。根據(jù)公式N＝ln(1-p)/ln(1-f)，其中N為Xoo基因文庫所需的克隆數(shù)，p為某個基因期望出現(xiàn)的概率，f為外源DNA片段平均長度與該物種染色體總長度的比例。以E.coli的染色體長度4×106bp估算Xoo的染色體長度為例。插入片段平均長度為33-kb，若期望其中某個基因出現(xiàn)的概率為99％，則Xoo基因文庫的理論克隆數(shù)應(yīng)為417個。本實(shí)施例中提出Xoo基因文庫的克隆數(shù)為2000個，足以滿足文庫的容量要求。因hrp基因簇一般大小為23-25-kb，在載體pURF034上插入的平均大小為33-kb的DNA片段足以包含Xoohrp基因簇。基因組DNA和質(zhì)粒DNA提取、純化、酶切、回收、重組、連接、轉(zhuǎn)化、電泳和包裝蛋白的提取、包裝、轉(zhuǎn)染等技術(shù)均為公知，見文獻(xiàn)(LarrySnyderandWendyChampness.(1997)MolecularGeneticsofBacteria.ASM.Press，Washington，D.C)。S17-1、BHB2688和BHB2690以及質(zhì)粒pUFR034均為已知和公用。S17-1見文獻(xiàn)(DeFeyter，R.，C.I.KadoandD.W.Simon，R.，U.PrieferandA.Puhler.1983.Abroadhostrangemobilizationsystemforgeneticengineeringtransposonmutagenesisingramnegativebacteria.Biotechnology.1784-791)。BHB2688和BHB2690見文獻(xiàn)(Priefer，U.etal.1984.CloningwithcosmidsInAdvancedMoleculargenetics.A.PuhlerandK.N.Timmis(eds)SpringerVerlag，pp.160-170.)。質(zhì)粒pUFR034見文獻(xiàn)Gabriel.1990.Small，stableshuttlevectorsforuseinXanthomonas.Gene8865-72.。2.DES誘變水稻黃單胞菌獲得hrp-基因突變體2.1DES誘變Xoo獲得hrp-基因突變體Xoo野生菌株JXOIII(在寄主水稻汕優(yōu)63上具致病性、在非寄主煙草NC89上可激發(fā)HR)在NA培養(yǎng)基上標(biāo)記Rifampicin抗性(≥100ug/mL)，經(jīng)水稻和煙草上檢驗(yàn)后獲得出發(fā)菌。出發(fā)菌在20mLNA+Rif(100ug/mL)中28℃、100rpm條件下振蕩培養(yǎng)36h，4,000rpm離心10min收集菌體，0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(PBS，pH7.0)洗二次，后用1/5體積0.2mol/LPBS懸浮，加入16mLPBS，再加入200ul硫酸二乙酯(DES)，于28℃、100rpm條件下孵育30min，取其中200uL涂于NA+Rif100ug/mL的平板上。28℃下培養(yǎng)3-4d后挑選突變體。突變體在NA+Rif(100ug/mL)中于28℃、100rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(＞108cfu/mL)。用去針頭的注射器將突變體注射于煙草葉片背面的葉肉組織中，12-72h內(nèi)觀察接種部位有無HR。將無HR的突變體培養(yǎng)至對數(shù)生長期(＞108cfu/mL)，剪葉法接種孕穗期水稻。每突變體接種5株水稻，每株只接種旗葉，12d后測量病斑長度。將無激發(fā)煙草產(chǎn)生HR和在水稻汕優(yōu)63無致病性的突變體在100mLNA中擴(kuò)大生長至對數(shù)期，4,000rpm離心10min收集菌體。按下列方法制備細(xì)胞各組分①細(xì)胞破碎液將收集的菌體用25ml去離子水懸浮，超聲波(20kHz，Pulseonfor3.30sec.，Pulseofffor3sec.)冰浴避光破碎菌體7min；②細(xì)胞破碎上清液細(xì)胞破碎液于4℃、10,000rpm離心10min，取上清液；③菌殘體沉淀用5mL去離子水懸浮待測；④細(xì)胞破碎液上清液熱處理將細(xì)胞破碎上清液熱(100℃)處理10min冷卻后待測；⑤細(xì)胞破碎液上清液蛋白酶K水解物將細(xì)胞破碎上清液用蛋白酶K處理(終濃度40ug/mL，37℃溫浴15min)待測。將上述5種組分注射接種煙草，12-72h內(nèi)觀察HR反應(yīng)。Xoo經(jīng)DES誘變和HR及致病性測定后發(fā)現(xiàn)，Xoohrp-突變體JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482在煙草上失去激發(fā)HR的能力，并在寄主水稻上失去致病性(表1)。根據(jù)激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的物質(zhì)是否在胞內(nèi)，把上述突變體分為兩類。一類是JCM0066、JCM2322和JCM2482，其激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的物質(zhì)既不在胞內(nèi)存在也不在胞外存在，這類突變體為harpin類蛋白缺乏突變體。另一類是JCM2211，其激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，但不能泌出胞外。這類突變體為III型泌出通道突變體(表1)。2.2DES誘變Xooc獲得hrp-突變體Xooc野生菌株RS105(在汕優(yōu)63上具致病性、在煙草NC89上激發(fā)HR)在NA培養(yǎng)基上標(biāo)記Rif抗性(≥100ug/mL)，經(jīng)水稻和煙草檢驗(yàn)后獲得出發(fā)菌。出發(fā)菌在20mLNB+Rif(100ug/mL)中28℃、100rpm條件下振蕩培養(yǎng)36h，4,000rpm離心10min收集菌體，0.2mol/L磷酸鈉緩沖液PBS(pH7.0)洗二次，后用1/5體積0.2mol/LPBS懸浮，加入16mLPBS中，再加入200ul硫酸二乙酯(DES)，于28℃、100rpm條件下誘變30min，取其中200uL涂于PSA+Rif100ug/mL的平板上。28℃下3-4d后挑選突變體。將突變菌株在NB+Rif(100ug/mL)中于28℃、100rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(＞108cfu/mL)。用無針頭的注射器將突變菌株注射于煙草葉片背面的葉肉組織中，12-72h內(nèi)觀察接種部位有無過敏反應(yīng)(HR)。將無HR的突變菌株按上述條件再培養(yǎng)至對數(shù)生長期(＞108cfu/mL)，針刺法接種于成株期的水稻葉片。每株突變體接種5株水稻，每株2葉，12d后測量病斑長度。在煙草上無HR和在水稻汕優(yōu)63上無致病性的hrp-突變株分別為M51、M55和M1005(表2)。將此3株hrp-突變體于100mLNB中培養(yǎng)至對數(shù)期(≥108cfu/mL)，4,000rpm離心10min收集菌體。按下列方法制備細(xì)胞各組分①細(xì)胞破碎液將收集的菌體用25ml去離子水懸浮，超聲波(20kHz，Pulseon3.30secfor3min，Pulseofffor3sec)冰浴避光破碎菌體7min；②離心上清液細(xì)胞破碎液于4℃、10,000rpm離心10min，取上清液；③菌殘體沉淀用5mL去離子水懸浮；④離心上清液熱處理離心上清液熱(100℃)處理10min；⑤離心上清液蛋白酶K水解物離心上清液用蛋白酶K處理(終濃度40ug/mL，37℃溫浴15min)。將上述5種組分注射接種煙草葉片，12-72h內(nèi)觀察HR反應(yīng)。Xooc野生菌株RS105經(jīng)DES誘變后獲得的hrp-突變體M51、M55和M1005在煙草上失去激發(fā)HR的能力，并在寄主水稻上失去致病性(表2)。根據(jù)激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的物質(zhì)是否在胞內(nèi)，把上述突變體分為兩類。一類是M55和M1005，其激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的物質(zhì)既不在胞內(nèi)存在也不在胞外存在，這類突變體為harpin類蛋白缺乏突變體。另一類是M51，其激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，但不能泌出胞外。3.交叉互補(bǔ)法釣取Xoo基因文庫中hrp基因克隆以Xoochrp-突變體M55為受體菌，以Xoo基因文庫克隆為供體菌，采用交叉互補(bǔ)法，將Xoo基因文庫400個克隆分別逐一與hrp-突變體M55進(jìn)行兩親交配。將無菌硝酸纖維濾膜(2cm2)置NA平板上，用無菌牙簽挑取少許在LB+Km20ug/mL+Sp25ug/mL平板上生長的基因文庫克降于濾膜上。受體菌在NB+Rif100ug/mL中于28℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(107cfu/mL)，離心(4,000rpm，10min，RT)收集菌體，1/20體積LB懸浮菌體，40uL點(diǎn)于涂有供體菌的濾膜上。結(jié)合濾膜于NA上在28℃下培養(yǎng)36-48h。涂布濾膜上菌體于NB+Rif(75μg/mL)+Km(10～11μg/mL)的平板上，28℃下培養(yǎng)4-7d后，挑取接合子單菌落。將所得的接合子接種在NB+Rif(75ug/mL)+Km(12ug/mL)中于28℃、100rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(≥108cfu/mL)，無針頭注射器法注射于煙草葉片的葉肉組織中，24h內(nèi)觀察測試煙草上的HR。將獲得的能在煙草上激發(fā)HR的接合子，針刺法接種水稻葉片測定致病性。HR和致病性的測定結(jié)果表明，pUHRX245為Xoohrp基因的陽性克隆(表2)。交叉互補(bǔ)法為公知技術(shù)，見文獻(xiàn)(王金生.(1999)分子植物病理學(xué).中國農(nóng)業(yè)出版社.北京)4.Xoohrp基因克隆pUHRX245的亞克隆載體質(zhì)粒pUFR034多克隆位點(diǎn)上的單一酶切位點(diǎn)為EcoRI、KpnI、SacI和BamHI(圖2)提取hrp基因克隆pUHRX245中DNA，經(jīng)EcoRI完全酶切后除載體外產(chǎn)生17.0、13.5、3.3和3.0-kb四個片段(圖3、圖4)，說明pUHRX245中插入到pUFR034多克隆為點(diǎn)上的hrp基因片段大小為36.8-kb。對pUFR034進(jìn)行EcoRI酶切并去磷酸化，在T4DNA連接酶的作用下，分別與回收的pUHRX245經(jīng)EcoRI完全酶切的4個DNA片段相連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。根據(jù)lacZ是否失活選擇白色菌落提取質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行EcoRI完全酶切，確定所需DNA片段是否插入到載體pUFR034的多克隆位點(diǎn)。以據(jù)插入片段大小將所得亞克隆分別命名為pHRE3、pHRE3.3、pHRE13.5和pHRE17，分別含3.0、3.3、13.5和17.0-kbDNA片段。同理，36.8-kbhrp基因片段經(jīng)KpnI酶切后回收經(jīng)KpnI酶切后產(chǎn)生的20.0、6.0、5.8和3.8-kbDNA片段，與經(jīng)KpnI酶切并去磷酸化的pUFR034相連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。將所得克隆分別命名為pHRK3.8、pHRK5.8、pHRK6和pHRK20，分別含3.8、5.8、6.0和20.0-kbDNA片段。對亞克隆pHRE13.5所含13.5-kb片段進(jìn)行BamHI酶切，純化后與經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化的載體pUFR034相連接，轉(zhuǎn)化DH5α后得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6三個亞克隆，所含插入DNA片段分別為2.3、5.2和6.0-kb。對亞克隆pHRB6所含6.0-kb片段進(jìn)行SacI酶切，純化后與經(jīng)SacI酶切并去磷酸化的載體pUFR034相連接，轉(zhuǎn)化DH5a后得到pHRS2.7和pHRS3.3兩個亞克隆，所含DNA片段大小分別為2.7-kb和3.3-kb。對亞克隆pHRS3.3所含3.3-kb片段進(jìn)行SacI和KpnI雙酶切，純化后經(jīng)與SacI和KpcI雙酶切的pUFR034載體相連接，轉(zhuǎn)化DH5α后得到2個亞克隆pSK1.1和pSK2.2，所含插入DNA片段分別為1.1-kb和2.2-kb。5.36.8-kbhrp基因片段的酶切圖譜構(gòu)建依據(jù)以上36.8-kb各亞克隆和對pHRE17.0進(jìn)行KpnI酶切，構(gòu)建了如圖3所示的限制性酶切圖譜。6.功能互補(bǔ)法檢測pUHRX245各亞克隆所含片段的功能性提取以上各亞克隆中重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌S17-1后作為供體菌，以Xoohrp-突變體JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482以及Xoochrp-突變體M51、M55和M1005分別為受體菌，在硝酸纖維濾膜上進(jìn)行兩親交配。供體菌在LB+km20ug/mL+Sp25ug/mL培養(yǎng)基上劃線，于37℃中培養(yǎng)36h后用滅菌牙簽挑取少許于NA培養(yǎng)基的硝酸纖維濾膜(2cm2)上。受體菌在NB+Rif100ug/mL中于28℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(107cfu/mL)，離心(4,000rpm，10min，RT)收集菌體，1/20體積LB懸浮菌體，40uL點(diǎn)于涂有供體菌的濾膜上。結(jié)合濾膜于NA上在28℃下培養(yǎng)36-48hr。涂布濾膜上菌體于NB+Rif(75(g/mL)+Km(10～11ug/mL)的平板上，28℃培養(yǎng)4-7d后，挑取接合子單菌落。將所得的接合子接種在NB+Rif(75ug/mL)+Km(12ug/mL)中于28℃、100rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(108cfu/mL)，無針頭注射器法注射于煙草葉片的葉肉組織中，測試煙草上的HR。將獲得的能在煙草上激發(fā)HR的接合子，針刺法接種水稻葉片測定致病性?；パa(bǔ)子的HR和致病性測定后發(fā)現(xiàn)，pUHRX245的亞克隆pHRE13.5、pHRE13.5的亞克隆pHRB6和pHRB6的亞克隆pHRS3.3能夠交叉互補(bǔ)hrp-突變體M1005的在非寄主煙草上的HR和在感病寄主水稻上的致病性，并表現(xiàn)出水稻細(xì)條斑病的癥狀(表2、表3，圖3)。這說明亞克隆pHRE13.5、pHRB6、和pHR3.3含有功能性片段，其大小分別為13.5、6.0和3.3-kb。將pHRS3.3的亞克隆pSK1.1和pSK2.2按兩親交配法與hrp-突變體JCM0066、JCM2482、M51、M55和M1005進(jìn)行功能互補(bǔ)，經(jīng)HR和致病性測定后發(fā)現(xiàn)，該兩亞克隆不能功能互補(bǔ)hrp-突變體M51、M55和M1005的HR和致病性，但亞克隆pSK1.1能夠功能互補(bǔ)JCM0066和JCM2482兩hrp-突變體的激發(fā)非寄主煙草產(chǎn)生HR的能力，說明亞克隆pSK1.1含有功能性片段(表3)。將亞克隆pHRS3.3按兩親交配法功能互補(bǔ)Xoohrp-突變體JCM0066和JCM2482，發(fā)現(xiàn)pHRS3.3能使hrp-突變體JCM0066和JCM2482恢復(fù)在非寄主煙草上激發(fā)HR的能力，說明pHRS3.3所含的3.3-kb為功能性片段(表3)。7.序列測定和目標(biāo)基因分析將pHRS3.3中所含3.3-kbDNA片段送寶生物技術(shù)(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。測定號為NJS057。將3.3-kbDNA序列在Internet上輸入GenBank，查新或與已知基因序列進(jìn)行相似性或相同性比較。結(jié)果顯示，3.3-kb中68-1581的序列與來自Xanthomonascampestrispv.vesicatoria中的hrpXv的相同性達(dá)90％，與來自X.citri中的hrpXct的序列相同性達(dá)90％(表4)。這表明，3.3-kb片段中含有目標(biāo)基因，將此基因命名為hrpXoo。hrpXoo基因的核苷酸序列特征如下5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3′其中，GAGCTSacI酶切位點(diǎn)；AGAGAGAG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CCGGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；GGTACCKpnI酶切位點(diǎn)；alpha-helix-turn-alpha-helix；終止密碼子。3.3-kb片段經(jīng)SacI和KpnI酶切酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，pSK1.1中所含1.1-kb片段缺少hrpXoo基因序列中的α-螺旋-轉(zhuǎn)-α-螺旋序列。α-螺旋-轉(zhuǎn)-α-螺旋序列是hrpXoo的特征。表1.Xoohrp-突變體和其細(xì)胞組分在煙草上的反應(yīng)菌株菌懸液破碎離心上熱處理的蛋白酶K處菌殘體煙草水稻液清液離心上清理的離心上JCM0066-------JCM2211--+++--JCM2322-------JCM2482----NDND-JXOIII+15.52cm*+++--CK-------注+示激發(fā)煙草產(chǎn)生HR；-示煙草上無HR；ND，未測定；*示病斑長度；ND，未測定。表2.Xoochrp-變體和功能互補(bǔ)子及其細(xì)胞組分在煙草上的反應(yīng)菌株和活菌體細(xì)胞離心上菌殘體離心上清液離心上清液蛋接合子煙草水稻破碎液清液熱處理白酶K處理M51--++-+-M55-------M1005-------M51/pUHRX245+-++-+-M51/pUHRS138+-++-+-M55/pUHRX245+-++-+-M55/pUHRS138+-++-+-M1005/pUHRX245+4.07a++-+-M1005/pUHRS138+3.56a++-+-RS105+3.85a++-+-CK-------+示在煙草上激發(fā)HR，-示在煙草上無HR。*-示無反應(yīng)；*數(shù)字后無相同字母示差異達(dá)顯著水平。表3.Xoohrp基因片段及其亞克隆對對水稻黃單胞菌hrp-突變體的互補(bǔ)作用hrp基因片段及hrp-突變體亞克隆Xoohrp-突變體Xoochrp-突變體JCM0066JCM2482M51M55M1005pUHRX245NTNT+++pHRE3NTNT---pHRE3.3NTNT---pHRE13.5NTNT+++pHRE17NTNT---pHRK3.8NTNT---pHRK5.8NTNT---pHRK6NTNT---pHRK20NTNT---pHRB2.3NTNT---pHRB5.2NTNT---pHRB6NT++++pHRS2.7-----pHRS3.3+++++pSK1.1++---pSK2.2-----*NT，未測；**-無HR；+HR表43.3kb片段中hrpXoo基因序列與其它黃單胞菌中相關(guān)序列的相同性比較相關(guān)序列(基因)長度(-kb)同源序列起止位點(diǎn)相同性SequencesLength(-kb)StartandstopsitesIdentitySubject/ObjectX.c.pv.vesicatoriahrpXv180668-1581/188-170190％X.citrichrpXct185381-1581/153-165390％X.c.pv.zinniae60(alpha-helix-turn-alpha-helix)1292-1351/1-6093％表5.Xoochrp基因克隆及其亞克隆對對水稻黃單胞菌hr-p突變體的互補(bǔ)作用hrp基因片段hrp-突變體及亞克隆Xoohrp-突變體Xoochrp-突變體JCM0066JCM2482M51M55M1005pUHRS138NTNT+++pHRE8.4NTNT---pHRE12.3NTNT---pHRE18.6NTNTpE20.7NTNT+++pPK12.3NTNT+++pPK8.4NTNT---pHRK6.6NTNT+++pHRK5.7NTNT---pHRK5.2NTNT---pHRK3.2NTNT---pBK4.5+++++pBK2.1-----*NT，未測；**-無HR；+HR表6.pBK4.5中所攜4.5-kb片段與其它黃單胞菌中相關(guān)序列的相同性比較同源基因長度(kb)同源序列起始位點(diǎn)同一性X.c.pv.vesicatoriahrpXv18063346-4883/148-168690％X.citrihrpXct18533346-4883/100-163890％X.c.pv.vesicatoriahrpG15591866-3168/1406-3587％實(shí)施例2水稻細(xì)條斑病菌hrp基因克隆、亞克隆和調(diào)節(jié)基因hrpXooc和hrpGXooc1.水稻細(xì)條斑病菌基因文庫的構(gòu)建構(gòu)建流程圖如圖5，方法參見實(shí)施例1。2.DES誘變水稻黃單胞菌Xoo、Xooc獲得hrp-基因突變體，方法同實(shí)施例1。3.功能互補(bǔ)法釣取Xooc基因文庫中hrp基因克隆以Xoochrp-突變體M55為受體菌，以Xooc基因文庫克隆為供體菌，采用功能互補(bǔ)法，將Xoo基因文庫1000個克隆分別逐一與hrp-突變體M55進(jìn)行兩親交配。將無菌硝酸纖維濾膜(2cm2)置NA平板上，用無菌牙簽挑取少許在LB+Km20ug/mL+Sp25ug/mL平板上生長的基因文庫克隆于濾膜上。受體菌在NB+Rif100ug/mL中于28℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(107cfu/mL)，離心(4,000rpm，10min，RT)收集菌體，1/20體積LB懸浮菌體，40uL點(diǎn)于涂有供體菌的濾膜上。結(jié)合濾膜于NA上在28℃下培養(yǎng)36-48h。涂布濾膜上菌體于NB+Rif(75μg/mL)+Km(10～11μg/mL)的平板上，28℃下培養(yǎng)4-7d后，挑取接合子單菌落。將所得的接合子接種在NB+Rif75ug/mL+Km12ug/mL中于28℃、100rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(≥108cfu/mL)，無針頭注射器法注射于煙草葉片的葉肉組織中，24hr內(nèi)觀察測試煙草上的HR。將獲得的能在煙草上激發(fā)HR的接合子，針刺法接種水稻葉片測定致病性。HR和致病性的測定結(jié)果表明，pUHRS138為Xoochrp基因的陽性克隆(表2)。4.Xoochrp基因克隆pUHRS138的亞克隆載體質(zhì)粒pUFR034多克隆位點(diǎn)上的單一酶切位點(diǎn)為EcoRI、KpnI、SacI和BamHI(圖2)提取hrp基因克隆pUHRS138中DNA，經(jīng)EcoRI完全酶切后除載體外產(chǎn)生8.4、12.3和18.6-kb三個片段(圖6、圖7)，說明pUHRS138中插入到pUFR034多克隆位點(diǎn)上的hrp基因片段大小為39.3-kb。對pUFR034進(jìn)行EcoRI酶切并去磷酸化，在T4DNA連接酶的作用下，分別與回收的pUHRS138經(jīng)EcoRI完全酶切的3個DNA片段相連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。根據(jù)lacZ是否失活選擇白色菌落提取質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行EcoRI完全酶切，確定所需DNA片段是否插入到載體pUFR034的多克隆位點(diǎn)。以據(jù)插入片段大小將所得亞克隆分別命名為pHRE8.4、pHRE12.3和pHRE18.6，分別含8.4、12.3和18.6-kbDNA片段(圖7)。對pUHRS138進(jìn)行EcoRI部分酶切，回收后與經(jīng)EcoRI完全酶切并去磷酸化的載體pUFR034相連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。根據(jù)lacZ是否失活選擇白色菌落提取質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行EcoRI完全酶切，確定所需DNA片段是否插入到載體pUFR034的多克隆位點(diǎn)。以據(jù)插入片段大小將所得亞克隆命名為pE20.7，所含片段大小為8.4kb+12.3kb＝20.7-kb。20.7-kb片段經(jīng)Kpnl部分酶切和純化后與經(jīng)KpnI酶切并去磷酸化的pUFR034載體相連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。將所得克隆分別命名為pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分別含12.3(5.7+6.6)、8.4(5.2+3.2)、6.6、5.7、5.2、3.2-kb片段。對亞克隆pHRK6.6所含6.6-kb片段進(jìn)行BamHI和KpnI雙酶切，純化后與經(jīng)BamHI和KpnI雙酶切的載體pUFR034相連接，轉(zhuǎn)化DH5α后得到pHRB4.5和pHRB2.1兩個亞克隆，所含插入DNA片段分別為4.5和2.1-kb片段(圖7)。5.39.3-kbhrp基因片段的酶切圖譜構(gòu)建依據(jù)以上39.3-kb片段各亞克隆和對pHRE18.6進(jìn)行BamHI和KpnI酶切，構(gòu)建了其限制性酶切圖譜(圖6)。6.功能互補(bǔ)法檢測pUHRS138各亞克隆所含片段的功能性提取以上各亞克隆中重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌S17-1后作為供體菌，以Xoohrp-突變體JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482以及Xoochrp-突變體M51、M55和M1005分別為受體菌，在硝酸纖維濾膜上進(jìn)行兩親交配。交配方法、HR和致病性測定參見實(shí)施例1?；パa(bǔ)子的HR和致病性測定后發(fā)現(xiàn)，pUHRS138的亞克隆pE20.7、pPK12.3、pHRK6.6和pBK4.5能夠交叉互補(bǔ)hrp-突變體M1005的在非寄主煙草上的HR和在感病寄主水稻上的致病性，并表現(xiàn)出水稻細(xì)條斑病的癥狀(表2、表5、圖7)，這說明亞克隆pE20.7、pPK12.3、pHRK6.6和pBK4.5含有功能性片段，其大小分別為20.7、12.3、6.6和4.5-kb。7.序列測定和目標(biāo)基因分析將pBK4.5中所含4.5-kbDNA片段送寶生物技術(shù)(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。測定號為NJS100。將4.5-kbDNA序列在Intemet上輸入GenBank，查新并和與已知相關(guān)序列進(jìn)行相似性或相同性比較。結(jié)果顯示，4.5-kb中的同列片段與來自Xanthomonascampestrispvvesicatoria中的hrpXv和hrpG的同一性分別達(dá)90％和87％，與來自X.citri的hrpXct的同一性達(dá)90％(表6)。功能互補(bǔ)(表5、圖7)和序列分析顯示(表6)，4.5-kb片段中含有目標(biāo)基因hrpX和hrpG。因此，將來自Xooc的hrp基因的調(diào)節(jié)基因分別命名為hrpXooc和hrpGXooc。hrpXooc基因的序列特征如下5’AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’其中，GACAGA......ATGCGCChrpXooc基因啟動子區(qū)域；GAGCTSacI酶切位點(diǎn)；AGAGAGAG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CCGGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；alpha-helix-turn-alpha-helix；翻譯終止密碼子。hrpGXooc基因的序列特征如下3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′其中，AAGG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CGCGCGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；翻譯終止密碼子。權(quán)利要求1.水稻黃單胞菌hrp基因克隆，包括來自水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，簡稱Xoo)、以載體pUFR034+36.8-kbhrp基因片段構(gòu)建而成的hrp基因克隆pUHRX245，和來自水稻細(xì)條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，簡稱Xooc)、以載體pUFR034+39.3-kbhrp基因片段構(gòu)建而成的hrp基因克隆pUHRS138。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述水稻黃單胞菌hrp基因克隆，其中Xoohrp基因克隆pUHRX245還包括36.8-kb片段的亞克隆2.1)36.8-kbhrp基因片段，經(jīng)EcoRI酶切后構(gòu)建于載體pUFR034上形成4個亞克隆pHRE17、pUHRE13.5、pHRE3.3和pHRE3，分別含17.0、13.5、3.3和3.0-kbDNA片段；經(jīng)KpnI酶切后構(gòu)建形成4個亞克隆pHRK20、pHRK6、pHRK5.8和pHRK3.8，分別含20、6.0、5.8和3.8-kbDNA片段；2.2)13.5-kb片段經(jīng)BamHI酶切后構(gòu)建得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6.0三個亞克隆，所含插入DNA片段分別為2.3、5.2和6.0-kb片段；2.3)6.0-kb片段經(jīng)SacI酶切后構(gòu)建成2個亞克隆pHRS2.7和pHRS3.3，分別含2.7-kb和3.3-kb片段；2.4)3.3-kb片段經(jīng)SacI和KpnI雙酶切后構(gòu)建成2個亞克隆pSK1.1和pSK2.2，分別含1.1-kb和2.2-kb片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述水稻黃單胞菌hrp基因，其特征在于，Xoochrp基因克隆pUHRS138還包括39.3-kb片段的亞克隆3.1)39.3-kbhrp基因片段經(jīng)EcoRI酶切后構(gòu)建成3個亞克隆pHRE18.6、pHRE12.3和pHRE8.4，分別含18.6、12.3和8.4-kbDNA片段；經(jīng)EcoRI部分酶切后獲得pE20.7亞克隆，含20.7-kb(12.3+8.4-kb)DNA片段；3.2)20.7-kb片段經(jīng)KpnI部分酶切后構(gòu)建成6個亞克隆pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分別含12.3、8.4、6.6、5.7、5.2和3.2-kb片段；3.3)6.6-kb片段經(jīng)BamHI和KpnI雙酶切后構(gòu)建成2個亞克隆pBK2.1和pBK4.5，分別含2.1和4.5-kb兩個片段。4.5-kb片段上有3個SacI酶切位點(diǎn)和1個EcoRI酶切位點(diǎn)。4.水稻黃單胞菌hrp基因的調(diào)節(jié)基因包括4.1來自Xoo的hrp基因調(diào)節(jié)基因hrpXoo，其核苷酸序列為5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3′其中，GAGCTCSacI酶切位點(diǎn)；AGAGAGAG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CCGGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；GGTACCKpnI酶切位點(diǎn)；alpha-helix-turn-alpha-helix終止密碼子。4.2來自Xooc的hrp基因調(diào)節(jié)基因hrpXooc，其核苷酸序列為5’AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’其中，GACAGA......ATGCGCC啟動子區(qū)域；GAGCTSacI酶切位點(diǎn)；AGAGAGAG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CCGGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；alpha-helix-turn-alpha-helix翻譯終止密碼子。4.3來自Xooc的hrp基因調(diào)節(jié)基因hrpGXooc，核苷酸序列為3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′其中，AAGG核糖體結(jié)合位點(diǎn)；CGCGCGC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；翻譯起始位點(diǎn)；翻譯終止密碼子；CTCGAGSacI酶切位點(diǎn)；CTTAAGEcoRI酶切位點(diǎn)。全文摘要本發(fā)明水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調(diào)節(jié)基因,屬農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供的Xoochrp基因陽性克隆及其亞克隆、Xoochrp基因陽性克隆及其亞克隆以及水稻黃單胞菌hrp基因調(diào)節(jié)基因hrpXoo、hrpXooc和hrpG文檔編號C12N15/63GK1276429SQ0011221公開日2000年12月13日申請日期2000年4月17日優(yōu)先權(quán)日2000年4月17日發(fā)明者王金生,陳功友申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)