降解黃曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的藤黃單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物學及生物降解領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種高效降解黃曲霉毒素 B1和髓曲霉毒素A的藤黃單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 曲霉類真菌毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉和髓曲霉等曲霉菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn) 物，已分離鑒定了二十多種結(jié)構(gòu)類似物，其中W黃曲霉毒素B1 (AFB1)和髓曲霉毒素A(OTA) 毒性最大，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)中污染最為廣泛。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織 (WHO)癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌物，因其具有強烈的致癌、致崎和致突變性，已逐漸成 為公共健康和科研領(lǐng)域關(guān)注的焦點。黃曲霉毒素和髓曲霉毒素污染谷物和油料作物已成為 全球性問題，在畜牧業(yè)中，兩類曲霉毒素可通過污染飼料危害動物健康，導致畜牧業(yè)生產(chǎn)率 低下，造成嚴重的經(jīng)濟損失，并通過直接或間接（動物產(chǎn)品傳播）途徑污染食品，影響人類 的身體健康。動物從飼料中攝入AFB1或AFB2,經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為AFM1或AFM2,存在于奶、肉 和禽蛋中，污染人類食物鏈。2011年底，我國乳制品行業(yè)發(fā)生的黃曲霉毒素超標事件即為 AFB1污染飼料導致奶制品AFM1超標的典型案例，已引起我國政府和食品安全部口的高度 重視。隨著人們對真菌毒素危害性認識的逐步加深，對于曲霉類真菌毒素檢測、污染防控和 脫毒技術(shù)方面的研究工作也在不斷深入，其與人們生活品質(zhì)、身體健康和經(jīng)濟利益休戚相 關(guān)。
[0003] 近幾年，發(fā)現(xiàn)了多種微生物對黃曲霉毒素具有顯著的降解或吸附作用。例如，下 酸弧菌屬度utyrivibriosp.)、乳酸桿菌（Xactobacillussp.)、鏈球菌（Str巧tococ州S sp.)、雙歧桿菌度ifidobacteriumsp.)和不動桿菌屬（Acinetobactersp.)等。目前報 道的絕大多數(shù)脫毒菌種在實際應(yīng)用中存在如下兩方面的共性問題：其一，部分脫毒菌種的 脫毒機理屬于物理吸附，并非實質(zhì)性的生物降解，吸附在菌體細胞壁的毒素，在動物或人體 內(nèi)不同理化環(huán)境下可能發(fā)生解吸附作用，沒有實質(zhì)性脫毒意義；其二，報道菌種對毒素的脫 毒率多數(shù)在100μg/kgW上較高濃度條件下測定，對于食品原料和飼料等復(fù)雜基質(zhì)中低濃 度曲霉類毒素（低于20yg/kg)的實際脫毒能力研究鮮見報道。然而，低劑量、復(fù)合污染及 高污染率又是曲霉類真菌毒素污染的普遍特征，而且20μg/kg的低濃度曲霉類真菌毒素 已能夠?qū)θ诵笈K器造成傷害，尤其是被多種毒素復(fù)合污染的農(nóng)產(chǎn)品，其毒性更具有顯著的 增效作用。因此，發(fā)掘具有降解低濃度條件下，多種曲霉類真菌毒素復(fù)合污染的脫毒菌種， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全領(lǐng)域具有重大的實踐意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種高效降解黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒素A的藤黃單胞菌 及其應(yīng)用。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從受多環(huán)芳控嚴重污染的±壤（煉油廠、汽車修理 廠附近）和受真菌毒素嚴重污染的霉爛食品樣品中分離出一株能夠高效降解黃曲霉毒素 B1和髓曲霉毒素A的菌株CW574。在顯微鏡或電鏡下觀察，該菌的主要形態(tài)學特征為：革蘭 氏陰性，無芽抱，桿狀，無鞭毛，不運動（圖1)。該菌嚴格好氧，最適生長溫度為25-30°C，最 適生長抑為7.0，在R2A培養(yǎng)基上培養(yǎng)Ξ天后，呈現(xiàn)黃色圓形菌落，邊緣光滑凸起，菌落直徑 約 1. 5-1.8mm。
[0006] 基于菌株CW574的形態(tài)特征和16SrDNA序列（SEQIDNo. 1)，參考《常見細菌系 統(tǒng)鑒定手冊》，將該菌株鑒定為藤黃單胞菌（LuteimonasSP.)。該菌株于2015年6月14日 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（簡稱CCTCC，地址：中國武漢，武漢大學，郵編430072)，保 藏編號為CCTCCNO:M2015374。
[0007] 體外試驗表明，菌株CW574在短時間具有顯著的髓曲霉毒素（OTA)和黃曲霉毒素 B1 (AFB1)的降解效果。在0TA終濃度為20μg/L的液體培養(yǎng)基中，菌株CW574處理4她，對 0TA的降解率為90. 1 %;在AFB1終濃度為20μg/L的液體培養(yǎng)基中，菌株CW574處理4她， 對AFB1的降解率為85. 5 %。用菌株CW574處理毒素污染的飼料（終濃度20μg/kg)，4她 對OTA降解率為48. 3 %，AFB1降解率為52. 1 %。
[0008] 降解菌株酶學特征檢測結(jié)果顯示，菌株CW574對0TA和AFB1的降解機理主要為 胞內(nèi)酶促降解作用，胞外粗酶液處理4化對0TA(終濃度20μg/L)的降解率為17. 7% ;對 AFB1 (終濃度20μg/L)的降解率為40.6%。
[0009] 本發(fā)明還提供含有藤黃單胞菌CW574的菌劑及其復(fù)合微生物菌劑。
[0010] 本發(fā)明還提供由藤黃單胞菌CW574或所述菌劑制備的黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒 素A雙功能生物降解劑。
[0011] 優(yōu)選地，所述生物降解劑中活性成分為由所述菌劑制備的粗酶液。
[0012] 更優(yōu)選地，所述生物降解劑中活性成分為菌株CW574的發(fā)酵液、菌株CW574發(fā)酵液 經(jīng)離屯、所得上清液或菌體裂解液。
[0013] 其中，菌株CW574的發(fā)酵培養(yǎng)基為：膜蛋白腺17.0g/l，大豆腺3.0g/l，葡萄糖 2. 5g/l，rfeCl5.Og/l，馬冊〇42. 5g/l，W水配制。發(fā)酵條件為：30°C，180r/min振蕩培養(yǎng) 48h。
[0014] 本發(fā)明還提供藤黃單胞菌CW574、所述菌劑和所述生物降解劑在黃曲霉毒素B1和 髓曲霉毒素A生物降解中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供藤黃單胞菌CW574、所述菌劑和所述生物降解劑在霉變食品原料或 飼料脫毒處理中的應(yīng)用。
[0016] 其中，所述霉變食品原料或飼料中黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒素A的含量分別為 20μg/kg及W下，但不局限于20μg/kg及W下濃度。
[0017] 本發(fā)明進一步提供藤黃單胞菌CW574或所述菌劑在制備黃曲霉毒素B1和髓曲霉 毒素A雙功能高效生物降解劑中的應(yīng)用。
[0018]與現(xiàn)有的黃曲霉毒素降解菌相比，本發(fā)明的藤黃單胞菌CW574能夠在低濃度黃曲 霉毒素B1和髓曲霉毒素A污染條件下達到極佳的降解效果。根據(jù)國家食品及飼料衛(wèi)生標準 規(guī)定，谷物類農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素含量必須低于20μg/kg，髓曲霉毒素含量不得超過5μg/ kg，飼料中的髓曲霉毒素A也不得超過100yg/kg(GB2761-2011，GB13078.2-2006)。實 際上，動物毒理實驗表明，連續(xù)喂養(yǎng)含有20μg/kg毒素的飼料，就可W對大鼠的內(nèi)臟器官 造成嚴重的傷害（Weietal.，2014D0I10. 1002/jsfa. 6649)。因此，菌株CW574對低濃度 AFBl和OTA具有高效的降解脫毒能力，在食品/飼料生物脫毒應(yīng)用方面具有實質(zhì)性的應(yīng)用 價值和重大意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明菌株CW574的電子顯微鏡照片。
[0020] 圖2為本發(fā)明實施例2和3中菌株CW574發(fā)酵液對曲霉毒素的動態(tài)降解曲線。
[0021] 圖3為本發(fā)明實施例2中菌株CW574粗酶液對曲霉毒素的動態(tài)降解曲線。
【具體實施方式】
[0022] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0023] 實施例1黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒素A降解菌的篩選、鑒定和培養(yǎng)
[0024] 1、菌株的篩選
[00巧]樣品采集自受多環(huán)芳控嚴重污染的±壤（煉油廠、汽車修理廠附近）和受真菌毒 素嚴重污染的霉爛食品。取采集樣品〇.5g加入150mL富集培養(yǎng)基中（0TA和AFB1含量各為 20μg/L左右），在30°C恒溫培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)7天。第一次富集培養(yǎng)結(jié)束后，取5mL富集培 養(yǎng)液接種到150mL新鮮的0TA和AFB1富集培養(yǎng)基中，將0TA和AFB1的濃度提高到30μg/ L在相同條件下繼續(xù)富集培養(yǎng)7天。W相同的富集方法完成第Ξ次富集培養(yǎng)實驗，提高OTA 和AFB1的濃度至50μg/L。富集培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌水將富集培養(yǎng)液作梯度稀釋，將梯度 稀釋液分別涂布于0TA或AFB1固體分離培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取 培養(yǎng)皿單菌落接種于含有0TA和AFB1各20μg/L的富集培養(yǎng)基內(nèi)進行降解測試培養(yǎng)4她， 同時設(shè)置不接菌的陰性對照。降解培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液經(jīng)二氯甲燒提取，按照國家標準高效 液相色譜巧光檢測法（HPLC-FLD，參照中華人民共和國國家標準GB/T25220-2010和GB/T 18979-2003進行）檢測培養(yǎng)液中兩類毒素殘留濃度，與對照相比計算降解率。最終，分離獲 得一株在低濃度0TA和AFB1條件下（0TA和AFB1含量《20μg/L)仍保持高效降解率的菌 株CW574。 陽0%] 其中，富集培養(yǎng)基為：葡萄糖5. Og/l，蛋白腺5. Og/l，酵母粉2. 5g/l，巧樣酸錠 1. Og/L，NaAc·抓2〇2. 5g/L，MnS〇4·4&0 0. 05g/L，K2HPO41. Og/L，Μ拆〇4·7&0 0. 2g/L，吐 溫-800. 5血，0TA添加濃度20-50 μ g/L，AFB1添加濃度20-50 μ g/L，調(diào)抑至6. 2-6. 5。
[0027] 分離培養(yǎng)基為：葡萄糖10.0 g/l，蛋白腺10.0 g/l，酵母粉5. Og/l，巧樣酸錠2. Og/ L，Μ拆O4·7&0 0. 58g/L，NaAc·3&0 5. Og/L，MnS〇4·4&0 0. 28g/L，吐溫-80 1. 0血，調(diào)抑 至6. 2-6. 5。
[0028] 上述培養(yǎng)基在120°C條件下高壓滅菌15min，使用前添加無菌0TA和AFB1毒素標 準溶液至規(guī)定濃度，固體培養(yǎng)基按W上配方加2.0%的瓊脂粉。
[0029] 2、菌株CW574的鑒定
[0030] 菌株CW574的主要形態(tài)學特征為：革蘭氏陰性，無芽抱，桿狀，無鞭毛，不運動（圖 1)。該菌嚴格好氧，最適生長溫度為2