一種定量檢測赭曲霉毒素a的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及定量檢測赭曲霉毒素 A的方法，尤其涉及一種適配體生物傳感器結(jié)合 血糖儀定量檢測赭曲霉毒素 A的方法，屬于赭曲霉毒素 A的定量檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 霉菌毒素（mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒代 謝產(chǎn)物，它們可通過飼料或食品進入人和動物體內(nèi)，引起人和動物的急性或慢性毒性，損害 機體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等。常見的霉菌毒素有黃曲霉毒素、赭曲 霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏馬菌素等。其中赭曲霉毒 素 A(OTA)主要侵害動物肝臟與腎臟，主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的 腸黏膜炎癥和壞死。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC)將OTA列為II B類致癌物。因此，世界各國 都很重視赭曲霉毒素的檢測和控制，相應(yīng)的制定出了赭曲霉毒素的限量標準。
[0003] 適配體與抗體的性質(zhì)相似，但適配體特異性更強，對目標靶分子具有更高的親和 力，更容易獲得，在體外可以大量快速的合成，制備方法也更為簡單，可以針對不同種類的 目標物進行篩選。目前，基于適配體檢測赭曲霉毒素 A的方法有已有報道。但是，很多檢測 方法存在所需試劑多，操作繁瑣，檢測周期長，重現(xiàn)性差，設(shè)備昂貴，前處理復雜等缺點，不 利于進行現(xiàn)場檢測。
[0004] 血糖儀是一種測量血糖水平的電子儀器，由于其體積小，成本低，操作簡單，能夠 得到準確的定量結(jié)果，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。然而，血糖儀只能檢測葡萄糖這一種物質(zhì)，并且 檢測范圍是0. 6~33mmol/l (10~600mg/dl)。因此，開發(fā)一種便攜式適配體生物傳感器結(jié) 合血糖儀定量檢測赭曲霉毒素 A這種非葡萄糖物質(zhì)的方法，將具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種定量檢測赭曲霉毒素 A的方法，該方法利 用適配體生物傳感器結(jié)合血糖儀定量檢測赭曲霉毒素 A，具有操作簡便，檢出限低，特異性 好，重復再現(xiàn)性好等優(yōu)點。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明首先公開了赭曲霉毒素 A的適配體，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
[0008] 所述適配體的互補DNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、 SEQ ID Nd 9 或 SEQ ID Nd 10 所示。
[0009] 本發(fā)明進一步公開了一種定量檢測赭曲霉毒素 A的方法，包括以下步驟：（1)制備 適配體生物傳感器；（2)提取待測樣品中的赭曲霉毒素 A，得到樣品提取液，加入到所述適 配體生物傳感器中，混勻，孵育；（3)分離上清液，加入過量蔗糖溶液進行反應(yīng)；（4)用血糖 儀進行定量檢測。
[0010] 其中，步驟（1)所述適配體生物傳感器按照以下方法制備：（a)活化蔗糖酶；(b) 活化所述互補DNA ; (c)將步驟（a)活化后的蔗糖酶與步驟（b)活化后的互補DNA分別洗 滌，然后混勻，反應(yīng)合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)將鏈霉親和素修飾的磁球鏈接所述赭曲霉 毒素 A的適配體；(e)將步驟（c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗滌后固定在步驟（d)處理的 磁球上，即得。
[0011] 步驟（b)所述互補DNA的3'端進行巰基修飾；步驟（d)所述赭曲霉毒素 A的適配 體的3'端進行生物素修飾。
[0012] 步驟（a)所述活化鹿糖酶是將鹿糖酶與sulf〇-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-( N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)反應(yīng)；其中，所述反應(yīng)的體系包括： 300-500 μ I 20mg/ml蔗糖酶，0. 5-2mg sulfo-SMCC ;所述反應(yīng)的條件為：先渦旋震蕩5min， 然后在恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)l-3h ;
[0013] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的體系包括：400 μ I 20mg/ml鹿糖酶，Img sulfo-SMCC ;所述反 應(yīng)的條件為：先渦旋震蕩5min，然后在恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)2h。
[0014] 步驟（b)所述活化互補DNA是將所述互補DNA與TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)反應(yīng)；其中，所述反應(yīng)的體系包括：80_120μ1 100μΜ互補 DNA，1-3 μ 1 0.1 M緩沖液Β，1-3 μ I 30mM TCEP ;所述反應(yīng)的條件為：恒溫混勻儀上室溫反 應(yīng) 0· 5-2h ;
[0015] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的體系包括：100μ1 100μΜ互補DNA，2yl 0.1 M緩沖液Β，2μ1 30mM TCEP ;所述反應(yīng)的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)Ih ;所述緩沖液B包括：0.1 M氯化 鈉，0.1 M磷酸鈉，質(zhì)量比為0.05 %的吐溫-20, pH = 7. 3。
[0016] 步驟（c)所述洗滌包括：將步驟（a)反應(yīng)后的溶液離心，取上清液，加入到超濾管 Amicon-100K，25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌；將步驟（b)反應(yīng)后的溶液離心， 取上清液，加入到超濾管Amicon-3K中，25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌；其中， 所述緩沖液A包括：0.1 M氯化鈉，0.1 M磷酸鈉 ，pH = 7. 3 ;步驟（c)所述反應(yīng)合成DNA-蔗 糖酶聚合物的條件是恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)24-60h，優(yōu)選為48h。
[0017] 步驟（d)所述鏈接的體系包括：0. 5_2ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球， 40-80 μ 1 0.1 mM所述赭曲霉毒素 A的適配體；所述鏈接的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應(yīng) 1-2h ；
[0018] 優(yōu)選的，所述鏈接的體系包括：1ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球，60 μ 1 0.1 mM 所述赭曲霉毒素 A的適配體；所述鏈接的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)Ih ;
[0019] 步驟（e)所述洗滌是將步驟（c)合成的DNA-鹿糖酶聚合物用超濾管Amicon-IOOK 于25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌（所述緩沖液A包括：0.1 M氯化鈉，0.1 M磷 酸鈉 ，pH = 7. 3);步驟（e)所述固定是將洗滌后的DNA-鹿糖酶聚合物與步驟（d)處理的磁 球混合，在恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)l_3h，優(yōu)選為lh。
[0020] 本發(fā)明定量檢測赭曲霉毒素 A的方法中，步驟（2)將樣品提取液加入適配體生物 傳感器中，使適配體生物傳感器的終濃度為3mg/ml ;所述孵育的條件為：室溫孵育60min ; 步驟（3)所述反應(yīng)的條件為：室溫反應(yīng)30min ;所述分離上清液是將反應(yīng)后的溶液用磁分離 器分離，然后吸取上清液；步驟（4)所述定量檢測是根據(jù)血糖儀的讀數(shù)與赭曲霉毒素 A標準 品的濃度作回歸方程，將待測樣品的血糖儀讀數(shù)帶入回歸方程，計算待測樣品中赭曲霉毒 素 A的濃度；其中，所述待測樣品包括食品或飼料。
[0021] 本發(fā)明針對赭曲霉毒素 A分別合成了 5條適配體序列及不同適配體序列相對應(yīng)的 互補DNA序列（適配體序列SEQ ID NO. 1，其對應(yīng)的互補DNA核苷酸序列為SEQ ID NO. 6 ; 適配體序列SEQ ID NO. 2,其對應(yīng)的互補DNA核苷酸序列為SEQ ID NO. 7;依此類推。）；其 中，SEQ ID NO. 5所示適配體序列與SEQ ID NO. 4所示序列的差異在于SEQ ID NO. 5所示 序列后多加12個A堿基。
[0022] 本發(fā)明分別用不同適配體序列及其互補DNA序列合成適配體生物傳感器，比較不 同適配體序列的血糖儀信號值。結(jié)果表明，當OTA的濃度為25 μ M，SEQ ID NO. 1-4所示適 配體序列所產(chǎn)生的血糖儀信號值分別為13mg/dl、15mg/dl、16mg/dl、19mg/dl;SEQIDN0·5 所示適配體序列加了 12個A堿基以后血糖儀的信號值為65mg/dl。可能是由于添加12個 A堿基以后，適配體序列的3'端與磁球結(jié)合，增大了適配體與磁球之間的空間位置，適配體 能更好的與OTA分子結(jié)合，釋放下來更多的蔗糖酶分子，血糖儀的信號值明顯增加。因此， 本發(fā)明赭曲霉毒素 A適配體的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO. 5所示，其互補DNA的核苷酸 序列為SEQ ID NO. 10所示。
[0023] 本發(fā)明適配體生物傳感器檢測赭曲霉毒素 A的原理包括，鏈霉親和素包被的磁球 與生物素修飾的適配體相結(jié)合，蔗糖酶和互補DNA相結(jié)合；將DNA-蔗糖酶聚合物通過互補 DNA與適配體堿基互補配對的原則固定到磁球表面；當溶液中含有所需檢測目標分子時， 目標分子與適配體特異性結(jié)合，從而將DNA-蔗糖酶聚合物從磁球上釋放到溶液中；用磁分 離器分離溶液，釋放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能夠高效水解蔗糖為葡萄糖，從而通過 血糖儀進行定量檢測。由于被釋放到溶液中的DNA-鹿糖酶聚合物的量能夠通過葡萄糖的 量來表示，并且蔗糖酶的量與樣品中目標分子的量存在一定的比例關(guān)系。因此，血糖儀的讀 數(shù)能夠被用來定量目標分子的濃度。本發(fā)明適配體生物傳感器4°C條件下能有效保存10天 以上。
[0024] 本發(fā)明對定量檢測赭曲霉毒素 A的方法中步驟（2)的孵育時間和步驟（3)的反應(yīng) 時間進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，適配體生物傳感器與OTA分子的孵育時間在60min時，蔗糖酶 已經(jīng)基本全部釋放，為了保證蔗糖酶完全釋放，選擇60min作為孵育時間；為了保證血糖儀 有一個明顯的檢測信號，采用30min作為與蔗糖溶液的反應(yīng)時間。
[0025] 檢出限測定結(jié)果表明，本發(fā)明方法檢測赭曲霉毒素 A的最低檢出限為 6. 7 X 10 9M(2. 69 μ g/kg)。中國所采用的GB 2715-2005《糧食衛(wèi)生標準》中谷類和豆類中赭 曲霉毒素 A的最高限量為5 μ g/kg，CAC(國際食品法典委員會）中規(guī)定的小麥、大麥、黑麥 中的赭曲霉毒素 A的最高限量為5 μ g/kg，EC (歐盟委員會）中規(guī)定的速溶咖啡和葡萄干中 赫曲霉毒素 A的最尚限量為10 μ g/kg，嬰幼兒食品中赫曲霉毒素 A的最尚限量為0. 5 μ g/ kg。因此，本發(fā)明方法的檢出限除了嬰幼兒食品基本能滿足檢測要求。
[0026] 重復實驗結(jié)果表明，本發(fā)明適配體生物傳感器檢測赭曲霉毒素 A具有良好的再現(xiàn) 性。特異性分析結(jié)果表明，OTA適配體能特異性識別OTA分子，不與其他干擾因