專利名稱：：一種同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B₁的試劑盒及其檢測方法一種同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bi的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對糧食、飼料及食品中赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素B！(AFB!)含量的檢測。技術(shù)背景赭曲霉毒素A(OTA)是真菌曲霉ochraceous和幾種Penicillium真菌產(chǎn)生的一種毒素。OTA已經(jīng)被證明對動物及人的腎產(chǎn)生損害，也是一種致癌物質(zhì)，霉菌毒素引起的中毒大多通過被霉菌污染的糧食，油料作物以及發(fā)酵食品等引起，而且霉菌毒素中毒往往表現(xiàn)為明顯的地方性和季節(jié)性，臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突變等。OTA在大多數(shù)谷物中均可分離到，包括大麥、小麥、燕麥、玉米、咖啡豆等，以這些谷物作為飼料的家禽也會受到污染。第56次FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)會議對OTA進行了危險性評價，得出的結(jié)論是體內(nèi)和體外試驗顯示OTA都具有遺傳毒性，考慮到小麥、大麥和黑麥等谷物是攝入OTA主要的食物品種，決定制定這些食物中OTA的限量標準，會議認為這些食物及其制品中OTA限量為5pg/kg。到目前為止，已有11個國家制定了食品(l-50(ig/kg)和飼料(100-1000(ig/kg)中的OTA的限量標準。黃曲霉毒素AFBi)是真菌黃曲霉Hspergillusflavus和寄生曲霉A.parasilicus菌株產(chǎn)生的一組強毒性的次生代謝產(chǎn)物，尤其是AFBi為強污染物質(zhì)，分布范圍廣，能引起人類，各種詞料動物的急性中毒死亡，還能引起致癌，致畸，致突變，即使幾十嗎/kg的含量仍有很大的毒性。食品和飼料中黃曲霉毒素lmg/kg以上有劇毒。其毒性為氳化鉀的10倍，為砒霜的68倍。食用被黃曲霉毒素污染嚴重的食品后可出現(xiàn)發(fā)熱，腹痛，嘔吐，食欲減退，嚴重者在23周內(nèi)出現(xiàn)肝脾腫大，肝區(qū)疼痛，皮膚黏膜黃染，腹水，下肢浮腫及肝功能異常等中毒性肝病癥狀，也可能出現(xiàn)心臟擴大，肺水腫，甚至痙攣，昏迷等癥。由于不易防止食物被真菌污染，因此人們對長期食用低劑量黃曲霉毒素污染的可能性非常關(guān)注。由于黃曲霉毒素特別是Bi是潛在的致癌物質(zhì)，人們長期接觸低劑量的黃曲霉毒素可能會有影響，1988年國際癌癥研究機構(gòu)將黃曲霉毒素Bi列為IA類致癌物質(zhì)。黃曲霉毒素Bi是最強的致癌物質(zhì)，它在食物中的法定限量非常低，其限量標準為2嗎/kg。歐盟委員會對嬰幼兒食品中的毒素限量標準進行了補充。草案規(guī)定，在包括谷類食品在內(nèi)的嬰幼兒食品中，毒性最大的黃曲霉毒素的最大限量為0.05pg/kg。鑒于AFBi和OTA的危害，非常需要建立靈敏度高、測量范圍寬、方便快捷的AFBi和OTA等生物毒素的測定方法。由于在谷物等的安全性檢測中，AFB,和OTA經(jīng)常是必須同時檢測的項目，在同次操作中進行高靈敏的OTA和AFB的同步檢測可以提高工作效率，降低應(yīng)用成本。目前OTA和AFBi的測定方法有多種，如薄層色譜法TLC，高效液相色譜法HPLC，免疫熒光染色法，但存在操作費時，儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜且不適用于大批量樣品的檢測等缺點。免疫測定法，由于其特異性強，靈敏度高，操作簡便，不需直接接觸毒素，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用。盡管如此，常用的酶聯(lián)免疫測定法檢測的靈敏度和試劑的穩(wěn)定性還不甚滿意，而且無法同時進行OTA和AFB!測定。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)是新發(fā)展的免疫測定技術(shù)。TRFIA是將稀土離子的靈敏、穩(wěn)定等特性與免疫分析相結(jié)合的技術(shù)。其分析的基本原理如下①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種稀土離子連接成標記抗原或抗體，這種標記抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留稀土離子的熒光特性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和標記抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。③用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的稀土離子量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。通過延緩時間測量稀土離子的熒光，消除自然熒光的干擾，從而使測定方法達到很高的敏感度。TRFIA還有一技術(shù)優(yōu)勢，即可以進行多指標分析，若同時采用銪、釤、鏑、鋱等稀土離子標記不同的抗原或抗體，由于銪、釤、鏑、鋱等稀土離子的發(fā)射光不同，就能夠在一次分析中得到多個數(shù)據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B,的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對糧食、飼料及食品中赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素Bi(AFBi)含量的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案該檢測OTA和AFB!的試劑盒是由1、96或48孔包被板，2、緩沖液，3、含赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bi的標準，4、鼠抗赭曲霉毒素A的抗體凍千品，5、兔抗黃曲霉毒素Bi的抗體凍干品，6、釤標記的羊抗鼠抗體，7、銪標記的羊抗兔抗體，8、洗滌液和9、增強液所組成。其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液將赭曲霉毒素A-牛血清蛋白OTA-BSA、黃曲霉毒素Br牛血清蛋白AFBrBSA稀釋至各自終濃度都為10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100pL,4°C放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，力卩150nL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4°C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(TC冷凍保存。其中的含赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bi的標準(3)，分別從OTA、AFBJ屯品中稀釋后再混合得到，稀釋液為甲醇水=3:7，共6瓶，各瓶中的OTA濃度依次為Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，及AFB,濃度依次為Ong/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。其中的鼠抗赭曲霉毒素A的抗體凍干品(4)，為由赭曲霉毒素A-血藍蛋白(OTA-KLH)免疫小鼠得到的抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體。其中的兔抗黃曲霉毒素B,的抗體凍干品(5)，為由黃曲霉毒素Br血藍蛋白(AFBrKLH)免疫家兔得到的抗黃曲霉毒素B,的多克隆抗體。其中的釤標記的羊抗鼠抗體(6)，將購得的羊抗鼠抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉(zhuǎn)換的羊抗鼠抗體加入Sm、N2-[p-異氰酸-節(jié)基]-二乙烯三胺四乙酸，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。.其中的銪標記的羊抗兔抗體(7)，將購得的羊抗兔抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉(zhuǎn)換的羊抗兔抗體加入Eu、N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。其中的緩沖液(2):含8mmol/LNaCl、0.1。/。BSA、50|imol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/LTween-80和0.1。/。NaN3的5Ommol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液；洗滌液(8):14.5腿ol/LNaCl、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的50mmol/L、pH7,8的Tris-HCl溶液；增強液(9):lLpH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液，其中含15pmol|3-萘甲酰三氟丙酮，50pmo1三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-IOO。本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)來檢測OTA和AFBp采用TRFIA同時檢測OTA和AFBi的技術(shù)，主要是Ei^+標記羊抗兔抗體及Sm1示記羊抗鼠抗體的應(yīng)用。測定的基礎(chǔ)是標記免疫反應(yīng)。微孔板共同包被有OTA-BSA、AFBrBSA，加入OTA、AFB!標準或樣品，再加入OTA單克隆抗體、AFB!多克隆抗體。游離的OTA、AFBi與微孔板上的OTA-BSA和AFBrBSA競爭相應(yīng)的抗體，沒有連接的OTA單克隆抗體及AFB!多克隆抗體被洗滌除去，加入Sm^-羊抗鼠抗體和Eu3+-羊抗兔抗體，標記免疫反應(yīng)后沒有連接的81113+-羊抗鼠抗體及￡113+-羊抗兔抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀分別測定銪和釤熒光強度cps，釤的熒光強度與樣品中的OTA濃度成反比，銪的熒光強度與樣品中的AFB!濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中OTA和AFB!的含量。用所述的試劑盒同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B的方法，取包被有OTA-BSA和AFBrBSA的微孔包被板，加入OTA、AFBi標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入抗OTA、AFBi抗體，振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌，加釤標記的羊抗鼠抗體和銪標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后分別測量銪和釤的熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的OTA和AFB,含同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B,的方法，具體操作為取包被有OTA-BSA和AFB1-BSA的微孔包被板，加入50nL的OTA、AFB!標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加25nL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:IO稀釋的OTA抗體，加25^L以緩沖液(2)作稀釋劑，1:10稀釋的AFBi抗體，25-37。C振蕩0.5-1小時，洗滌液洗三次；加以緩沖液(2)1:10稀釋的5(HiLEi^-羊抗兔抗體，加以緩沖液(2)1:10稀釋的50nLSm、羊抗鼠抗體，25-37。C振蕩0.5-1小時，用洗滌液洗六次；加200pL增強液振蕩5分鐘后分別測量銪和釤熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中的OTA和AFBi含量。本發(fā)明的有益效果提供的同時檢測OTA和AFBi試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，廉價，一次操作可以同時得到OTA和AFBi兩個檢測結(jié)果。圖1:同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bi的試劑盒示意圖。1、96或48孔包被板，2、緩沖液，3、含赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bi的標準，4、鼠抗赭曲霉毒素A的抗體凍干品，5、兔抗黃曲霉毒素B!的抗體凍干品，6、釤標記的羊抗鼠抗體，7、銪標記的羊抗兔抗體，8、洗滌液，9、增強液。圖2:OTA-TRFIA標準曲線圖。圖3:AFB廣TRFIA標準曲線圖。具體實施方式實施例1制備試劑盒和檢測玉米樣品￡113+-羊抗兔抗體的制備取溶解于50mmol/L、pH7.0PBS的5g/L羊抗兔抗體l-2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A28(r0.74A260),用上述洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L。取50(^L稀釋后的羊抗兔抗體加入含0.2mg的Eu、N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30。C磁力攪拌反應(yīng)20小時。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L、pH7.8Tris-HCl緩沖液平衡的SepharoseCL-6B柱(1x40cm)層析，A，監(jiān)測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。Sn^-羊抗鼠抗體的制備轉(zhuǎn)換緩沖條件同上。取500nL稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.2mg的Sm3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)的小瓶中，3(TC磁力攪拌反應(yīng)20小時。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L、pH7.8Tris-HCl緩沖液平衡的SepharoseCL-6B柱(1x40cm)層析，A娜監(jiān)測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。包被板固相抗原制備用50mmol/L、pH9.6Na2COrNaHC03的緩沖液將OTA-BSA、AFB廣BSA稀釋至各自終濃度都為10mg/L做為包被液,96孔微孔板各孔加100nL，4"C放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150nL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4"C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(TC冷凍保存。試劑的配制(1)含赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B,的標準分別從OTA、AFBJ屯品中稀釋后再混合得到，稀釋液為甲醇水=3:7，共6瓶，每瓶中的OTA濃度依次為Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，及AFBi濃度依次為Ong/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。(2)緩沖液含8mmol/LNaCl、0.1%BSA、50|imol/L二乙烯三胺五乙酸、O.lmL/LTween-80和0.1%NaN3的5O讓ol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液。(3)洗滌液14.5mmol/LNaCl、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液。(4)增強液的配制1升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液，其中含15pmo1P-萘甲酰三氟丙酮((3-NTA)，50pmo1三正辛基氧化膦(TOPO)，lmL曲拉通X-100(TritonX-IOO)。試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1).lx96孔板(8條xl2孔，可以拆分為單孔)包被有OTA-BSA、AFB!-BSA。(2).lx緩沖液30mL。(3),6xOTA、AFB!標準液，1.0mL/瓶，每瓶中的OTA濃度依次為0ng/mL，0.1ng/mL，lng/mL，5ng/raL，10ng/mL，50ng/mL，及AFB,濃度依次為Ong/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。(4).lxOTA抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(5).lxAFB!抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(6).1xSm3+-羊抗鼠抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(7).11xEu3+-羊抗兔抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(8).lx洗滌液30mL，用時以蒸餾水1:25稀釋。(9).lx增強液20mL。實驗室應(yīng)自備的試劑甲醇。70%甲醇溶液30mL蒸餾水或去離子水和70mL純甲醇混合制備70%甲醇溶液。蒸餾水或去離子水。測定之前注意事項1、使用之前將所有試劑回升至室溫(18-3(TC)。2、使用之后立即將所有試劑放回2-8。C保存。3、如果樣品量大建議使用多通道移液器。4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。5、取出需用數(shù)量的微孔板及框架，'將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8'C。具體檢測步驟如下先將將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5mL(甲醇水=7:3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。取包被有OTA-BSA和AFBrBSA的微孔包被板，加入50pL的OTA、AFBt標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加25pL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:IO稀釋OTA抗體，加25pL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:IO稀釋AFB!抗體，25-37°C振蕩0.5-1小時，洗滌液洗三次；加以緩沖液(2)1:10稀釋的5(HiLEuh羊抗兔抗體，加以緩沖液(2)1:10稀釋的50pL51113+-羊抗鼠抗體，25-37。C振蕩0.5-1小時，用洗滌液洗六次；加200pL增強液振蕩5分鐘后分別測量銪和釤熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中的OTA和AFBi含量，見表l.l、1.2和圖2.1、2.2，該例提取的樣品OTA濃度為0.21ng/mL、AFBi濃度為0.35ng/mL(玉米樣品OTA、AFB!含量分別是1.05嗎/kg、1.75嗎/kg)。表1.1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2制備試劑盒包被板固相抗原制備用50mmol/L、pH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液將OTA-BSA、AFB廣BSA稀釋至各自終濃度都為10mg/L做為包被液，48孔微孔板各孔加10(HiL，4。C放置過夜，棄去包被液，沖洗三次；力n150pL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，fC放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(TC冷凍保存。試劑的配制同實施例l。試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行48個測量，盒中的材料如下(1).lx48孔板(4條xl2孔，可以拆分為單孔)包被有OTA-BSA、AFB廣BSA。(2).lx緩沖液30mL。(3).6xOTA、AFBi標準液，1.0mL/瓶，共6瓶，每瓶中的OTA濃度依次為Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，及AFB!濃度依次為Ong/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL,lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。(4).lxOTA抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(5).lxAFB!抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(6).lxSm氣羊抗鼠抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。C7).lxEu^-羊抗兔抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(8).lx洗滌液30mL，用時以蒸餾水1:25稀釋。(9).lx增強液20mL。實驗室應(yīng)自備的試劑與實施例1相同。測定之前注意事項同實施例1。具體檢測步驟同實施例1。實施例3試劑盒提供的試劑與實施例1相同，用于檢測小麥樣品。具體檢測步驟如下先將小麥樣品進行處理將小麥樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5mL(甲醇水=7:3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。取包被有OTA-BSA和AFB!-BSA的微孔包被板，加入50^L的OTA、AFB,標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加25nL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:10稀釋OTA抗體，加25pL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:IO稀釋AFB,抗體，25-37°C振蕩0.5-1小時，洗滌液洗三次；加以緩沖液(2)1:10稀釋的50^￡113+-羊抗兔抗體，加以緩沖液(2)1:10稀釋的50|iLSm"-羊抗鼠抗體，25-37°。振蕩0.5-1小時，用洗滌液洗六次；加200pL增強液振蕩5分鐘后分別測量銪和釤熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中的OTA和AFB,含量，見表2.1、2.2和圖2.1、2.2，該例提取的樣品OTA濃度為0.17ng/mL、AFB，濃度為0.08ng/mL(小麥樣品OTA、AFB,含量分別是0.85pg/kg、0.4pg/kg)。表2.1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2.2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的時間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，緩沖液(2)，含赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的標準(3)，鼠抗赭曲霉毒素A的抗體凍干品(4)，兔抗黃曲霉毒素B1的抗體凍干品(5)，釤標記的羊抗鼠抗體(6)，銪標記的羊抗兔抗體(7)，洗滌液(8)和增強液(9)所組成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液將赭曲霉毒素A-牛血清蛋白OTA-BSA、黃曲霉毒素B!-牛血清蛋白AFBrBSA稀釋至各自終濃度都為10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加lOOpL，4t:放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，力[]150pL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4'C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20。C冷凍保存。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的含赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bj的標準(3)，分別從OTA、AFBi純品中稀釋后再混合得到，稀釋液為甲醇水=3:7,共6瓶，每瓶中的OTA濃度依次為Ong/mL，0.1ng/mL,lng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，及AFBi濃度依次為Ong/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的鼠抗赭曲霉毒素A的抗體凍干品(4)，為由赭曲霉毒素A-血藍蛋白OTA-KLH免疫小鼠得到的抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的兔抗黃曲霉毒素Bi的抗體凍干品(5)，為由黃曲霉毒素Br血藍蛋白AFBrKLH免疫家兔得到的抗黃曲霉毒素Bi的多克隆抗體。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的釤標記的羊抗鼠抗體(6)，將購得的羊抗鼠抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉(zhuǎn)換的羊抗鼠抗體加入Srr^-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗兔抗體(7)，將購得的羊抗兔抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉(zhuǎn)換的羊抗兔抗體加入Ei^-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的緩沖液(2):含8mmol/LNaCl、20.1%BSA、50pmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/LTween-80禾。0.1%NaN3的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液；洗滌液(8):14.5mmol/LNaCl、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液；增強液(9):l升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液，其中含15iamol(3-萘甲酰三氟丙酮，50nmol三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-IOO。9、一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B的方法，其特征是取包被有OTA-BSA和AFB,-BSA的微孔包被板，加入OTA、AFBJ示準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入抗OTA、AFBi抗體，振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌，加釤標記的羊抗鼠抗體和銪標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后分別測量銪和釤的熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的OTA和AFBi含量。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素Bt的方法，其特征是取包被有OTA-BSA和AFBrBSA的微孔包被板，加入50|iiL的OTA、AFBJ示準或處理好的樣品到各自的微孔中，加25pL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:10稀釋OTA抗體，加25(iL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:10稀釋AFBt抗體，25-37。C振蕩0.5-1小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)1:10稀釋的50pLEu3+-羊抗兔抗體，加以緩沖液(2)1:10稀釋的50pLSn^-羊抗鼠抗體，25-37'C振蕩0.5-1小時，用洗滌液洗六次，加200pL增強液振蕩5分鐘后分別測量釤和銪熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中的OTA和AFB,含量。全文摘要一種同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B₁的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。微孔板共同包被有OTA-BSA、AFB₁-BSA，加入OTA、AFB₁標準或樣品，再加入OTA單克隆抗體、AFB₁多克隆抗體。游離的OTA、AFB₁與微孔板上的OTA-BSA、AFB₁-BSA競爭相應(yīng)的抗體，沒有連接的抗體被洗滌除去，加入Sm³⁺-羊抗鼠抗體和Eu³⁺-羊抗兔抗體，標記免疫反應(yīng)后沒有連接的抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀分別測定銪和釤熒光強度cps，釤與銪的熒光強度分別與樣品中OTA與AFB₁濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中OTA和AFB₁的含量。本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，廉價，一次操作可以同時得到OTA和AFB₁兩個檢測結(jié)果，用于對糧食、飼料及食品的檢測。文檔編號G01N33/577GK101241131SQ20081002074公開日2008年8月13日申請日期2008年2月21日優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日發(fā)明者玨張,藝張,嵐朱,堅金,馬智鴻,飚黃申請人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所