專利名稱：一種測(cè)定赭曲霉毒素a的適配體傳感器的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種測(cè)定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構(gòu)建方法，屬于生物傳感器檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬的幾個(gè)種產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的有毒代謝產(chǎn)物，有A、B、C、D四種化合物，包括7種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對(duì)農(nóng)作物的污染最重、與人類健康關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)。主要產(chǎn)生菌是赫曲霉(Asperillus ochraceus)、純綠霉(Penicillium verrucosum),對(duì)食品污染的范圍較廣,廣泛存在于谷物、咖啡豆、豆類、葡萄·干、啤酒、葡萄汁等各類食物和飼料中，谷物及其副產(chǎn)品是OTA的主要來(lái)源。赭曲霉毒素A具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突變作用等多種毒性，對(duì)動(dòng)物和人體健康有很大的潛在危害。因此世界各國(guó)均重視對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)和控制，并制定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，以便于確保食品安全和消除國(guó)際貿(mào)易中的技術(shù)壁壘。目前，赭曲霉毒素A的殘留分析方法主要有化學(xué)分析法和免疫化學(xué)分析法。薄層層析法(TLC)的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，使用的試劑價(jià)格便宜，但是存在靈敏度較差，所需試劑繁多，檢測(cè)周期長(zhǎng)，重現(xiàn)性不好和無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)，已不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)的要求。而液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)具有靈敏度高、檢出率高等特點(diǎn)，其設(shè)備昂貴，操作繁瑣，以及長(zhǎng)時(shí)間的樣本前處理過(guò)程，導(dǎo)致檢測(cè)成本高，周期長(zhǎng)，無(wú)法滿足大批量樣本快速篩查的要求。免疫分析技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，但是高質(zhì)量抗體的制備過(guò)程需要較長(zhǎng)的周期，交叉反應(yīng)率的存在會(huì)大大影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。適配體是一類在體外篩選的能與相應(yīng)目標(biāo)物專一并緊密結(jié)合的一類單鏈寡核苷酸序列，具有熱穩(wěn)定性、可重用性和易于化學(xué)合成等優(yōu)點(diǎn)，與抗體相比具有更高的特異性和親和力，甚至能識(shí)別單抗所不能區(qū)分的靶標(biāo)分子單個(gè)取代基修飾的極細(xì)微差別。以赭曲霉毒素A的適配體代替抗體作為赭曲霉毒素A識(shí)別探針，其體外篩選、體外制備的特點(diǎn)能夠有效克服抗體制備周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、技術(shù)難度大、批間差異大、克隆株(細(xì)胞)難以有效保存的缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)是對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增的一種方法，同時(shí)可以精確靈敏的定量樣品中極微量的DNA的含量。因此，基于RT-qPCR超強(qiáng)的擴(kuò)增效應(yīng)以及定量分析，以DNA作為檢測(cè)的標(biāo)記分子，可以帶來(lái)更多的優(yōu)勢(shì)，如檢測(cè)限低、靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單以及高通量分析等。適配體高特異性高親和性結(jié)合目標(biāo)物的特征結(jié)合RT-PCR的擴(kuò)增和定量效應(yīng)，通過(guò)DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)，間接測(cè)定待檢目標(biāo)物的含量。本方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于可以實(shí)現(xiàn)赫曲霉毒素A飛克級(jí)的檢測(cè)水平，是目如實(shí)現(xiàn)赫曲霉毒素A檢測(cè)靈敏度最聞的一種方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種測(cè)定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構(gòu)建方法，該適配體生物傳感器，通過(guò)適配體的識(shí)別作用和PT-qPCR的擴(kuò)增與定量效應(yīng)，通過(guò)DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行間接檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案一種測(cè)定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構(gòu)建方法，包括鏈霉親和素包被PCR管，適配體與其部分互補(bǔ)的DNA片段雜交并固定在PCR管表面，適配體傳感器的構(gòu)建，具體步驟為
(1)鏈霉親和素包被PCR管
首先將PCR管用50 μ L質(zhì)量濃度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超純水將PCR管洗滌三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸鹽緩沖液稀釋的12. 5ng/mL的鏈霉親和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育結(jié)束后再用上述碳酸鹽緩沖液洗滌三次， 每次3min,以去除未結(jié)合的鏈霉親和素；
(2)適配體與其部分互補(bǔ)的DNA片段雜交并固定在PCR管表面
用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O雜交緩沖液將適配體和部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段分別稀釋到50nM和ΙΟΟηΜ，并將兩者以I: I的體積比充分混合，將混合液于每個(gè)PCR管加入30 μ L，并在37°C條件下孵育40min，以使互補(bǔ)雙鏈充分雜交并結(jié)合到PCR管表面；
所述單鏈DNA適配體片段和部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段序列分別為
適配體5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’，
與適配體部分互補(bǔ)的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA
TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ；
(3)適配體傳感器的構(gòu)建
在步驟(2)包被好的每個(gè)PCR管中，分別加入30 μ L 5X l(T6ng/g 5ng/g的十倍梯度稀釋的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和適配體充分結(jié)合,結(jié)合緩沖液為含 10 mM Tris, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 7. O 的緩沖液，反應(yīng)結(jié)束后，再用結(jié)合緩沖液洗滌三次，每次3min，最后將PCR管拍打干凈，以去除未結(jié)合的赭曲霉毒素A和雙鏈變性釋放出的部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段；
每個(gè)PCR管在30 μ L的體系中進(jìn)行反應(yīng)，此體系由以下反應(yīng)物質(zhì)組成各O. 6 μ L終濃度均為2 μ M的上游引物和下游引物，I. 8 μ L 20 XEvaGreen染料(購(gòu)自上海開放生物科技有限公司，上海市徐匯區(qū)田林路192號(hào))，3μ L終濃度為ImM的dNTP混合液，3 μ L 10XPCR緩沖液，O. 3 μ L濃度為5U的Taq DNA聚合酶和超純水補(bǔ)足30 μ L ;將反應(yīng)物充分混勻，最后用熒光定量PCR儀CFX-96進(jìn)行測(cè)定，擴(kuò)增條件為首先95°C預(yù)變性30s，然后95°C變性5s，57°C退火和延伸30s，總共為39個(gè)循環(huán)，得到互補(bǔ)于適配體的DNA片段的擴(kuò)增曲線；再?gòu)?5°C升溫至95°C，每O. 5°C讀取一次熒光值，使得擴(kuò)增后的雙鏈DNA變性，得到DNA熔解曲線；
上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’，
下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3 ’。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種適配體生物傳感器，通過(guò)適配體高親和結(jié)合目標(biāo)物和PT-qPCR的擴(kuò)增與定量效應(yīng)，通過(guò)DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行間接檢測(cè)。


圖I赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2互補(bǔ)于適配體的DNA片段擴(kuò)增得到的擴(kuò)增曲線。圖3擴(kuò)增后的雙鏈DNA熔解得到的熔解曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
(1)鏈霉親和素包被PCR管 首先將PCR管用50 μ L O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超純水將PCR管洗滌三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸鹽緩沖液稀釋的12. 5ng/mL的鏈霉親和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育結(jié)束后再用上述碳酸鹽緩沖液洗滌三次，每次3min,以去除未結(jié)合的鏈霉親和素；
(2)適配體與其部分互補(bǔ)的DNA片段雜交并固定在PCR管表面
用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O雜交緩沖液將適配體和部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段分別稀釋到50nM和ΙΟΟηΜ，并將兩者以I: I的體積比充分混合，將混合液于每個(gè)PCR管加入30 μ L，并在37°C條件下孵育40min，以使互補(bǔ)雙鏈充分雜交并結(jié)合到PCR管表面；
所述單鏈DNA適配體片段和部分互補(bǔ)于適配體的序列分別為
適配體5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’，
部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA
TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ；
(3)適配體傳感器的構(gòu)建
在步驟(2)包被好的每個(gè)PCR管中，分別加入30 μ L 5Χ l(T6ng/g 5ng/g的十倍梯度稀釋的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和適配體充分結(jié)合,結(jié)合緩沖液為含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的緩沖液，反應(yīng)結(jié)束后，再用結(jié)合緩沖液洗滌三次，每次3min，最后將PCR管拍打干凈，以去除未結(jié)合的赭曲霉毒素A和雙鏈變性釋放出的部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段；
每個(gè)PCR管在30 μ L的體系中進(jìn)行反應(yīng)，此體系由以下反應(yīng)物質(zhì)組成各O. 6 μ L終濃度均為2 μ M的上游引物和下游引物，I. 8 μ L 20 XEvaGreen染料(購(gòu)自上海開放生物科技有限公司，上海市徐匯區(qū)田林路192號(hào))，3μ L終濃度為ImM的dNTP混合液，3 μ L 10XPCR緩沖液，O. 3 μ L濃度為5U的Taq DNA聚合酶和超純水補(bǔ)足30 μ L ;將反應(yīng)物充分混勻，最后用熒光定量PCR儀CFX-96進(jìn)行測(cè)定，擴(kuò)增條件為首先95°C預(yù)變性30s，然后95°C變性5s, 57°C退火和延伸30s，總共為39個(gè)循環(huán)，得到互補(bǔ)于適配體的DNA片段的擴(kuò)增曲線；再?gòu)?5°C升溫至95°C，每O. 5°C讀取一次熒光值，使得擴(kuò)增后的雙鏈DNA變性，得到DNA熔解曲線；
上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’，下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。(4)檢測(cè)靈敏度研究
根據(jù)RT-qPCR擴(kuò)增得到的DNA擴(kuò)增曲線，在擴(kuò)增曲線的指數(shù)期選取合適的閾值，得到每個(gè)赭曲霉毒素A濃度下對(duì)應(yīng)的Ct值，以赭曲霉毒素A的濃度為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)做出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出赭曲霉毒素A的檢測(cè)限為lfg/g。(5)特異性研究
以玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素BI、伏馬菌素代替赭曲霉毒素A作為檢測(cè)目標(biāo)物進(jìn)行特異性研究，加入的四種毒素的濃度和上述赭曲霉毒素A的加入濃度相同，操作方法同赭曲霉毒素A檢測(cè)的操作方法一致，獲得檢測(cè)四種毒素的DNA擴(kuò)增曲線；所得每種毒素濃度下的擴(kuò)增曲線與未加入任何目標(biāo)物的空白樣的擴(kuò)增曲線位于同一個(gè)位置，Ct值沒(méi)有發(fā)生變化，從而得出檢測(cè)三聚氰胺的DNA-三聚氰胺抗體偶聯(lián)物沒(méi)有識(shí)別頭孢菌素，此方法的 特異性良好。(6)樣品添加回收研究
在IOmL陰性紅酒樣品加入O. I g聚乙烯吡咯烷酮以使紅酒樣品澄清，通過(guò)過(guò)濾去除沉淀物，將處理后的樣品稀釋10倍,分別添加5X 10_6 ng g \ 1X10_4 ng g SO. 001 ngg 1^O. 01 ng g SO. I ng g \ I ng g ng g 1水平的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，用此方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的添加回收率，最終得到的回收率范圍在99% 112%，可以用于實(shí)際樣品的測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于包括鏈霉親和素包被PCR管，適配體與其部分互補(bǔ)的DNA片段雜交并固定在PCR管表面，適配體傳感器的構(gòu)建；具體步驟為 (1)鏈霉親和素包被PCR管 首先將PCR管用50 μ L質(zhì)量濃度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超純水將PCR管洗滌三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸鹽緩沖液稀釋的12. 5ng/mL的鏈霉親和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育結(jié)束后再用上述碳酸鹽緩沖液洗滌三次，每次3min,以去除未結(jié)合的鏈霉親和素； (2)適配體與其部分互補(bǔ)的DNA片段雜交并固定在PCR管表面 用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O雜交緩沖液將適配體和部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段分別稀釋到50nM和ΙΟΟηΜ，并將兩者以I: I的體積比充分混合，將混合液于每個(gè)PCR管加入30 μ L，并在37°C條件下孵育40min，以使互補(bǔ)雙鏈充分雜交并結(jié)合到PCR管表面； 所述單鏈DNA適配體片段和部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段序列分別為 適配體5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’， 與適配體部分互補(bǔ)的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ； (3)適配體傳感器的構(gòu)建 在步驟(2)包被好的每個(gè)PCR管中，分別加入30 μ L 5Xl(T6ng/g 5 ng/g的十倍梯度稀釋的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和適配體充分結(jié)合,結(jié)合緩沖液為含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的緩沖液，反應(yīng)結(jié)束后，再用結(jié)合緩沖液洗滌三次，每次3min，最后將PCR管拍打干凈，以去除未結(jié)合的赭曲霉毒素A和雙鏈變性釋放出的部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段； 每個(gè)PCR管在30 μ L的體系中進(jìn)行反應(yīng)，此體系由以下反應(yīng)物質(zhì)組成各O. 6 μ L終濃度均為2μ M的上游引物和下游引物，I. 8μ L 20 X EvaGreen染料，3 μ L終濃度為ImM的dNTP混合液，3yL 10XPCR緩沖液，O. 3μ L濃度為5U的Taq DNA聚合酶和超純水補(bǔ)足30 μ L ;將反應(yīng)物充分混勻，最后用熒光定量PCR儀CFX-96進(jìn)行測(cè)定，擴(kuò)增條件為首先95°C預(yù)變性30s ;然后95°C變性5s、57°C退火和延伸30s，總共為39個(gè)循環(huán)；得到互補(bǔ)于適配體的DNA片段的擴(kuò)增曲線；再?gòu)?5°C升溫至95°C，每O. 5°C讀取一次熒光值，使得擴(kuò)增后的雙鏈DNA變性，得到DNA熔解曲線； 上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’， 下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。
全文摘要
一種測(cè)定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構(gòu)建方法，屬于生物傳感器檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括鏈霉親和素包被PCR管，適配體與其部分互補(bǔ)的DNA片段雜交并固定在PCR管表面，適配體傳感器的構(gòu)建。本發(fā)明提供了一種與赭曲霉毒素A高特異性高親和力結(jié)合的單鏈DNA適配體和部分互補(bǔ)于適配體的DNA片段，通過(guò)適配體與赭曲霉毒素A的識(shí)別結(jié)合，誘導(dǎo)適配體構(gòu)象的改變從而導(dǎo)致互補(bǔ)于適配體的DNA片段釋放，以互補(bǔ)于適配體的片段作為PCR擴(kuò)增模板，通過(guò)擴(kuò)增后的熒光信號(hào)對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)赭曲霉毒素A超靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限低、檢測(cè)靈敏度高、特異性好，為痕量赭曲霉毒素A以及其他有害物質(zhì)的檢測(cè)提供了一種有效的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102912020SQ20121040003
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月20日
發(fā)明者胥傳來(lái), 徐麗廣, 匡華, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊 申請(qǐng)人:江南大學(xué)