一種便攜快速檢測赭曲霉毒素a的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法。首先制備蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA。隨后將生物素-疊氮修飾DNA結(jié)合在磁珠表面，并加入不同濃度的赭曲霉毒素A混合。然后加入先前制備好的蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA、CuSO4溶液、抗壞血酸溶液。其中抗壞血酸溶液能還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化生物素-疊氮修飾DNA與蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取上層清液加入至蔗糖溶液中，蔗糖轉(zhuǎn)化酶能有效催化溶液中蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。最后采用血糖儀進(jìn)行測定。該方法有機(jī)地將點(diǎn)擊化學(xué)快速反應(yīng)的優(yōu)勢與適配體高特異性的特點(diǎn)結(jié)合起來，采用簡單便攜的血糖儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，大大降低了操作的復(fù)雜性和檢測成本，提高了靈敏度和選擇性。
【專利說明】一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素A是最普遍的食物污染毒素之一，主要是由一些曲霉菌屬和青霉菌屬真菌產(chǎn)生，而這些真菌易在谷類作物、水果、啤酒和白酒中生長繁殖。在動物體內(nèi)，赭曲霉毒素A易于被腸道吸收，容易引起腎臟和肝臟的強(qiáng)毒性，而且還具有致癌、致畸、抑制免疫力等作用。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)將赭曲霉毒素A列為一種潛在的人類致癌物。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(FA0/WH0 JECFA)指出食物間接傳遞給人類的赭曲霉毒素A中，50%是來自于谷類物質(zhì)。因此很多國家制定了赭曲霉毒素A在谷類物質(zhì)中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)，例如在未加工的谷物中，不能超過5.0 Pg/kg，在加工過的谷類物質(zhì)中，不得超過3.0 Pg/kg。隨之也涌現(xiàn)出了許多方法對赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測，如可被接受的液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、薄層色譜法，但這些方法所需儀器昂貴，耗時(shí)，而且需要專門的培訓(xùn)人員進(jìn)行操作，檢測成本高，因此在一定程度上阻礙了它們的應(yīng)用。目前一些高靈敏的免疫檢測技術(shù)也相繼報(bào)道，如酶聯(lián)免疫檢測法、電化學(xué)免疫傳感器、熒光免疫檢測技術(shù)等，然而這些方法都需要依賴于抗體、半抗原以及免疫抗原的制備，該制備過程不但復(fù)雜、耗時(shí)，而且也需要借助于大型儀器進(jìn)行檢測，不便攜帶。因此一些靈敏度高、操作簡單和成本低的方法需要被開發(fā)，例如采用適配體DNA結(jié)合技術(shù)來降低操作的復(fù)雜性。
[0003]點(diǎn)擊化學(xué)是美國化學(xué)家Sharpless首先提出的一種合成概念。它主要是基于小分子單元依賴自身的性質(zhì)快速生成新物質(zhì)而建立的一類反應(yīng)。其中Cu(I)催化疊氮與端炔基團(tuán)的環(huán)加成反應(yīng)是點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)中研究最為廣泛，也最為成熟的反應(yīng)類型之一。該類反應(yīng)速度快、立體選擇性好、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、對環(huán)境污染小，并且原料易得，所需要的反應(yīng)條件簡單、溫和，而且氧氣和水溶劑所帶來的影響較小。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡單、成本低、便于攜帶、適合現(xiàn)場檢測的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法。該方法有機(jī)地將點(diǎn)擊化學(xué)快速反應(yīng)的優(yōu)勢與適配體的高特異性特點(diǎn)結(jié)合起來，采用簡單便攜的血糖儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，大大降低了操作的復(fù)雜性和檢測成本，提高了靈敏度和選擇性。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征是:具體步驟如下:
1.按照參考文獻(xiàn)(Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters andfunctional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, NatureChemistry, 2011，3，697-703.)，釆用巰基-端炔修飾DNA、磺基-4_(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯鈉鹽、蔗糖轉(zhuǎn)化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制備蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA ；
2.將5.0 μ? 0.05 μΜ的生物素-疊氮修飾DNA、10 μ?鏈霉素修飾的磁珠一起加入至25 μ? PBS緩沖溶液(由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制的磷酸鹽緩沖溶液)中，PBS緩沖溶液的濃度為0.01 M，pH為7.3，在室溫下震蕩30分鐘，促使生物素-疊氮修飾DNA結(jié)合在磁珠表面；
3.在步驟2反應(yīng)結(jié)束后的PBS緩沖溶液中加入5.0 μ? NaCl和不同濃度的赭曲霉毒素Α，赭曲霉毒素A的濃度范圍為0.2 ng/mL~50 ng/mL，在室溫下震蕩15分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，采用磁鐵進(jìn)行第一次分離，棄去第一次上層清液，得到下層磁珠，并用PBS緩沖溶液清洗磁珠兩次，清洗結(jié)束后在磁珠中加入50 μ? PBS緩沖溶液混勻，得到含有結(jié)合在磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液；
4.取20μ?步驟3中反應(yīng)所得的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μ?步驟
I中所得的蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA溶液、5.0 μ? 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μ? 1.0 mM抗壞血酸溶液，在室溫下培育10分鐘，讓抗壞血酸還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA與磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，得到蔗糖轉(zhuǎn)化酶修飾磁珠溶液；
5.步驟4反應(yīng)結(jié)束后，對步驟4中所得到的蔗糖轉(zhuǎn)化酶修飾磁珠溶液采用磁鐵進(jìn)行第二次分離，得到第二次上層清液；取10 μ?第二次上層清液，加入至2.5 μ? 2.0 M蔗糖溶液，在室溫下反應(yīng)20分鐘，取3.0 μ?溶液至血糖儀試紙上，采用血糖儀進(jìn)行測量，繪制所測數(shù)據(jù)在不同赭曲霉毒素A濃度條件下的變化趨勢圖，根據(jù)該圖就能檢測赭曲霉毒素A的濃度。
[0006]其中:
步驟I中所述的巰基-端炔修飾DNA的`序列從5’到3’端為:5’ -炔基-AAA AAA AAAAAA-巰基-3’。
[0007]步驟2中所述的生物素-疊氮修飾DNA的序列從5’到3’端為:5’ -生物素-GATCGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-疊氮-3，。
[0008]當(dāng)溶液存在赭曲霉毒素A時(shí),赭曲霉毒素A能與生物素-疊氮修飾DNA進(jìn)行結(jié)合，引起DNA鏈構(gòu)象發(fā)生變化，促使疊氮基團(tuán)緊靠磁珠表面，并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致生物素-疊氮修飾DNA不能與蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，致使蔗糖轉(zhuǎn)化酶不能有效地結(jié)合在磁珠表面，而是處于上層清液中。因此，取第二次上層清液進(jìn)行檢測時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化酶能有效催化步驟5溶液中的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。采用血糖儀測定該反應(yīng)溶液時(shí)，數(shù)值較高。并且隨著赭曲霉毒素A濃度增加，血糖儀數(shù)值逐漸增大，達(dá)到檢測赭曲霉毒素A的目的。
[0009]本發(fā)明在0.2 ng/mL~5.0 ng/mL的濃度范圍內(nèi)對赭曲霉毒素A的檢測呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)，檢測限約為73 pg/mL，遠(yuǎn)低于赭曲霉毒素A在谷類物質(zhì)中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。此外，血糖儀試紙上的圓斑顏色隨著赭曲霉毒素A濃度的增加逐漸由黃色變?yōu)榫G色，而且能直接用肉眼觀測到該過程。
[0010]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)本發(fā)明結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)速度快的優(yōu)勢以及適配體特異性高的特點(diǎn)，大大降低了操作的復(fù)雜性，提高了靈敏度和選擇性。[0011 ] ( 2 )本發(fā)明的操作過程都是在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，容易控制。
[0012](3)本發(fā)明采用簡單、小巧的血糖儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，降低了檢測成本，而且便于攜帶，適合現(xiàn)場適時(shí)檢測。
[0013](4)本發(fā)明在用于赭曲霉毒素A的檢測過程中，能直接用肉眼觀測到試紙上的圓斑顏色隨著赭曲霉毒素A濃度的增加逐漸由黃色變?yōu)榫G色的過程，顯示出高效、簡單的優(yōu)勢。
[0014]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明的便攜快速檢測赭曲霉毒素A方法的原理示意圖；
圖2為本發(fā)明所述方法在含有和不含赭曲霉毒素A的數(shù)值變化示意圖，其中a為含有赭曲霉毒素A, b為不含赭曲霉毒素A。插入圖為相應(yīng)的試紙圓斑顏色變化,其中a顯示出綠色，b顯示出黃色。
[0015]圖3為本發(fā)明所述方法在赭曲霉毒素A濃度為0.2 ng/mL~50 ng/mL范圍內(nèi)的變化趨勢示意圖。其中I和Itl分別表示體系在含有和不含赭曲霉毒素A條件下的數(shù)值。
[0016]圖4為本發(fā)明所述方法在不同毒素條件下的變化示意圖。其中AFB1為黃曲霉毒素B1, AFM1為黃曲霉毒素M1, F-2為玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A濃度為1.0 ng/mL,其它毒素濃度為5.0 ng/mL ο
[0017]【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合實(shí)施例并對照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
`[0018]為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面通過具體的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體包括合成、性質(zhì)測定等。這些實(shí)施方式只是對本發(fā)明的說明，并不限制本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1:
一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，具體步驟如下:
1.制備蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA:首先將30 μ? 0.3 mM巰基-端炔修飾DNA (巰基-端炔修飾DNA序列從5’到3’端為:5’ -炔基-AAA AAA AAA AAA-巰基-3’)、2.0 μ?30 mM三-(2-甲酰乙基)膦(TCEP)和2.0 μ? 1.0 M PBS緩沖溶液(由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制的磷酸鹽緩沖溶液，PH為5.5)均勻混合，室溫培育1.0小時(shí)，活化巰基-端炔修飾DNA。結(jié)束后采用分子量為IOK的超濾離心管進(jìn)行分離清洗5次。其次加入1.0 mg磺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)至400 μ?20 mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)化酶溶液中，混合均勻，室溫震蕩1.0小時(shí)，用以活化蔗糖轉(zhuǎn)化酶。震蕩結(jié)束后離心除去多余不溶解的Sulfo-SMCC，上層清液采用分子量為100K的超濾離心管進(jìn)行離心清洗5次。最后將活化后的巰基-端炔修飾DNA與蔗糖轉(zhuǎn)化酶溶液混合并室溫培育48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，采用分子量為100K的超濾離心管進(jìn)行離心清洗5次，取出超濾離心管中所得的蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA溶液，溶解在500 μ?的0.01 M PBS緩沖溶液(pH為
7.3)中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
[0020]2.將5.0 μ? 0.05 μΜ的生物素-疊氮修飾DNA (生物素-疊氮修飾DNA序列從5’ 到 3’ 端為:5’ -生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-疊氮-3’)、10 μ?鏈霉素修飾的磁珠加入至25 μ? PBS緩沖溶液中，PBS緩沖溶液的濃度為0.01M，pH為7.3，在室溫下震蕩30分鐘，促使生物素-疊氮修飾DNA結(jié)合在磁珠表面。
[0021]3.在步驟2反應(yīng)結(jié)束后的PBS緩沖溶液中加入5.0 μ? NaCl和不同濃度的赭曲霉毒素 A (具體濃度分別為 0.2 ng/mL、0.5 ng/mL> 1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL),在室溫下震蕩15分鐘；反應(yīng)結(jié)束后,米用磁鐵進(jìn)行第一次分離,棄去第一次上層清液，得到下層磁珠，并用PBS緩沖溶液清洗磁珠兩次，清洗結(jié)束后在磁珠中加入50 μ?PBS緩沖溶液混勻，得到含有結(jié)合在磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液；
4.取20μ?步驟3反應(yīng)所得疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μ?步驟I中所得的蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA溶液、5.0 μ? 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μ? 1.0 mM抗壞血酸溶液，在室溫下培育10分鐘，讓抗壞血酸還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA與磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，得到蔗糖轉(zhuǎn)化酶修飾磁珠溶液；
5.步驟4反應(yīng)結(jié)束后，對步驟4中所得的蔗糖轉(zhuǎn)化酶修飾磁珠溶液采用磁鐵進(jìn)行第二次分離，得到第二次上層清液；取10 KL第二次上層清液，加入至2.5 μ? 2.0 M蔗糖溶液，在室溫下反應(yīng)20分鐘，取3.0 PL溶液至血糖儀試紙上，采用血糖儀進(jìn)行測量。繪制所測數(shù)值在不同赭曲霉毒素A濃度條件下的變化趨勢圖，根據(jù)該圖就能檢測赭曲霉毒素A的濃度。
[0022]實(shí)施例2:
一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A方法的特異性，具體步驟如下:
在與實(shí)施例1同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，用四種其它毒素來代替赭曲霉毒素A作用后分別測定四種其它毒素的血糖儀響應(yīng)值，并與赭曲霉毒素A的響應(yīng)值進(jìn)行對比，即可考察本發(fā)明所述方法的特異性。這四種毒素分別為黃曲霉毒素B1 (AFB1X黃曲霉毒素M1 (AFM1)、玉米赤霉烯酮(F-2)，使用濃度均為5.0 ng/mL。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征在于:具體步驟如下: (1)、按照參考文獻(xiàn)(Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters andfunctional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, NatureChemistry, 2011, 3，697-703.)，采用巰基-端炔修飾DNA、磺基-4_(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯鈉鹽、蔗糖轉(zhuǎn)化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制備蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA ； (2)、將5.0μ? 0.05 μΜ的生物素-疊氮修飾DNA、10 μ?鏈霉素修飾的磁珠一起加入至25 μ? PBS緩沖溶液中，PBS緩沖溶液的濃度為0.01 M，pH為7.3，在室溫下震蕩30分鐘，促使生物素-疊氮修飾DNA結(jié)合在磁珠表面； (3)、在步驟(2)反應(yīng)結(jié)束后的PBS緩沖溶液中加入5.0 μ? NaCl和不同濃度的赭曲霉毒素Α,赭曲霉毒素A的濃度范圍為0.2 ng/mL~50 ng/mL,在室溫下震蕩15分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，采用磁鐵進(jìn)行第一次分離，棄去第一次上層清液，得到下層磁珠，并用PBS緩沖溶液清洗磁珠兩次，清洗結(jié)束后在磁珠中加入50 μ? PBS緩沖溶液混勻，得到含有結(jié)合在磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液； (4)、取20PL步驟(3)反應(yīng)所得疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μ?步驟(I)所得蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA溶液、5.0 μ? 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μ? 1.0 mM抗壞血酸溶液，在室溫下培育10分鐘，讓抗壞血酸還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖轉(zhuǎn)化酶-端炔修飾DNA與磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，得到蔗糖轉(zhuǎn)化酶修飾磁珠溶液； (5)、步驟(4)反應(yīng)結(jié)束后，對步驟(4)中所得到的蔗糖轉(zhuǎn)化酶修飾磁珠溶液采用磁鐵進(jìn)行第二次分離，得到第二次上層清液；取10 KL第二次上層清液，加入至2.5 μ? 2.0 M蔗糖溶液，在室溫下反應(yīng)20分鐘，取3.0 μ?溶液至血糖儀試紙上，采用血糖儀進(jìn)行測量，繪制所測數(shù)值在不同赭曲霉毒素A濃度條件下的變化趨勢圖，根據(jù)該圖就能檢測赭曲霉毒素A的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征在于:步驟(1)中所述的巰基-端炔修飾DNA序列從5’到3’端為:5’ -炔基-AAA AAA AAA AAA-巰基-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征在于:步驟(2)中所述的生物素-疊氮修飾DNA序列從5’到3’端為:5’ -生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-疊氮-3’。
【文檔編號】G01N21/78GK103808716SQ201410005333
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】邱素艷, 羅林廣, 張金艷, 周瑤敏, 李瑞麗 申請人:江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所