一種煙曲霉素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗生素生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種從發(fā)酵液中提取抗生素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙曲霉素(Fumagillin)由煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離 得到具有多種活性的一種代謝產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
[0004] 這種物質(zhì)具有抗生素活性，又有抑制血管生成作用，從而具有對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的治療 作用。此外，煙曲霉素的一系列衍生物還具有抗擊瘧原蟲(chóng)和孢子蟲(chóng)的作用。在養(yǎng)蜂業(yè)中煙曲 霉素的是非常有效的治療西方蜜蜂孢子蟲(chóng)病(Nosema apis)的藥物，在美國(guó)和加拿大等國(guó) 家已經(jīng)使用有近60年的歷史。近些年研究顯示，煙曲霉素還是潛在減肥藥物，是治療肥胖的 有效藥物。作為一種具有多種活性的藥物，煙曲霉素在未來(lái)的使用更加廣泛。因此，建立簡(jiǎn) 單有效的煙曲霉素的提取和凈化方法，制備煙曲霉素純品，對(duì)于該藥物的深入研究和利用 有著重要的意義。
[0005] 由于煙曲霉素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，用有機(jī)合成的方法成本高，因此，目前煙曲霉素大多數(shù)從 煙曲霉素的發(fā)酵液中提取和純化獲得。之前的專利和文獻(xiàn)中主要使用液液萃取的方法來(lái)從 發(fā)酵液中提取煙曲霉素，提取過(guò)程中大量使用二氯甲烷或氯仿，叔丁醇，丙酮和乙酸乙酯等 有毒試劑，同時(shí)提取過(guò)程中大量的副產(chǎn)物比如高毒的膠霉毒素等需要經(jīng)過(guò)重結(jié)晶等方法除 去，步驟繁瑣，不易控制。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和人體健康的認(rèn)識(shí)，通過(guò)優(yōu)化提取方法，使用 低毒、低污染的方法來(lái)提取藥物成為藥物提純的趨勢(shì)。大孔樹(shù)脂提取作為一種有效的提取 方法，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到活性物質(zhì)和藥物提取和純化中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單，宜于 工業(yè)化生產(chǎn)的煙曲霉素提取方法。
[0007] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案為：
[0008] 1、一種煙曲霉素的提取方法，包括步驟：
[0009] 1)將煙曲霉素發(fā)酵液的pH值用鹽酸、硫酸、磷酸中的一種調(diào)節(jié)為1~6.5，用非極性 大孔樹(shù)脂或弱極性大孔樹(shù)脂吸附，所用大孔樹(shù)脂的孔徑為57~300人，比表面積為100~ 1200m 2/g，大孔樹(shù)脂使用前用乙醇和水活化；
[0010] 2)吸附后的樹(shù)脂置于層析柱中，用質(zhì)量濃度15~30%的乙醇水溶液清洗；
[0011] 3)用無(wú)水乙醇或質(zhì)量濃度50~98 %的乙醇水溶液洗脫樹(shù)脂，洗脫液經(jīng)濃縮和干 燥，得到煙曲霉素粗提品。
[0012] 大孔樹(shù)脂使用前的活化是用無(wú)水乙醇浸沒(méi)樹(shù)脂浸泡20~30h，再用3倍的水清洗。
[0013] 作為本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案之一，所述步驟1)中，向煙曲霉素發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為1 ~6.0，加入大孔樹(shù)脂，發(fā)酵液和大孔樹(shù)脂的體積質(zhì)量比為15~20mL: lg;;攪拌后過(guò)濾，過(guò)濾 得到的樹(shù)脂用水清洗。
[0014] 或，所述步驟1)中，將煙曲霉素發(fā)酵液離心，分離出上清液，將上清液的pH值調(diào)節(jié) 為1~6.0，活化后的樹(shù)脂置于層析柱中，上清液以0.5~3倍床層體積/小時(shí)的速度流過(guò)層析 柱。
[0015] 其中，所述層析柱的高徑比為1~10。
[0016] 進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂的型號(hào)為 D101，XAD-2，HP-20，SP825，SP850SSP700。
[0017] 其中，所述步驟2)中乙醇水溶液流過(guò)層析柱的速度為0.5~3倍床層體積/小時(shí)。 [0018]其中，所述步驟3)中無(wú)水乙醇或乙醇水溶液洗脫樹(shù)脂在層析柱中進(jìn)行，無(wú)水乙醇 或乙醇水溶液的體積為床層體積的2~4倍。
[0019]進(jìn)一步地，所述的提取方法，還包括對(duì)煙曲霉素粗提品的二次純化:煙曲霉素粗提 品按照質(zhì)量體積比40~50mg:l~2L用30%的乙醇水溶解，再次經(jīng)過(guò)裝填有大孔樹(shù)脂的層析 柱用無(wú)水乙醇或乙醇水溶液洗脫，洗脫液經(jīng)避光濃縮和干燥，得到晶體；
[0020 ]晶體按照質(zhì)量體積比40~5 Omg: 0.1~0.5mL溶于丙酮，加入煙曲霉素粗提品質(zhì)量 的0.5~1倍的環(huán)己胺，反應(yīng)10~15min后冷卻，過(guò)濾、揮干丙酮。
[0021] 其中，洗脫后的大孔樹(shù)脂用90~100%乙醇清洗后重復(fù)使用。
[0022] 本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 本發(fā)明提出的提取方法，避免了傳統(tǒng)工藝中的多種溶劑萃取、反萃等工序，操作可 靠性高且簡(jiǎn)便，生產(chǎn)過(guò)程安全無(wú)污染、資源利用率高，生產(chǎn)成本低，又有利于環(huán)境保護(hù)，是一 種綠色環(huán)保的提取煙曲霉素的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1:實(shí)施例3產(chǎn)品的檢測(cè)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例中，若無(wú)特別說(shuō)明，所使用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)的方法。
[0027] 實(shí)施例1弱極性和非極性大孔樹(shù)脂的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
[0028] 1)發(fā)酵和填充層析柱
[0029]煙曲霉（菌種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)接入50L發(fā)酵罐中發(fā)酵，在發(fā)酵42h 后，通氣12h，此時(shí)液體體積約30L。用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，將發(fā)酵液在5000rpm離心10min后， 得到上清液約28L。取SP850樹(shù)脂(之前用無(wú)水乙醇活化24h)2kg，緩慢置于層析柱中（柱直徑 10cm，柱高50cm)，加完后，加入5L水平衡。
[0030] 2)將樣液通過(guò)帶有濾紙的漏斗過(guò)濾到層析柱中，樣液以2mL/min流過(guò)樹(shù)脂，然后用 分別用5L水和30 %乙醇洗，流速控制在2~5mL/min，可以從流出液看出發(fā)酵液中的色素被 清洗，當(dāng)用30 %乙醇水洗至4L時(shí)，已無(wú)明顯有顏色液體流出，最后用5L 100 %無(wú)水乙醇洗 脫，
[0031] 3)洗脫液避光濃縮，得到黃色固體，為粗提品。本實(shí)施例中，分別選擇D101，XAD-2， HP-20，SP825，SP850，SP700來(lái)實(shí)驗(yàn)吸附和凈化能力。
[0032] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這幾類弱極性樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液有脫色和吸附煙曲霉素的能力。但凈 化和獲得的粗提品含量效果看，SP700(54. lmg)>SP825(52.8mg)>SP850(50.8mg)，這三種填 料得到的粗提品都大于50mg，純度大于81%，D101(41.2mg)，XAD-2(39.7mg)，HP-20 (42.3mg)三種填料可以獲得40mg左右，純度為80.2%的粗提品。D101，XAD-2，HP-20三種樹(shù) 脂吸附和凈化能力比SP樹(shù)脂的差，但其價(jià)格相對(duì)便宜。如果生產(chǎn)成本允許可以選擇比表面 積大的SP系列樹(shù)脂作為吸附和純化的大孔樹(shù)脂。為了降低成本一些普通的非極性的樹(shù)脂， D101，XAD-2，HP-20也可以作為使用，為了提高產(chǎn)率和凈化能力，其使用量應(yīng)該略有增加。 [0033]根據(jù)本實(shí)施例結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)采用SP系列樹(shù)脂進(jìn)行。
[0034] 實(shí)施例2樹(shù)脂和發(fā)酵液體積比的選擇：
[0035] 選擇SP 825樹(shù)脂進(jìn)行試驗(yàn)，以優(yōu)化樹(shù)脂和發(fā)酵液質(zhì)量體積比。具體如下：分別取 35mL發(fā)酵液于50mL離心管中，分別稱取活化好的樹(shù)脂10g，5g，4g，3g，2g，lg，0 · 5g，0g到離心 管中，旋轉(zhuǎn)震蕩2h，進(jìn)行靜態(tài)吸附，靜置，去除上層發(fā)酵液，用lOmL 90%乙醇解析，用液相色 譜測(cè)定。
[0036]原液中煙曲霉素的濃度為13.5mg/L，解析后通過(guò)液相色譜分析，折算成35mL體積， 計(jì)算經(jīng)不同量樹(shù)脂吸附后的煙曲霉素濃度，l〇g為13 · 3mg/L，5g為13 · 4mg/L，4g為13 · 3mg/L， 3g為13. lmg/L，2g為13.2mg/L，lg為11.2mg/L，0.5g為5.3mg/L。從結(jié)果比較來(lái)看當(dāng)樹(shù)脂(g) 和發(fā)酵液(mL)質(zhì)量體積比為1:17.