專利名稱：：一株煙曲霉及其降解咪唑乙煙酸的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株煙曲霉及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：咪唑乙煙酸，是20世紀(jì)80年代由美國氰胺(現(xiàn)為BASF)公司開發(fā)的咪唑啉酮類除草劑，是乙酰乳酸合成酶(ALQ或乙酸羥酸合成酶(AHAs)抑制劑。因其具有殺草譜廣、選擇性強(qiáng)、活性高、用量低、價格低廉、藥效良好等優(yōu)勢，被廣泛使用，目前已經(jīng)成為大豆田中最優(yōu)秀的除草劑品種之一。保守估計，每年僅在黑龍江省咪唑乙煙酸單劑年銷售約3830t，使用面積為1.33xl06hl06hm2(耿貴，黑龍江省除草劑藥害、面源污染狀況及預(yù)防對策，中國農(nóng)學(xué)通報第M卷增刊2008年11月)。咪唑乙煙酸的推薦用量為75-100g·!πΓ2(有效成分計)，在土壤中不易降解、揮發(fā)和光解，其半衰期長，殘留量大。如黑河地區(qū)土壤咪唑乙煙酸殘留含量達(dá)38μg·!^—1。研究表明微量咪唑乙煙酸即可對敏感作物造成藥害，土壤中咪唑乙煙酸含量22μg-kg-1對水稻敏感，10μg·kg-1對馬鈴薯敏感，2μg·kg-1對甜菜敏感，7μg·kg—1對油菜敏感，8μg·kg—1對番茄敏感，2μg·kg—1對洋蔥敏感，17μg·kg—1對甘藍(lán)敏感。施藥12個月內(nèi)不可種植玉米、小麥、大麥、煙草；施藥18個月內(nèi)不可種植向日葵；施藥M個月內(nèi)不可種植水稻、高粱、谷子；施藥36個月內(nèi)不可種植馬鈴薯、南瓜、西瓜、洋蔥、番茄；施藥后48個月內(nèi)不可種植甜菜、油菜、亞麻(蘇少泉.1998.長殘留除草劑對后茬作物安全性問題[J].農(nóng)藥.37(12)；耿貴，黑龍江省除草劑藥害、面源污染狀況及預(yù)防對策，中國農(nóng)學(xué)通報第M卷增刊2008年11月)。Mark等人先后證明了施用咪唑乙煙酸后，對玉米、高粱、水稻、棉花、甜菜及馬鈴薯等作物產(chǎn)生不同程度的藥害而造成其減產(chǎn)甚至絕收(MarkΜ.ect.1989.Availabilityandpersistenceofimazaquin,imazethapyrandclomazoneinsoi1[J].WeedScience.37(3)；CurranW.S.1992.Effectsoftillageandapplicationmethodonclomazone,imazaquinandimazethapypersistence[J].WeedScience.40(3)；陳.1，楊紹義.1992.普施特在土壤中活性的研究[J].雜草科學(xué).(1)；MoyerJ.R.ect.1996.ImidazolinoneeffectsonfollowingrotationalcropsinSouthernAlberta.WeedTechnology.10(1)；0'SullivanJ.1998.EffectofimazethapyrandimazamoxsoilresiduesonseveralvegetablecropsgrowninOntario[J].Canadianjournalofplantscience.78(4)；蘇少泉.1998.長殘留除草劑對后茬作物安全性問題[J].農(nóng)藥.37(12)；黃春艷，陳鐵保，王宇，黃元炬，叢林，樸德萬，孫寶宏.2005.幾種長殘留除草劑對后茬作物甜菜的影響.中國糖料(3)；趙云和，張子豐，孫利.2006.咪草煙土壤殘留對后茬水稻的影響.農(nóng)藥.45(3)；黃春艷.2009.黑龍江省農(nóng)田草害發(fā)生防治現(xiàn)狀、問題和建議.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)(3))。由此可見，咪唑乙煙酸的殘留問題已成為制約種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。所以關(guān)于如何解決咪唑乙煙酸殘留的問題，如何使其能更好的服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，己成為亟待解決的問題。研究證明微生物降解是土壤中殘留咪唑乙煙酸的主要降解途徑(蘇少泉.1998.長殘留除草劑對后茬作物安全性問題[J].農(nóng)藥.37(12))，但目前關(guān)于咪唑乙煙酸的生物降解菌研究較少，且主要集中在細(xì)菌方面。Wang等報道了從土壤中分離得到節(jié)細(xì)菌屬細(xì)菌WffX-I對咪唑乙煙酸有一定降解作用(WangX，LiuX，WangH,etal.2007.Utilizationanddegradationofimazaquinbyanaturallyoccurringisolateofarthrobactercrystallopoietes[J]·Chemospher.67(11))；龐福德通過富集得到丙酸桿菌屬、海球菌屬和酸單胞桿菌屬3株細(xì)菌對咪唑乙煙酸具有顯著的降解作用，90d時降解率分別為71.38%,67.11%和80.11%(龐福德.2007.咪唑乙煙酸降解細(xì)菌的篩選及降解特性的研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文)；丁偉等分離到1株產(chǎn)堿菌屬細(xì)菌BH-I可高效降解咪唑乙煙酸(丁偉，白鶴，程茁等.2008.咪唑乙煙酸降解菌的分離、鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學(xué).29(5))；鄭玉蓮等從咪唑乙煙酸生產(chǎn)廠的污泥和長期施用咪唑乙煙酸的土壤中篩選獲得了4株能高效降解咪唑乙煙酸的細(xì)菌zx2、zx5、zx6和zx7，它們都能以咪唑乙煙酸為唯一碳源生長，且對咪唑乙煙酸的降解率均在80%以上，其中的zx2和zx7是芽孢桿菌屬，zx5是產(chǎn)堿桿菌科，zx6是無色桿菌屬(鄭玉蓮，許景鋼，李淑芹，曹知平.2009.普施特優(yōu)勢降解菌的篩選與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.40(6))。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一株煙曲霉，該煙曲霉能夠有效降解咪唑乙煙酸，豐富了咪唑乙煙酸降解菌庫，提供了解決咪唑乙煙酸殘留藥害問題的技術(shù)支持。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一株煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2，其分類命名是煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，其微生物保藏號是CGMCCNo.3859，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏時間是2010年5月20日。本發(fā)明的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2是從黑龍江省嫩江某農(nóng)場長期施用咪唑乙煙酸的大豆田土壤中分離得到，具體分離方法為從黑龍江省嫩江某農(nóng)場長期施用咪唑乙煙酸的大豆田中取回土壤，將在多點(diǎn)取得的土壤在無菌操作臺內(nèi)混合，稱取2g，投入裝有IOOmL蒸餾水的250mL三角瓶中，無菌封口膜封口，在200r^mirT1的轉(zhuǎn)速下振蕩20min，適當(dāng)稀釋后得到稀釋液，滴加1滴該稀釋液到含有咪唑乙煙酸的馬丁氏培養(yǎng)基平板上，用三角玻璃棒涂平，倒置培養(yǎng)，選擇長勢良好的菌株，在馬丁氏培養(yǎng)基平板上劃線分離，直到獲得純菌，即為耐受咪唑乙煙酸的真菌。將分離純化的耐受咪唑乙煙酸的真菌制作成孢子懸液(IO6CFU·mL—1)，按照2%(ν/ν)的量分別加到咪唑乙煙酸濃度為200mg·Γ1的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，對照樣品為咪唑乙煙酸濃度為20(^.171的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液，在^°C，140r.mirT1搖床振蕩培養(yǎng)，篩選出降解咪唑乙煙酸能力強(qiáng)的真菌LZ2。該煙曲霉的鑒定結(jié)果具體為(1)咪唑乙煙酸降解菌LZ2的培養(yǎng)特征菌落直徑2!Bern，正面呈乳白色，致密絨毛狀，菌叢高約1mm，菌落背面中央呈黃色，四周呈白色。(2)咪唑乙煙酸降解菌LZ2的形態(tài)特征分生孢子頭為球形或半球形，直徑3μm左右，串生于孢子梗頂端，呈不同程度的淺灰色。(3)提取咪唑乙煙酸降解菌LZ2的DNA，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增及序列測定。所得測序結(jié)果在通過BLAST程序與GeneBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行序列搜索比對后，選擇親緣關(guān)系較近的菌株作為參比菌株，用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。LZ2與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的14個真菌進(jìn)行比較，其18SrDNA序列與煙曲霉(Aspergillus)的14個真菌都有較高的序列同源性，相似度也都在都達(dá)到99%。因此，結(jié)合LZ2培養(yǎng)特征和形態(tài)特征將LZ2分類為煙曲霉。本發(fā)明的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859能以咪唑乙煙酸為唯一碳源生長，并在含200mg·Γ1咪唑乙煙酸的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，降解率可達(dá)82.91%。為治理咪唑乙煙酸污染土壤和水體提供技術(shù)支持。本發(fā)明的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859能在含IOOg·kg-1咪唑乙煙酸的土壤中培養(yǎng)60天，可使咪唑乙煙酸的降解率達(dá)76.84%，遠(yuǎn)高于自然土壤中咪唑乙煙酸降解率，且使咪唑乙煙酸在土壤中降解的半衰期由自然降解的75.9天提前到30.9天，提前了48.6天。說明本發(fā)明煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859能有效加快土壤中咪唑乙煙酸的降解。圖1為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859的菌落形態(tài)圖；圖2為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859的掃描電鏡圖；(X5000)；圖3為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖4為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859降解咪唑乙煙酸的曲線圖；圖5為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859對在土壤中的咪唑乙煙酸降解后咪唑乙煙酸的殘留量隨培養(yǎng)時間的變化圖；圖6為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859在土壤中對咪唑乙煙酸的降解效果圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1本發(fā)明煙曲霉LZ2的分離1、菌株的分離從黑龍江省嫩江某農(nóng)場長期施用咪唑乙煙酸的大豆田中取回土壤，將這些土壤在無菌操作臺內(nèi)混合，稱取2g，投入裝有IOOmL蒸餾水的250mL三角瓶中，無菌封口膜封口，在200r·miiT1的轉(zhuǎn)速下振蕩20min，適當(dāng)稀釋后得到稀釋液，滴加1滴稀釋液到含有咪唑乙煙酸的馬丁氏培養(yǎng)基平板上，用三角玻璃棒涂平，倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱。7d后選擇長勢良好的菌株，分別在馬丁氏培養(yǎng)基平板上劃線分離，直到獲得純菌，即為耐受咪唑乙煙酸的真菌多株。制作上述耐受咪唑乙煙酸的真菌的孢子懸液(IO6CFU·mL—1)，按照2%(ν/ν)的量分別加到咪唑乙煙酸濃度為200mg·Γ1的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，對照為不接菌的咪唑乙煙酸濃度為200mg·Γ1的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液，280C，140r·mirT1搖床振蕩培養(yǎng)，篩選出降解咪唑乙煙酸能力強(qiáng)的真菌LZ2。2、菌株的鑒定(1)咪唑乙煙酸降解菌LZ2的培養(yǎng)特征菌落直徑2!Bern，正面呈乳白色，致密絨毛狀，菌叢高約1mm，菌落背面中央呈黃色，四周呈白色。如圖1所示。(2)咪唑乙煙酸降解菌LZ2的形態(tài)特征分生孢子頭為球形或半球形，直徑3μm左右，串生于孢子梗頂端，呈不同程度的淺灰色。如圖2所示。(3)提取咪唑乙煙酸降解菌LZ2的DNA，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增及序列測定。所得測序結(jié)果在通過BLAST程序與GeneBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行序列搜索比對后，選擇親緣關(guān)系較近的菌株作為參比菌株，用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示。LZ2與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的14個真菌進(jìn)行比較，其18SrDNA序列與煙曲霉(Aspergillus)的14個真菌都有較高的序列同源性，相似度也都在都達(dá)到99%。因此，結(jié)合LZ2培養(yǎng)特征和形態(tài)特征將LZ2分類為煙曲霉。實施例2本發(fā)明煙曲霉LZ2降解咪唑乙煙酸的應(yīng)用1、煙曲霉LZ2降解咪唑乙煙酸的實驗按照2%(ν/ν)的量將LZ2的孢子懸液(IO6CFU·mL—1)加到咪唑乙煙酸濃度為200mg·廠1的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，對照樣品為咪唑乙煙酸濃度為200mg·廠1的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液，在^°C，140r^irT1搖床振蕩培養(yǎng)。每天取樣測定咪唑乙煙酸含量并用干重法測定菌體生長量。如圖4所示。由圖4可以看出，LZ2的延滯期為3d，在此期間，LZ2對咪唑乙煙酸的降解作用很微弱；LZ2的對數(shù)生長期為第37d，這時菌株快速生長、代謝旺盛，咪唑乙煙酸的降解率也不斷提高；第7d之后生長量緩慢下降，咪唑乙煙酸的降解率趨于平穩(wěn)，變化不大。在第8d時LZ2的生長量和咪唑乙煙酸的降解率均接近最大值，菌體干重為83.5mg,咪唑乙煙酸降解率達(dá)81.3%。2、煙曲霉LZ2在土壤中降解咪唑乙煙酸的實驗試驗分為3組，每組做15個樣品，每個樣品用土100g，試驗設(shè)3次重復(fù)。3個組分別為1)空白組，不加咪唑乙煙酸的土壤100g，不加菌，只施入與LZ2處理組等體積的生理鹽水；2)自然降解組，加有咪唑乙煙酸的土壤IOOg(按每kg干土加IOOyg咪唑乙煙酸的比例加入)和LZ2處理組等體積的生理鹽水，不加菌；3)LZ2處理組，加有咪唑乙煙酸的土壤IOOg(按每kg干土加IOOyg·咪唑乙煙酸的比例加入)并加入LZ2孢子懸液以及與以上兩組等體積的生理鹽水，菌體終濃度為2.OXIO7CFU·g—1干土。調(diào)節(jié)土壤含水量為40%，記錄上述3組中調(diào)節(jié)含水量后的土樣總重量。每天稱量，加水補(bǔ)足，以保持土壤的含水量不變，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后的第1，7，15，30，60天后取樣，用生物測定法測定各組土壤中咪唑乙煙酸的殘留量(如圖5所示)，以空白組為基礎(chǔ)，求出自然降解組和LZ2處理組中咪唑乙煙酸的降解率，結(jié)果如圖6所示。由圖5可以看出，咪唑乙煙酸在土壤中的殘留量與時間符合一級動力學(xué)方程，自然降解組的咪唑乙煙酸在土壤中的自然降解動態(tài)方程為y=100.66e-°_°°88x，R2=0.9908，半衰期T172=79.5天；LZ2處理組的咪唑乙煙酸在土壤中的降解動態(tài)方程為y=103.05e_°_°234x，R2=0.9653，半衰期T1/2=30.9天；較自然降解組的半衰期提前48.6天。由圖6可以看出，煙曲霉LZ2在含100μg-kg"1咪唑乙煙酸的土壤中培養(yǎng)60天，可使咪唑乙煙酸的降解率達(dá)76.84%，遠(yuǎn)高于自然土壤中咪唑乙煙酸降解率。說明LZ2能有效加快土壤中咪唑乙煙酸的降解。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，對本發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2，其保藏號為CGMCCNo.3859。2.煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859在降解咪唑乙煙酸中的應(yīng)用。3.煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859在生物凈化受咪唑乙煙酸污染的土壤或水體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種煙曲霉及其應(yīng)用。本發(fā)明煙曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2的保藏號為CGMCCNo.3859。本發(fā)明煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859能以咪唑乙煙酸為唯一碳源生長，并且其在含200mg·L-1咪唑乙煙酸的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，可使咪唑乙煙酸的降解率達(dá)82.91％，為治理咪唑乙煙酸污染土壤和水體提供技術(shù)支持。同時該煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859在含100μg·kg-1咪唑乙煙酸的土壤中培養(yǎng)60天，可使咪唑乙煙酸的降解率達(dá)76.84％，遠(yuǎn)高于自然土壤中咪唑乙煙酸降解率，且使咪唑乙煙酸在土壤中降解的半衰期由自然降解的75.9天提前到30.9天，提前了48.6天。本發(fā)明煙曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859能有效加快土壤中咪唑乙煙酸的降解。文檔編號C02F3/34GK102329734SQ201010223818公開日2012年1月25日申請日期2010年7月12日優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日發(fā)明者曹知平,李淑芹,許井鋼申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)