子（AFBp AFG^ AFM^ ZEA)結(jié)合，說(shuō)明本發(fā)明適配體生物傳感器具有很好的特異性。
[0027] 應(yīng)用本發(fā)明方法檢測(cè)嬰幼兒米粉和羊草中赭曲霉毒素 A，結(jié)果赭曲霉毒素 A的回 收率保持在84% -122%之間。
[0028] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0029] 本發(fā)明開發(fā)了一種適配體生物傳感器結(jié)合血糖儀定量檢測(cè)赭曲霉毒素 A的方法。 本發(fā)明適配體生物傳感器通過其適配體特異性的識(shí)別赭曲霉毒素 A，釋放生物傳感器上結(jié) 合的蔗糖酶分子到溶液中，蔗糖酶能夠高效的水解蔗糖為葡萄糖，從而通過血糖儀進(jìn)行定 量檢測(cè)。該方法具有操作簡(jiǎn)便，檢出限低，特異性好，重復(fù)再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，為食品和飼料中 赭曲霉毒素 A的定量檢測(cè)提供了一種新方法，具有良好的應(yīng)用前景。
[0030] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)宙義
[0031] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0032] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類似物，其包 括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn)并 密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以 上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn) 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))〇
[0033] 術(shù)語(yǔ)"適配體"意指一種經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的寡核苷酸序列（RNA或DNA)，與相 應(yīng)的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力，大小一般約6-40kDa。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為適配體生物傳感器的原理圖；
[0035] 圖2為血糖儀檢測(cè)緩沖液中赭曲霉毒素 A以及血糖儀信號(hào)值與赭曲霉毒素 A濃度 的線性關(guān)系；
[0036] 圖3為血糖儀檢測(cè)不同類型的霉菌毒素；其中，對(duì)照組：沒有霉菌毒素；MIXl組： AFBn AFGp AFMjP ZEA ;MIX2 組：AFB p AFGn AFMn OTA 和 ZEA ;
[0037] 圖4為DNA-蔗糖酶固定的磁球與赭曲霉毒素 A不同孵育時(shí)間對(duì)應(yīng)的血糖儀信號(hào) 值；
[0038] 圖5為釋放出的DNA-蔗糖酶與蔗糖溶液不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)應(yīng)的血糖儀信號(hào)值。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040] 1、材料與儀器
[0041 ] Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)、Invertase (鹿糖酶）、 Sucrose (鹿糖），來(lái)自 Sigma 公司；Amicon_3K、Amicon-IOOK，來(lái)自 Millipore 公司；sul fosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(sulf〇-SMCC), 來(lái)自Thermofisher公司；鏈霉親和素修飾的磁球（直徑I μπι)、磁分離器，來(lái)自Bangs Laboratories, Inc.公司；赭曲霉毒素 A(OTA)標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；血糖儀及試 紙條，來(lái)自羅氏ACQJ-CHEK Avia;超純水，來(lái)自Millipore Advantage AlO純水系統(tǒng)；恒溫 混勾儀，來(lái)自愛本德Thermomixer comfort型號(hào)；基因漩禍混勾器，來(lái)自IKA品牌；落地高速 冷凍離心機(jī)，來(lái)自HITACHI CR22G111型號(hào)；
[0042] 緩沖液A (0· IM氯化鈉，0· IM磷酸鈉 ，pH = 7. 3);
[0043] 緩沖液B (0· IM氯化鈉 ，(λ IM磷酸鈉 ，pH = 7. 3, (λ 05%吐溫-20 (質(zhì)量比））；
[0044] OTA aptamer及互補(bǔ)DNA，生工生物工程（上海）有限公司合成。所述互補(bǔ)DNA的 3'端進(jìn)行巰基修飾；所述赭曲霉毒素 A的適配體的3'端進(jìn)行生物素修飾。
[0045] 實(shí)施例1適配體生物傳感器的合成以及結(jié)合血糖儀檢測(cè)赭曲霉毒素 A
[0046] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0047] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0048] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0049] 取 400 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)與 Img sulfo-SMCC 混合，禍旋震蕩 5min， 放置恒溫混勻儀上，室溫反應(yīng)2h。
[0050] I. I. 2DNA分子的活化
[0051] 取 100 μ 1 100 μΜ S#DNA(thiol-DNA，5'-CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-SH-3'），2 μ I 0· IM buffer Β，2 μ 130mM TCEP(超純水）加入到 I. 5ml 離心管中，渦旋混 勻，放置恒溫混勻儀上，室溫反應(yīng)Ih(其中，①互補(bǔ)DNA的處理：將合成的固體DNA(4°C， 12000rcf，5min)離心，按要求加入345 μ 1超純水，輕微渦旋混勻，得到345 μ 1 100 μ M的 DNA溶液；②TCEP的配制：TCEP分子量286. 65,稱量8. 59mg，溶于Iml的超純水，得到Iml 30mM TCEP 溶液）。
[0052] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0053] 將蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反應(yīng)溶液離心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分別加入到超濾管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，離心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗滌8次；將8次離心洗滌后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分別從超濾管中吸出，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，渦旋混勻，室溫放置恒溫混勻儀 上反應(yīng)48h。
[0054] I. 2DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0055] I. 2. 1 磁球和 OTA aptamer 的鏈接
[0056] 取Iml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球（MBs)放置磁分離器上至完全澄清，吸除上 清液，用 buffer B 洗滌 2 次；取 60 μ 1 0· ImM OTA aptamer (5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAG GGAGCATCGGAAAAAAAAA AAA-biotin-3'）（超純水）加入到磁球溶液中，輕微渦旋混勻，放置 恒溫混勾儀上，室溫反應(yīng)Ih，用buffer B洗滌3次。
[0057] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗滌
[0058] 將 48h 反應(yīng)后的 DNA-蔗糖酶用超過濾器 Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)離 心，用buffer A洗滌8次。
[0059] I. 2. 3DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0060] 將洗滌后的DNA-蔗糖酶溶液轉(zhuǎn)移到磁球-aptamer溶液中，渦旋混勻，放 置恒溫混勻儀上，室溫反應(yīng)lh，用buffer B洗滌3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶 聚合物（Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成的適配體生物傳感器系統(tǒng)。將合成的 Invertase-DNA-apt-MBs均勾分散在Iml buffer B中，每份取60 μ 1用于下一步的檢測(cè)。
[0061] 1. 3結(jié)合血糖儀檢測(cè)緩沖液中的赭曲霉毒素 A
[0062] 取 20 μ 1 不同濃度（0、1、2、4、6· 25、12· 5、25、50、100、200 μΜ)的 0TA(buffer Β) 溶液加入到一份Invertase-DNA-apt-MBs溶液中（用磁分離器去除buffer)，輕微禍旋混 勻，充分反應(yīng)Ih (MBs的濃度約3mg/ml);將上述反應(yīng)后的MBs溶液，用磁分離器分離，吸取 10 μ 1上清液，加入到5 μ I 2M Sucrose(buffer B)離心管中，禍旋混勾，室溫反應(yīng)30min ; 取5 μ 1反應(yīng)后溶液用血糖儀檢測(cè)。
[0063] 1.4檢出限的測(cè)定
[0064] 用緩沖液B將OTA的濃度稀釋為0、0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、2、4μΜ，分別與一 份Invertase-DNA-apt-MBs反應(yīng)（用磁分離器去除buffer)，輕微禍旋混勾，充分反應(yīng) lh。將上述反應(yīng)后的MBs溶液，用磁分離器分離，吸取10μ1上清液，加入到5μ1 2M Sucrose (buffer Β)離心管中，禍旋混勾，室溫反應(yīng)30min。取5 μ 1反應(yīng)后溶液用血糖儀檢 測(cè)。
[0065] 1. 5特異性分析
[0066] 為了評(píng)價(jià)所開發(fā)的適配體生物傳感器的選擇性，選擇了一個(gè)對(duì)照組和4種霉菌毒 素（AFBi、AFM^ AFGp ΖΕΑ)進(jìn)行了檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)的霉菌毒素濃度為lppm。檢測(cè)步驟與上 述緩沖液中OTA的檢測(cè)步驟相同。對(duì)照組：沒有霉菌毒素；MIXl組:AFB 1 JFG1JFMdP ZEA ; MIX2組：AFB^ AFG^ AFM^ OTA和ZEA ;通過三次平行樣品的檢測(cè)獲得誤差線。
[0067] 1. 6數(shù)據(jù)分析
[0068] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，圖表采用Adobe Illustrator CS5和 0rigin8. 0進(jìn)行作圖分析。
[0069] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0070] 2. 1適配體生物傳感器的原理
[0071] 適配體生物傳感器的原理如圖