一種枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)性強啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種啟動子、一種表達(dá)載體、一種 重組菌株、一種制備重組菌株的方法、一種利用枯草芽孢桿菌提高表面活性素產(chǎn)量的方法 和一種制備所述啟動子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 任何一段能夠獨立與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列都可以被稱為啟動子。 在啟動子中，能夠被σ因子識別的區(qū)域具有非常保守的序列特征。其中，在轉(zhuǎn)錄起始位點 (+1)上游大約IOnt以及35nt處的兩段序列（稱為-10區(qū)與-35區(qū)）對于σ因子的識別 具有決定性的作用，因此這兩段序列也被稱作狹義啟動子或核心啟動子。除這段核心啟動 子區(qū)域之外，-35區(qū)的上游序列也可能對轉(zhuǎn)錄的強度產(chǎn)生影響，這些序列被稱作UP元件（UP element)〇
[0003] 為了獲得所需要的目的基因表達(dá)量，通常有兩種思路進(jìn)行啟動子的遺傳改造。一 種方式是對目的基因本身的啟動子進(jìn)行突變改造，從而提高啟動子的活性。另一種方式是 將原有的啟動子替換成其他的天然或人工構(gòu)建的啟動子，從而徹底改變下游基因的表達(dá) 譜，實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄水平的人為控制。
[0004] 在啟動子替換方面，關(guān)鍵的工作在于目標(biāo)啟動子的選擇。從來源分，可供利用的 啟動子系統(tǒng)包括內(nèi)源啟動子與外源啟動子。內(nèi)源啟動子是指宿主物種自身或近源物種的 啟動子。例如對于枯草芽孢桿菌，提高目的基因表達(dá)量最常用的就是內(nèi)源啟動子P43。P43 是枯草芽孢桿菌胞嘧啶/脫氧胞嘧啶脫氨酶基因的啟動子，屬于組成型強啟動子。Yang等 (2013)從B. Iicheniformis基因組中篩選到了啟動子PluxS，將這一啟動子與枯草芽孢桿 菌Papr的-10區(qū)結(jié)合，得到的雜合啟動子PlapS進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)錄活性。此外，淀粉酶啟 動子PamyE、堿性蛋白酶啟動子PaprE、蘇云金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白基因啟動子Pcry3Aa 等也都在枯草芽孢桿菌表達(dá)外源基因的過程中得到了一定程度的應(yīng)用。外源啟動子主要包 括噬菌體啟動子以及人工構(gòu)建的具有某種特性（例如誘導(dǎo)表達(dá)）的雜合啟動子?？莶菅挎?桿菌基礎(chǔ)研究中最常用的誘導(dǎo)型啟動子是來自枯草芽孢桿菌噬菌體SP0-1的Pspac。Pspac 將大腸桿菌阻遏蛋白基因 IacI-IacO操縱子與噬菌體SP0-1啟動子結(jié)合，能夠通過IPTG誘 導(dǎo)下游基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。Chen等（2010)將大腸桿菌T7噬菌體RNA聚合酶與啟 動子系統(tǒng)引入枯草芽孢桿菌，成功的表達(dá)了異源分泌蛋白。啟動子替換方法的優(yōu)勢在于目 的性強，通過在一系列已知特性的啟動子中選擇最適合目的基因表達(dá)水平與表達(dá)條件的 啟動子，能夠大大減少篩選所耗費的精力。
[0005] 脂肽屬于次級代謝產(chǎn)物，包括表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等多個家族。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。
[0007] 本發(fā)明是基于發(fā)明人下列問題的發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0008] 脂肽合成酶基因的表達(dá)量較低，因此需要對脂肽合成酶基因的啟動子加以改造或 將其替換為活性較強的啟動子，以提高脂肽產(chǎn)量。
[0009] 為此，本發(fā)明提出了一種枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)型強啟動子，用于在枯草芽孢桿菌中 高表達(dá)表面活性素，具有枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)型強啟動子的枯草芽孢桿菌的表面活性素?fù)u瓶 產(chǎn)量高達(dá)9. 74g/L，是相同培養(yǎng)條件下野生菌株的17. 7倍。
[0010] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述啟動 子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
[0011] AGCACTCTTTCCACTATCCCTACAGTGTTATGGCTTGAACAATCACGAAACAATAATTGGTACGTACGA TCTTTCAGCCGACTCAAACATCAAATCTTACAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTACATATGTAAGATTTAAATGCAAC CGTTTTTTCGGAAGGAAATGATGACCTCGTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTATTGTAACATAATCGGTAC GGGGGTGAAAAAGCTAACGGAAAAGGGAGCGGAAAAGAATGATGTAAGCGTGAAAAATTTTTTATCTTATCACTTGA CATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO ：1)〇
[0012] 在本發(fā)明中，所述啟動子被稱為Pg3。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述啟動子為誘導(dǎo)型 強啟動子，誘導(dǎo)劑為異丙基β-D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG)，可在IPTG誘導(dǎo)下強啟動 目標(biāo)蛋白基因的表達(dá)。
[0013] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述表 達(dá)載體包括前面所述的啟動子。包含前面所述的誘導(dǎo)型強啟動子的表達(dá)載體，可以高表達(dá) 目標(biāo)蛋白基因。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述表達(dá)載體還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征至少之
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括目的基因，所述目的基因與所述 啟動子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述啟動子可在IPTG誘導(dǎo)下強啟動目標(biāo)蛋 白基因的表達(dá)，當(dāng)所述目的基因與所述啟動子可操作的地連接，所述目的基因在IPTG誘導(dǎo) 下，表達(dá)量顯著提高。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目的基因具有SEQ ID NO :2或3所示的核苷酸序列。
[0017] ATGGAAATAACTTTTTACCCTTTAACGGATGCACAAAAACGAATTTGGTACACAGAAAAATTTTATCCT CACACGAGCATTTCAAATCTTGCGGGGATTGGTAAGCTGGTTTCAGCTGATGCGATTGATTATGTGCTTGTTGAGCA GGCGATTCAAGAGTTTATTCGCAGAAATGACGCCATGCGCCTTCGGTTGCGGCTAGATGAAAACGGGGAGCCTGTTC AATATATTAGCGAGTATCGGCCTGTTGATATAAAACATACTGACACTACTGAAGATCCGAATGCGATAGAGTTTATT TCACAATGGAGCCGGGAGGAAACGAAGAAACCTTTGCCGCTATACGATTGTGATTTGTTCCGTTTTTCCTTGTTCAC CATAAAGGAAAATGAAGTGTGGTTTTACGCAAATGTTCATCACGTGATTTCTGATGGTATCTCCATGAATATTCTCG GGAATGCGATCATGCACATTTATTTAGAATTAGCCAGCGGCTCAGAGACAAAAGAAGGAATCTCGCATTCATTTATC GATCATGTTTTATCTGAACAGGAATATGCTCAATCGAAGCGGTTTGAAAAGGACAAGGCGTTTTGGAACAAACAATT TGAATCGGTGCCTGAACTTGTTTCCTTGAAACGGAATGCATCCGCAGGGGGAAGTTTAGATGCTGAGAGGTTCTCTA AAGATGTGCCTGAAGCGCTTCATCAGCAGATTCTGTCGTTTTGTGAGGCGAATAAAGTCAGTGTTCTTTCGGTATTT CAATCGCTGCTCGCCGCCTATTTGTACAGGGTCAGCGGCCAGAATGATGTTGTGACGGGAACATTTATGGGCAACCG GACAAATGCGAAAGAGAAGCAGATGCTTGGCATGTTTGTTTCTACGGTTCCGCTTCGGACAAACATTGACGGCGGGC AGGCGTTTTCAGAATTTGTCAAAGACCGGATGAAGGATCTGATGAAGACACTTCGCCACCAAAAGTATCCGTATAAT CTCCTAATCAACGATTTGCGTGAAACAAAGAGCTCTCTGACCAAGCTGTTCACGGTTTCTCTTGAATATCAAGTGAT GCAGTGGCAGAAAGAAGAGGATCTTGCCTTTTTGACTGAGCCGATTTTCAGCGGCAGCGGATTAAATGATGTCTCAA TTCATGTAAAGGATCGATGGGATACTGGGAAACTCACCATAGATTTTGATTACCGCACTGATTTATTTTCACGTGAA GAAATCAACATGATTTGTGAGCGCATGATTACCATGCTGGAGAACGCGTTAACGCATCCAGAACATACAATTGATGA ATTAACACTGATTTCTGATGCGGAGAAAGAGAAGCTGCTTGCGAGGGCCGGCGGTAAATCTGTGAGCTACCGTAAGG ACATGACGATACCAGAGCTGTTCCAAGAAAAGGCTGAACTGCTTTCTGATCATCCAGCGGTTGTATTTGAAGATCGC ACATTGTCCTATCGAACGTTACATGAGCAATCTGCACGCATCGCCAATGTGCTGAAACAGAAAGGGGTTGGCCCGGA CAGTCCTGTCGCGGTTTTGATTGAACGCTCTGAACGGATGATTACAGCTATCATGGGAATTTTAAAAGCCGGCGGAG CCTATGTGCCGATTGATCCGGGTTTTCCTGCTGAGCGCATTCAATATATTTTGGAGGACTGCGGGGCGGATTTCATC CTGACTGAATCGAAGGTTGCGGCGCCTGAAGCCGATGCTGAGCTGATTGACTTAGATCAGGCGATTGAGGAAGGTGC AGAAGAAAGCCTGAATGCAGATGTGAACGCTCGGAACC TTGCCTACATTATTTACACATCGGGAACAACCGGACGC CCGAAAGGCGTTATGATCGAGCATCGCCAGGTTCATCATTTGGTTGAATCTCTGCAGCAGACGATTTATCAAAGCGG CAGCCAAACCCTGCGGATGGCATTGCTTGCGCCGTTCCACTTTGATGCGTCAGTGAAGCAGATCTTCGCGTCGCTTC TTTTGGGCCAAACCCTTTATATCGTACCGAAGAAAACAGTGACGAACGGGGCCGCCCTTACTGCATATTATCGGAAG AACAGCATTGAGGCGACGGACGGAACACCGGCTCATTTGCAAATGCTGGCAGCAGCAGGCGATTTTGAAGGCCTAAA ACTGAAGCACATGCTGATCGGAGGAGAAGGCCTGTCATCTGTTGTTGCGGACAAGCTGCTGAAGCTGTTTAAAGAAG CCGGCACAGCGCCGCGTTTGACTAATGTGTACGGGCCGACTGAAACGTGCGTTGACGCGTCTGTTCATCCGGTTATC CCTGAGAATGCAGTTCAATCAGCGTATGTGCCGATCGGGAAAGCGCTGGGGAATAACCGCTTATATATTTTGGATCA AAAAGGCCGGCTGCAGCCTGAAGGCGTGGCGGGTGAGCTTTATATCGCGGGAGACGGTGTGGGCCGAGGCTATTTAC ATTTGCCTGAATTAACGGAAGAGAAGTTTTTACAAGATCCATTCGTGCCGGGCGATCGCATGTACCGG