本發(fā)明涉及一種分子印跡聚合物的制備方法，特別是一種黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素(aft)在1993年就已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(who)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為i類致癌物。在天然污染的食品和飼料中以黃曲霉毒素b1(afb1)最為常見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，不僅給社會(huì)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的健康。世界各國(guó)及地區(qū)均制定了嚴(yán)格的aft限量標(biāo)準(zhǔn)，且限量要求日益嚴(yán)格。目前黃曲霉毒素的檢測(cè)方法有薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測(cè)定法、免疫親和層析柱-高效液相色譜法、免疫親和層析柱-熒光光度法等。目前免疫親和層析柱-高效液相色譜法和免疫親和層析柱-熒光光度法，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb/t18979-2003所采用。然而，免疫親和柱所需的抗體制備不易，且質(zhì)量穩(wěn)定性與產(chǎn)品穩(wěn)定性都難以控制。

分子印跡聚合物是一類以小分子化合物為模板，通過物理包埋和化學(xué)聚合而制備的新型功能材料。分子印跡的制備理念與抗原抗體的親和原理非常接近。由于分子印跡聚合物可選擇的聚合單體具有化學(xué)多樣性、能夠充分預(yù)測(cè)最終聚合物的結(jié)構(gòu)和功能屬性，該聚合物通常都選擇結(jié)構(gòu)上沒有活潑基團(tuán)的單體，因此具有熱穩(wěn)定性好和使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。由于其聚合過程中包埋了分子印跡，而聚合物的化學(xué)穩(wěn)定性導(dǎo)致分子印跡能夠非常穩(wěn)定的保持下去。因此，分子印跡聚合物可以作為高靈敏度的物理吸附劑廣泛應(yīng)用于生物、藥品和食品等樣品處理及檢測(cè)等方面。

殼聚糖作為一種廉價(jià)易得的生物高分子材料已經(jīng)被應(yīng)用于分子印跡的研究之中。殼聚糖分子中具有氨基和羥基，因此改性的方式多，反應(yīng)靈活。然而，如何利用殼聚糖上的活性基團(tuán)，制備出特異性的分子印跡是一個(gè)研究難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備方法，為現(xiàn)有黃曲霉素b1檢測(cè)方法提供了全新的思路，利用針對(duì)黃曲霉素b1的分子印跡聚合物作為吸附劑，對(duì)樣品中的黃曲霉素b1的含量進(jìn)行檢測(cè)，具有操作方便，聚合物可做到無限次回收套用，對(duì)于黃曲霉素b1的檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備方法，利用單醛對(duì)殼聚糖進(jìn)行預(yù)交聯(lián)，所得的預(yù)交聯(lián)殼聚糖與甲基環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)得到殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物；殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物與黃曲霉素b1混合后，進(jìn)行聚合；然后通過對(duì)包埋了黃曲霉素b1的殼聚糖環(huán)氧樹脂進(jìn)行物理、化學(xué)清洗，最終得到殼聚糖環(huán)氧樹脂，用殼聚糖環(huán)氧樹脂即可快速檢測(cè)出黃曲霉素b1。

本發(fā)明利用親水性殼聚糖作為聚合單體，首先用單醛封閉殼聚糖上的氨基反應(yīng)位點(diǎn)，能夠完美的控制殼聚糖中氨基的活性，從而使與甲基環(huán)氧氯丙烷的反應(yīng)位點(diǎn)控制在殼聚糖上的羥基位置，同時(shí)也保證了殼聚糖環(huán)氧樹脂與黃曲霉素b1不會(huì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合；單醛上的烷基鏈以及環(huán)氧基的聚合反應(yīng)發(fā)生后產(chǎn)生的結(jié)合態(tài)氧為黃曲霉素b1提供了良好的極性與非極性環(huán)境。

本發(fā)明提供的一種黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備方法，具體的制備步驟如下：

1)殼聚糖預(yù)交聯(lián)步驟如下：

將一定量的殼聚糖溶于乙酸水溶液，置于裝有攪拌器及溫度計(jì)的500ml三口燒瓶中；加入液體石蠟，啟動(dòng)攪拌器，常溫下攪拌10min后升溫到50℃，滴加適量的乳化劑，乳化10min，然后升溫到60℃，滴加一定量的單醛，攪拌反應(yīng)3h；冷卻，加入水溶性溶劑幫助沉淀，過濾，濾餅用不溶于水的溶劑洗滌三次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物。

其中，所述的殼聚糖交聯(lián)所用的乳化劑為span60、吐溫80、卵磷脂、大豆磷脂中的一種或幾種，優(yōu)選為span60、吐溫80或卵磷脂；所述的殼聚糖交聯(lián)所用的單醛為碳鏈長(zhǎng)度1-5的單醛，優(yōu)選為甲醛、乙醛或丙醛；所述水溶性溶劑為碳鏈長(zhǎng)1-5的短鏈醇、丙酮，優(yōu)選為甲醇、乙醇或丙酮；所述的不溶于水的溶劑為乙醚、沸點(diǎn)30-60的石油醚、沸點(diǎn)60-90的石油醚、正己烷、環(huán)己烷，優(yōu)選為石油醚、正己烷或環(huán)己烷。

2)殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物步驟如下：

將步驟1)得到的殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物分散于適量活化劑中，升溫到90℃，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應(yīng)體系的溶劑蒸干，將蒸干剩余物溶于不溶于水的溶劑中，以恒壓滴液漏斗緩慢滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.5％的氫氧化鈉水溶液，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢用水洗至中性，得到殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液。

其中，所述的活化劑為甲基環(huán)氧氯丙烷；所述的不溶于水的溶劑為正己烷、環(huán)己烷、苯、甲苯、乙苯，優(yōu)選為甲苯、乙苯或正己烷。

3)黃曲霉素b1分子印跡聚合物步驟如下：

取黃曲霉素b1加入步驟2)得到的殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液中，0℃條件下以恒壓滴液漏斗緩慢滴加固化劑，反應(yīng)2h，將反應(yīng)液分散于不溶于水的溶劑中，得到的固體沉降，過濾，用溶于水的溶劑洗滌三次，干燥，最終得到黃曲霉素b1分子印跡聚合物。

其中，所述的固化劑為乙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、二乙氨基丙胺、順丁烯二酸酐、鄰苯二甲酸酐，三氟化硼乙醚溶液(cas:109-63-7，市售)；優(yōu)選為三氟化硼乙醚溶液、己二胺或順丁烯二酸酐；所述的不溶于水的溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、乙酸乙酯、正己烷、環(huán)己烷，優(yōu)選為二氯甲烷、正己烷或二氯乙烷；所述的溶于水的溶劑為碳鏈長(zhǎng)1-5的短鏈醇、丙酮，優(yōu)選為甲醇、乙醇或丙醇。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：

(1)本發(fā)明提供的黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備方法，利用親水性殼聚糖作為聚合單體。a)首先用單醛封閉殼聚糖上的氨基反應(yīng)位點(diǎn)，保證了殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物的順利合成；b)用單醛封閉殼聚糖上的氨基反應(yīng)位點(diǎn)，保證了殼聚糖環(huán)氧樹脂與黃曲霉素b1不會(huì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合；c)單醛上的烷基鏈為黃曲霉素b1中的疏水基團(tuán)提供了完美的疏水環(huán)境，使得殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物與黃曲霉素b1具有良好的親附性；d)環(huán)氧基的聚合反應(yīng)發(fā)生后產(chǎn)生的結(jié)合態(tài)氧為黃曲霉素b1提供了良好的極性環(huán)境。

(2)采用本發(fā)明提供的方法制備黃曲霉素b1分子印跡聚合物，可快速檢測(cè)出黃曲霉素b1，且黃曲霉素b1的回收率高達(dá)98.5％，該分子印跡化合物使用壽命長(zhǎng)，經(jīng)過脫附洗滌可重復(fù)利用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1殼聚糖的預(yù)交聯(lián)化學(xué)反應(yīng)圖。

圖2為實(shí)施例1殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物化學(xué)反應(yīng)圖。

圖3為黃曲霉素b1分子印跡聚合物化學(xué)反應(yīng)示意圖。

圖4為殼聚糖、實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3化合物的紅外譜圖，其中a為殼聚糖、b為實(shí)施例1的分子印跡聚合物、c為實(shí)施例2的分子印跡聚合物、d為實(shí)施例3的分子印跡聚合物。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚明白本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

1)殼聚糖的預(yù)交聯(lián)：

將2.02g殼聚糖溶于200ml2％乙酸水溶液，置于裝有攪拌器及溫度計(jì)的500ml三口燒瓶中。加入200ml液體石蠟，啟動(dòng)攪拌器，常溫下攪拌10min后升溫到50℃，滴加3mlspan60，乳化10min，然后升溫到60℃，滴加5.8g的甲醛，攪拌反應(yīng)3h。冷卻，加入200ml丙酮幫助沉淀，過濾，濾餅用100ml石油醚洗滌三次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物。

2)殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物的制備：

將步驟1)得到的殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物分散于30ml甲基環(huán)氧氯丙烷中，升溫到90℃，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應(yīng)體系的溶劑蒸干，將蒸干剩余物溶于50ml甲苯，以恒壓滴液漏斗緩慢滴加2.8g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.5％的氫氧化鈉水溶液，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢用水洗至中性，得到殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液。

3)黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備：

取1.8g黃曲霉素b1加入步驟2)得到的殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液中。0℃條件下以恒壓滴液漏斗緩慢滴加1.5ml三氟化硼/乙醚溶液，反應(yīng)2h，將反應(yīng)液分散于100ml二氯甲烷中，得到的固體沉降，過濾，用100ml乙醇洗滌三次，干燥，最終得到黃曲霉素b1分子印跡聚合物。

實(shí)施例2

1)殼聚糖的預(yù)交聯(lián)：

將2.02g殼聚糖溶于200ml2％乙酸水溶液，置于裝有攪拌器及溫度計(jì)的500ml三口燒瓶中。加入200ml液體石蠟，啟動(dòng)攪拌器，常溫下攪拌10min后升溫到50℃，滴加3ml吐溫80，乳化10min，然后升溫到60℃，滴加7.5g的乙醛，攪拌反應(yīng)3h。冷卻，加入200ml甲醇幫助沉淀，過濾，濾餅用100ml正己烷洗滌三次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物。

2)殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物的制備：

將步驟1)得到的殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物分散于30ml甲基環(huán)氧氯丙烷中，升溫到90℃，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應(yīng)體系的溶劑蒸干，將蒸干剩余物溶于50ml乙苯，以恒壓滴液漏斗緩慢滴加2.9g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.5％的氫氧化鈉水溶液，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢用水洗至中性，得到殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液。

3)黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備：

取1.8g黃曲霉素b1加入步驟2)得到的殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液中。0℃條件下以恒壓滴液漏斗緩慢滴加1.5ml乙二胺，反應(yīng)2h，將反應(yīng)液分散于100ml正己烷中，得到的固體沉降，過濾，用100ml甲醇洗滌三次，干燥，最終得到黃曲霉素b1分子印跡聚合物。

實(shí)施例3

1)殼聚糖的預(yù)交聯(lián)：

將2.02g殼聚糖溶于200ml2％乙酸水溶液，置于裝有攪拌器及溫度計(jì)的500ml三口燒瓶中。加入200ml液體石蠟，啟動(dòng)攪拌器，常溫下攪拌10min后升溫到50℃，加入3.5g卵磷脂，乳化10min，然后升溫到60℃，滴加9.4g的丙醛，攪拌反應(yīng)3h。冷卻，加入200ml乙醇幫助沉淀，過濾，濾餅用100ml環(huán)己烷洗滌三次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物。

2)殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物的制備：

將步驟1)得到的殼聚糖預(yù)交聯(lián)產(chǎn)物分散于30ml甲基環(huán)氧氯丙烷中，升溫到90℃，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應(yīng)體系的溶劑蒸干，將蒸干剩余物溶于50ml正己烷，以恒壓滴液漏斗緩慢滴加3.1g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.5％的氫氧化鈉水溶液，反應(yīng)4h，反應(yīng)完畢用水洗至中性，得到殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液。

3)黃曲霉素b1分子印跡聚合物的制備：

取1.8g黃曲霉素b1加入步驟2)得到的殼聚糖環(huán)氧樹脂預(yù)聚物混合液中。0℃條件下以恒壓滴液漏斗緩慢滴加1.7ml順丁烯二酸酐，反應(yīng)2h，將反應(yīng)液分散于100ml二氯乙烷中，得到的固體沉降，過濾，用100ml丙醇洗滌三次，干燥，最終得到黃曲霉素b1分子印跡聚合物。

實(shí)施例4分子印跡聚合物中黃曲霉素b1負(fù)載量計(jì)算

取上述實(shí)施例制備的三種微球，分別加入到黃曲霉素b1的甲醇溶液中，在搖床中振蕩吸附，在吸附時(shí)間內(nèi)分時(shí)間點(diǎn)取上清液測(cè)定含量。待吸附飽和，測(cè)定溶液中黃曲霉素b1的濃度變化，利用下列公式來計(jì)算靜態(tài)吸附量。實(shí)施例1至實(shí)施例3分子印跡聚合物靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)見表1。

q0＝(co-cx)*v0/mx

q0：靜態(tài)吸附量(mg/g)；

v0：黃曲霉素b1溶液體積(ml)；

co：黃曲霉素b1溶液的初始濃度(mg/ml)；

cx：吸附平衡后黃曲霉素b1溶液的濃度(mg/ml)；

mx：吸附平衡時(shí)微球的用量(g)。

實(shí)施例5分子印跡聚合物中黃曲霉素b1的回收率計(jì)算

取吸附飽和后三種分子印跡聚合物先經(jīng)布氏漏斗抽濾，然后在漏斗上方緩慢加入少量二次水洗滌，然后將微球放入索氏提取器中，以甲醇作為萃取劑對(duì)微球中吸附的物質(zhì)進(jìn)行循環(huán)萃取，分時(shí)間點(diǎn)取萃取液測(cè)定含量，直至萃取液的濃度不發(fā)生變化，利用下式確定黃曲霉素b1的回收率。回收率數(shù)據(jù)見表1。

uy＝(cx*v1/q0*mx)*100％

uy：靜態(tài)脫附率(％)；

cx：回收完成后溶液中黃曲霉素b1的濃度(mg/ml)；

v1：回收溶劑總體積(ml)；

mx：吸附平衡時(shí)微球的用量(g)。

表1：分子印跡聚合物對(duì)黃曲霉素b1的吸附量以及回收率數(shù)據(jù)

參閱圖4，從未改性的殼聚糖的紅外光譜可以看到，3200cm^－1～3500cm^－1處具有一個(gè)較大的寬峰，從歸屬上來看，應(yīng)為o-h的伸縮振動(dòng)吸收峰存在的區(qū)間以及n-h的伸縮振動(dòng)吸收峰存在的區(qū)間，因此考慮是兩種伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而成。而1000cm^－1附近的吸收峰則可以歸屬為殼聚糖分子中所具有的羥基中的c-o伸展與o-h面內(nèi)變形振動(dòng)吸收峰的這兩個(gè)峰疊加到一起的結(jié)果。而1601cm^－1處的吸收峰則是n-h的彎曲振動(dòng)吸收帶所提供的。

而三種分子印跡聚合物的紅外光譜表明：1)氨基的振動(dòng)吸收峰(3358cm^－1處的小分叉)消失表明其發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)；2)氨基的彎曲振動(dòng)吸收帶消失，也證明了這一點(diǎn)；3)飽和c-h伸縮振動(dòng)的吸收峰2924cm^－1和2869cm^－1比未改性的殼聚糖明顯增強(qiáng)，這說明希夫堿的形成使得殼聚糖上引入了碳鏈。