專利名稱：一種從黃單胞菌中提取α-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種胞內(nèi)酶的分離純化方法，本發(fā)明涉及一種以離子交換色譜和凝膠色譜相結(jié)合的方法，從黃單胞菌中提取a-葡萄糖基化丁香酚合成酶的的方法屬于生物制品分離純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丁香酚是丁香及丁香羅勒油的 主要成分，廣泛存在于丁香油、肉豆蘧油、樟腦油等芳香油中。因其具有其抗氧化、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤、促進(jìn)透皮吸收及芳香氣味等作用及優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品及日化領(lǐng)域已有應(yīng)用。但其易升華、有刺激性氣味、難溶于水等性質(zhì)，限制了它的進(jìn)ー步應(yīng)用。已有研究表明經(jīng)經(jīng)葡萄糖基化修飾的丁香酚溶解度有大幅増加，且可用作生發(fā)劑中的添加剤。目前,合成a_ 葡萄糖基化丁香酹(eugenyl a-D-glucopyranonside, a-EG)的主要途徑仍是采用微生物發(fā)酵法。由于丁香酚具有殺菌作用，利微生物發(fā)酵法合成a-EG時(shí)受到底物濃度的限制；同時(shí)，這種方法操作復(fù)雜，后期純化困難，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，對(duì)a -EG合成酶進(jìn)行分離純化，不僅利于a -EG的大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)為研究a _EG合成酶的性質(zhì)及后期進(jìn)行蛋白質(zhì)測序、構(gòu)建基因工程菌打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種a -EG合成酶的分離純化方法，該方法采用離子交換色譜和凝膠色譜相結(jié)合的手段對(duì)胞內(nèi)a -EG合成酶進(jìn)行分離純化，使之達(dá)到電泳純，該方法操作簡單，所用儀器少，可快速實(shí)現(xiàn)a -EG合成酶的分離純化。本發(fā)明是提取黃單胞菌內(nèi)的a-EG合成酶，エ藝步驟為(I)粗酶液的獲得將培養(yǎng)一定時(shí)間的黃單胞菌發(fā)酵液離心，棄上清，沉淀即為菌體細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用適量緩沖液回溶，在冰浴中超聲破碎，而后8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。(2)硫酸銨沉淀在粗酶液中緩慢加入固體硫酸銨粉末至30% (w/v)飽和度，期間不斷攪拌，4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄沉淀；上清液加硫酸銨至45% (w/v)飽和度,4°C下靜置4-24h，12000r/min離心15min，棄上清液，沉淀即為所需酶液。⑶透析除鹽將酶沉淀用適量的緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析，期間不斷更換緩沖液，直到檢測不出SO廣為止。8000r/min離心5min,棄沉淀。(4) DEAE-纖維素離子交換層析待酶液全部進(jìn)入離子交換纖維素后，用3倍柱體積的緩沖液(pH7. 0)洗脫至A-不變。然后分別用含有0-1. Omol/LNaCl的緩沖液(pH7. 0)進(jìn)行梯度洗脫，流速為I. 5mL/min,收集具有酶活的部分。(5) Sephadex G-75 凝膠層析將收集到的有活性的酶液用超濾離心管(截留分子量IOKDa)濃縮至2mL，加入經(jīng)緩沖液平衡后的葡聚糖凝膠S印hadex G-75層析柱進(jìn)行層祈。待樣品完全進(jìn)入凝膠后，以流速為0. 5mL/min進(jìn)行洗脫，收集具有酶活性的部分，即得電泳純a -EG合成酶。本發(fā)明中，所用緩沖液0. 05mol/L的Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)。本發(fā)明中，步驟(4)所用的離子交換纖維可為DEAE-32型或DEAE-52型機(jī)子交換纖維，但DEAE-52型離子交換纖維屬預(yù)溶脹纖維素，在分離和再生過程中表現(xiàn)出良好的性能，優(yōu)選DEAE-52作為離子交換吸附。
具體實(shí)施方案實(shí)施例I(I)粗酶液的獲得將培養(yǎng)48h的黃單胞菌發(fā)酵液IL于5000r/min離心，棄上清，沉淀即為菌體細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用適量緩沖液回溶，在冰浴中破碎30min (5s/5s, 300w)，而后8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。(2)硫酸銨沉淀在粗酶液中加入固體硫酸銨粉末至30% (w/v)飽和度，期間不斷攪拌，4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄沉淀；上清液加硫酸銨至45 % (w/v)飽和度,4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄上清液,沉淀即為所需酶液。(3)透析除鹽將酶沉淀用適量的緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析，期間不斷更換緩沖液，直到檢測不出S042_為止。8000r/min離心5min,棄沉淀。(4) DEAE-纖維素離子交換層析將一定量的DEAE-52離子交換樹纖維加入到經(jīng)透析的酶液中，1200r/min振蕩30min，待酶液全部進(jìn)入離子交換纖維素后，將將酶液過濾，收集離子交換纖維，雙蒸水清洗數(shù)次，使用標(biāo)準(zhǔn)操作裝柱。然后分別用含有0-l.Omol/L NaCl的緩沖液(pH7. 0)進(jìn)行梯度洗脫，流速為I. 5mL/min，收集具有酶活的部分，所得酶液酶活為79U/mg，蛋白濃度為
I.29mg/mL。(5) Sephadex G-75 凝膠層析將收集到的有活性的酶液用超濾離心管(截留分子量IOKDa)濃縮至2mL，加入經(jīng)緩沖液平衡后的葡聚糖凝膠S印hadex G-75層析柱中進(jìn)行層祈，以流速為0. 5mL/min進(jìn)行洗脫，收集具有酶活性的部分，即得電泳純a-EG合成酶，所得酶液酶活為125.4U/mg，蛋白濃度為 0. 455mg/mL。凍干后得干酶0. 1367g，蛋白收率為10. 7 %，比活較未純化之前提高了115. 9U/mg，酶活提高了 20倍。實(shí)施例2(I)粗酶液的獲得將培養(yǎng)48h的黃單胞菌發(fā)酵液IL于5000r/min離心，棄上清，沉淀即為菌體細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用適量緩沖液回溶，在冰浴中破碎30min (5s/5s, 300w)，而后8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。(2)硫酸銨沉淀在粗酶液中加入固體硫酸銨粉末至30% (w/v)飽和度，期間不斷攪拌，4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄沉淀；上清液加硫酸銨至45 % (w/v)飽和度,4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄上清液,沉淀即為所需酶液。(3)透析除鹽將酶沉淀用適量的緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析，期間不斷更換緩沖液，直到檢測不出S042_為止。8000r/min離心5min,棄沉淀。(4) DEAE-纖維素離子交換層析 將透析過的酶液用聚こニ醇6000包埋濃縮至2mL, 8000r/min離心棄沉淀,加入經(jīng)平衡后的DEAE-52離子交換柱。待酶液全部進(jìn)入離子交換纖維素后，用3倍柱體積的緩沖液(PH7. 0)洗脫至A■不變。然后分別用含有0-1. Omol/L NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為I. 5mL/min，收集具有酶活的部分。所得酶液酶活為83U/mg，蛋白濃度為I. 30mg/mL。(5) Sephadex G-75 凝膠層析 將收集到的有活性的酶液用超濾離心管(截留分子量IOKDa)濃縮至2mL，加入經(jīng)緩沖液平衡后的葡聚糖凝膠S印hadex G-75層析柱中進(jìn)行層祈。待樣品完全進(jìn)入凝膠后，以流速為0. 5mL/min進(jìn)行洗脫，收集具有酶活性的部分，即得電泳純a-EG合成酶。所得酶液酶活為127. lU/mg,蛋白濃度為0. 450mg/mL。凍干后得干酶0. 1371g，蛋白收率為11. 1%，比活較未純化之前提高了117. 6U/mg，酶活提高了 21倍。實(shí)例3(I)粗酶液的獲得將培養(yǎng)48h的黃單胞菌發(fā)酵液IL于5000r/min離心，棄上清，沉淀即為菌體細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用適量緩沖液回溶，在冰浴中破碎20min (2s/2s, 200w)，而后8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。(2)硫酸銨沉淀在粗酶液中加入固體硫酸銨粉末至30% (w/v)飽和度，期間不斷攪拌，4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄沉淀；上清液加硫酸銨至45 % (w/v)飽和度,4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄上清液,沉淀即為所需酶液。(3)透析除鹽將酶沉淀用適量的緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析，期間不斷更換緩沖液，直到檢測不出S042_為止。8000r/min離心5min,棄沉淀。(4) DEAE-纖維素離子交換層析將透析過的酶液用聚こニ醇6000包埋濃縮至2mL, 8000r/min離心棄沉淀,加入經(jīng)平衡后的DEAE-52離子交換柱。待酶液全部進(jìn)入離子交換纖維素后，用3倍柱體積的緩沖液(PH7.0)洗脫至A28tl不變。然后分別用含有0-1. Omol/LNaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為I. 5mL/min，收集具有酶活的部分。所得酶液酶活為73U/mg，蛋白濃度為I. 34mg/mL。(5) Sephadex G-75 凝膠層析
將收集到的有活性的酶液用超濾離心管(截留分子量IOKDa)濃縮至2mL，加入經(jīng)緩沖液平衡后的葡聚糖凝膠S印hadex G-75層析柱中進(jìn)行層祈。待樣品完全進(jìn)入凝膠后，以流速為0. 5mL/min進(jìn)行洗脫，收集具有酶活性的部分，即得電泳純a-EG合成酶。所得酶液酶活為121. 4U/mg,蛋白濃度為0 . 458mg/mL。凍干后得干酶0. 1385g，蛋白收率為11.6%，比活較未純化之前提高了115. lU/mg，酶活提高了 19倍。
權(quán)利要求
1. 一種從黃單胞菌中提取a-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法，其特征包括以下步驟 (1)粗酶液的獲得 將培養(yǎng)一定時(shí)間的黃單胞菌發(fā)酵液離心，棄上清，沉淀即為菌體細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用適量緩沖液回溶，在冰浴中破碎30min (5s/5s，300w)，而后8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。
(2)硫酸銨沉淀 在粗酶液中緩慢加入固體硫酸銨粉末至30% (w/v)飽和度，期間不斷攪拌，4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄沉淀；上清液加硫酸銨至45 % (w/v)飽和度,4°C下靜置4-24h, 12000r/min離心15min,棄上清液,沉淀即為所需酶液。
(3)透析除鹽 將酶沉淀用適量的緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析，期間不斷更換緩沖液，直到檢測不出S042_為止。8000r/min離心5min,棄沉淀。
(4)DEAE-纖維素離子交換層析 待酶液全部進(jìn)入離子交換纖維素后，用3倍柱體積的緩沖液(pH7. 0)洗脫至A28tl不變。然后分別用含有0-1. Omol/LNaCl的緩沖液(pH7. 0)進(jìn)行梯度洗脫，流速為I. 5mL/min,收集具有酶活部分。(5)Sephadex G-75 凝膠層析 將收集到的有活性的酶液用超濾離心管(截留分子量IOKDa)濃縮至2mL左右，加入經(jīng)緩沖液平衡后的葡聚糖凝膠S印hadex G-75層析柱進(jìn)行層祈。待樣品完全進(jìn)入凝膠后，以流速為0. 5mL/min進(jìn)行洗脫，收集具有酶活性的部分，即得電泳純a -EG合成酶。
所述步驟(2)中硫酸銨第一次添加濃度為30% (w/v)飽和度，第二次添加濃度為45%(w/v)飽和度。
步驟(4)中所述 NaCl 濃度梯度洗脫采用 0. Imol/L、0. 2mol/L、0. 3mol/L、0. 4mol/L、·0. 5mol/L和I. OmoI/L濃度的NaCl緩沖液。
全文摘要
一種從黃單胞菌中提取α-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法，屬于生物制品分離純化領(lǐng)域。工藝流程為細(xì)胞培養(yǎng)→超聲破碎→硫酸銨沉淀→透析→DEAE-離子交換層析→Sephadex G75凝膠層析→冷凍干燥，使用該方法提取的純酶酶活最高可達(dá)127.1U/mg，收率為11.1％。本發(fā)明操作簡單，所用儀器少，可快速實(shí)現(xiàn)α-EG合成酶的分離純化。
文檔編號(hào)C12N9/00GK102787103SQ20111012872
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者張淑榮, 張鵬, 苑麗輝, 許偉堅(jiān), 陳暢 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)