專利名稱：：一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)黃原膠
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：黃原膠(Xanthangum),又稱黃膠、漢生膠，是野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)以碳水化合物為主要原料，經(jīng)發(fā)酵工程生產(chǎn)的一種用途廣泛的微生物胞外多糖。1952年由美國農(nóng)業(yè)部依利諾斯州皮奧里爾北部研究所分離到甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌，并使甘藍(lán)提取物轉(zhuǎn)化為水溶性的酸性胞外雜多糖而得到。由于該多糖具有很高的黏度、流動觸變性和穩(wěn)定的理化性質(zhì)，且無毒，故作為添加劑在日用化學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的市場前景，是目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體、性能最優(yōu)越的生物膠，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、采油、紡織、陶瓷、印染、香料、化妝品及消防等領(lǐng)域。但是，現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)黃原膠的生產(chǎn)成本是較高的，存在諸多不足與缺陷，其一傳統(tǒng)的黃原膠生產(chǎn)方法，即利用微生物發(fā)酵，用玉米淀粉或蔗糖和蛋白胨或玉米漿做發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)黃原膠，所用原料均為多糖和蛋白質(zhì)等高分子化合物，導(dǎo)致被微生物利用緩慢而延長發(fā)酵周期，國內(nèi)文獻(xiàn)報道其發(fā)酵時間多在6075小時，發(fā)酵時間長自然導(dǎo)致對水、電、蒸汽等能源的較大消耗；而部分采用現(xiàn)場糖化與水解法進(jìn)行降解又增加工藝成本；其二、傳統(tǒng)的發(fā)酵法多采用間斷補料或一次性在培養(yǎng)基中將營養(yǎng)成分配制完畢，導(dǎo)致接種量大而須三級或更多級發(fā)酵，傳熱不充分引起能源利用率低下，未利用原料增加發(fā)酵液黏度引起氧傳遞效率的降低；其三、由于黃原膠產(chǎn)品高黏度的特性而發(fā)酵本身是一個高耗氧的過程，導(dǎo)致發(fā)酵后期工藝嚴(yán)重缺氧，發(fā)酵時間越長產(chǎn)品的黏度性能會逐漸下降，例如側(cè)鏈基團的脫落和缺失，對獲得高品質(zhì)的黃原膠產(chǎn)品越不利。長期以來研究人員一直致力于通過各種方法努力降低其生產(chǎn)成本，例如中國專利申請?zhí)枮?00810137040.5的專利文獻(xiàn)公開了一種黃單胞菌多糖培養(yǎng)基及其制備方法，特點是利用廢淀粉水做培養(yǎng)基。而中國專利號為ZL03124005.4的專利文獻(xiàn)公開了一種利用甜菜糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的生產(chǎn)工藝等。本研究則針對傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中存在的上述問題對其發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法進(jìn)行了研究與創(chuàng)新，提出了一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是公開一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)在發(fā)酵周期、原料成本和能源消耗上存在的不足和缺陷，達(dá)到縮短發(fā)酵周期、降低原料成本、降低能源消耗之目的。實現(xiàn)本發(fā)明之目的技術(shù)解決方案如下一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，包括斜面母種、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取階段，其特征在于全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段設(shè)計為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段包括補料培養(yǎng)基A流加，補料培養(yǎng)基B流加、PH調(diào)控環(huán)節(jié)，具體步驟如下(1)根據(jù)黃單胞菌可以充分快速利用單糖和水解蛋白等碳、氮源培養(yǎng)基，作為發(fā)酵培養(yǎng)基快速增殖黃單胞菌的原理，首先配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分(g/L重量體積比)與制備為葡萄糖10;水解大豆蛋白胨l;尿素2，玉米槳干粉3;K2HP045，檸檬酸1，MgS04'7H200.3，CaC033，121。C20min滅菌，滅菌后NaOH調(diào)PH至6.5~7.5，裝料系數(shù)0.6;(2)將級聯(lián)放大培養(yǎng)后的黃單胞菌液體(菌種號CICC10258)接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%(體積比)，pH值控制在6.57.5，溫度3(TC，發(fā)酵時間持續(xù)8~12小時；補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B的組分(g/L重量體積比)與制備為a、補料培養(yǎng)基A玉米淀粉120，玉米漿干粉60，檸檬酸2;b、補料培養(yǎng)基B玉米粉300，檸檬酸2;培養(yǎng)溫度3(TC，培養(yǎng)pH值6.57.5;培養(yǎng)方式耗氧培養(yǎng)；培養(yǎng)基采用上述組分，均12rC，20min滅菌制備；5(3)用流加補料的方式按一定速率補加補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在其發(fā)酵液菌體繁殖到光密度為OD60010.0~12.0條件下將補料培養(yǎng)基A—次性補入發(fā)酵液中，發(fā)酵時間持續(xù)6~8小時即發(fā)酵前期；在補料培養(yǎng)基A按以上步補料結(jié)束后，即使用補料培養(yǎng)基B開始流加補料，快速流加補料16~20小時后將補料培養(yǎng)基B—次性補入發(fā)酵液中，同時將發(fā)酵液PH值調(diào)節(jié)到4.5~5.5培養(yǎng)，發(fā)酵時間持續(xù)持6~8小時即發(fā)酵末期結(jié)束發(fā)酵。所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，其特征在于，補料流加方式按一定速率流加是指:補料培養(yǎng)基A的補料初始速率分別按30~60L/hr流加；補料培養(yǎng)基B的補料速率按40~50L/hr流加。所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，特征在于，發(fā)酵過程中發(fā)酵液光密度總OD600控制在13.0-15.0;當(dāng)總OD600在10.012.0時將補料培養(yǎng)基A—次性補加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，特征在于，所述的發(fā)酵過程中前期發(fā)酵pH值控制在6.5~7.5的范圍內(nèi)，發(fā)酵末期控制在4.55.5范圍內(nèi)。所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，其特征在于發(fā)酵時間周期控制在40~48小時左右。所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉、土豆淀粉、玉米粉、木薯粉、薯干粉等一種或多種；所述氮源包括硫酸銨、氯化銨、尿素、水解大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿干粉等一種或多種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明產(chǎn)生的優(yōu)點及其有益效果是其關(guān)鍵技術(shù)是將級聯(lián)放大的黃單胞菌接入含單糖和水解蛋白等能被微生物快速利用的碳氮源培養(yǎng)基中，在嚴(yán)格控制發(fā)酵液光密度的情況下依次分兩步流加淀粉和含有淀粉質(zhì)粗農(nóng)產(chǎn)品，逐步增加碳氮比，通過酸堿中和液控制發(fā)酵pH值，達(dá)到了將工藝發(fā)酵時間從60-75小時縮短至40-48小時、發(fā)酵時間縮短30%左右；將高成本的工業(yè)原料改進(jìn)為低成本的初農(nóng)產(chǎn)品替代，原料成本降低15~20%，發(fā)酵時間縮短后節(jié)約電能、工藝調(diào)整后節(jié)約消毒蒸汽致使能源消耗降低25~30%，通過試驗的數(shù)據(jù)表明，原料轉(zhuǎn)化率達(dá)到8590%，黏度提高10~20%。圖1是本發(fā)明所述的傳統(tǒng)發(fā)酵法各工藝步驟示意框圖。圖2是本發(fā)明所述的改進(jìn)后的發(fā)酵法各工藝步驟示意框圖。圖3是本發(fā)明所述的改進(jìn)后的二次發(fā)酵法產(chǎn)品應(yīng)用性能對比圖表。具體實施例方式結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的具體說明。從圖1可知，傳統(tǒng)的發(fā)酵法包括斜面母種、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取階段。從圖2可知，本發(fā)明所述的改進(jìn)后的發(fā)酵法各工藝步驟是針對圖l傳統(tǒng)的發(fā)酵法中全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段，本發(fā)明進(jìn)行了創(chuàng)新設(shè)計，將該階段設(shè)置為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段包括補料培養(yǎng)基A流加、補料培養(yǎng)基B流加、PH調(diào)控等各技術(shù)環(huán)節(jié)步驟。具體步驟包括首先配制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基開始發(fā)酵，其基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L重量體積比)為，葡萄糖10;水解大豆蛋白胨l;尿素2，玉米漿干粉3;K2HP045，檸檬酸1，MgS04'7H200.3，CaC033，滅菌后NaOH調(diào)PH至6.57.5，裝料系數(shù)0.6;其次，將級聯(lián)放大培養(yǎng)后的菌種號為CICC10258的黃單胞菌液體接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%(體積比)，pH值控制在6.57.5，溫度3(TC，發(fā)酵時間持續(xù)8~12小時；其三，補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B的組分是重要的，通過試驗證明玉米淀粉與玉米漿干粉的原料轉(zhuǎn)化率分別為88%與87%，因此選用了玉米淀粉與玉米漿干粉等作為補料培養(yǎng)基的原料組分，其制備如下a、補料培養(yǎng)基A(g/L重量體積比)玉米淀粉120，玉米漿干粉60，檸檬酸2;b、補料培養(yǎng)基B玉米粉300，檸檬酸2;培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)pH值6.57.5;培養(yǎng)方式耗氧培養(yǎng)。其四、把握好每步驟流加補料方式。需先按一定速率流加后再一次性補加；一定速率流加是指:補料培養(yǎng)基A的補料初始速率分別按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr流加，補料培養(yǎng)基B補料速率40L/hr不變；補料培養(yǎng)基B的補料速率分別按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr流加，補料培養(yǎng)基A補料速率50L/hr不變。用流加的方法按一定速率補加補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在其發(fā)酵液菌體繁殖到光密度為OD60010.0~12.0條件下將補料培養(yǎng)基A—次性補入發(fā)酵液中，發(fā)酵時間持續(xù)68小時；在補料培養(yǎng)基A按以上步補料結(jié)束后，即使用補料培養(yǎng)基B開始流加補料，快速流加補料16~20小時后將補料培養(yǎng)基B—次性補入發(fā)酵液中，同時將發(fā)酵液PH值調(diào)節(jié)到4.55.5培養(yǎng)，發(fā)酵時間持續(xù)持68小時后結(jié)束發(fā)酵，整個周期4048小時。其五，發(fā)酵過程中發(fā)酵液光密度總OD600控制在13.0~15.0也是重要的；當(dāng)總OD600在10.0~12.0時將補料培養(yǎng)基A—次性補加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。其六發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期pH值控制在6.5~7.5的范圍內(nèi)，發(fā)酵末期控制在4.5~5.5范圍內(nèi)。發(fā)酵時間周期控制在4048小時左右。發(fā)酵結(jié)果如下表(表l)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>圖3是本發(fā)明所述的改進(jìn)后的二次發(fā)酵法產(chǎn)品應(yīng)用性能對比圖表，可以證明本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果。所述的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基所需的的碳源包括葡萄糖、庶糖、麥芽糖、玉米淀粉、土豆淀粉、玉米粉、木薯粉、薯干粉等一種或多種可以選擇使用?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基所需的氮源包括硫酸銨、氯化銨、尿素、水解大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿干粉等一種或多種可以選擇使用。酸堿PH調(diào)節(jié)劑包括NaOH、碳酸鈣、氧化鈣、硫酸、磷酸等一種或多種可以選擇使用。從下面表2可知本發(fā)明所述方法與單純用淀粉或蔗糖發(fā)酵法相比，原料成本降低15~20%，能耗降低25~30%，黏度提高1020%左右。不同原料對黃原膠產(chǎn)量的影響(表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例1本發(fā)明采用二級發(fā)酵法搖瓶培養(yǎng)配制搖瓶培養(yǎng)基3L，搖瓶培養(yǎng)基組分(g/L體積重量比)葡萄糖15;水解大豆蛋白胨20;NaC110;PH調(diào)節(jié)到7.0，分裝6份，滅菌，超凈臺上各接lml甘油管工作種子，3(TC，16小時培養(yǎng)；種子罐培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組分(g/L體積重量比)葡萄糖15;水解大豆蛋白胨20;NaCl10;配制種子培養(yǎng)基600L于1000L發(fā)酵罐中，PH調(diào)節(jié)到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌150~250轉(zhuǎn)/min，通氣0.3vvm，30°C，810小時培養(yǎng)，總OD到4.03移種；發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L體積重量比)葡萄糖10;水解大豆蛋白胨l;尿素2;玉米漿干粉3;K2HP045;檸檬酸1;MgSO4'7H2O0.3;CaC033;121。C、20min滅菌，滅菌后NaOH調(diào)pH至6.5~7.5，配制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基6噸于10噸發(fā)酵罐中。補料培養(yǎng)基A組分(g/L體積重量比)玉米淀粉120，玉米漿干粉60，檸檬酸2;補料培養(yǎng)基B組分(g/L體積重量比)玉米粉300，檸檬酸2;培養(yǎng)溫度30°C,培養(yǎng)pH值6.57.5;培養(yǎng)方式耗氧培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用上述組分，均121"C，20min滅菌制備；配制補料培養(yǎng)基Al噸于2個600L補料罐中，5%泡敵于50L泡敵罐中，酸堿罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發(fā)酵液中，100~150轉(zhuǎn)/min，通氣0.30.6vvm，PH調(diào)節(jié)至6.5，30'C培養(yǎng)；同時按30L/小時開始補料，每隔4小時補料速率加倍，并取樣檢測OD600，發(fā)酵過程總OD控制在13.0~15.0;當(dāng)總OD在10.0時，將剩余補料培養(yǎng)基A—次補入發(fā)酵液中，配制補料培養(yǎng)基B1噸，滅菌待用；在上步補料結(jié)束后開始按40L/小時再補料，補料時間1620小時后將剩余補料一次性加入發(fā)酵液中，同時將PH控制在4.5到發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時間周期控制在44小時左右。實施例2除變更單因素外，培養(yǎng)基其它成分維持不變，均121'C，20min滅菌制備；搖瓶培養(yǎng)配制搖瓶培養(yǎng)基3L，pH調(diào)節(jié)到7.0，分裝6份，滅菌，超凈臺上各接lml甘油管工作種子，30°C，16hr培養(yǎng)；種子培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基600L于1000L發(fā)酵罐中，pH調(diào)節(jié)到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌15CT250轉(zhuǎn)/min，通氣0.3vvm，30°C，810hr培養(yǎng)，總OD到4.21移種；發(fā)酵培養(yǎng)配制發(fā)酵培養(yǎng)基6噸于10噸發(fā)酵罐中，配制補料培養(yǎng)基A1噸于2個600L補料罐中，5%泡敵于50L泡敵罐中，酸堿罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，100150轉(zhuǎn)/min，通氣0.30.6vvm，pH調(diào)節(jié)至6.9，30。C培養(yǎng)；同時按40L/hr開始補料，每隔4hr補料速率加倍，并取樣檢測0D600，發(fā)酵過程總OD控制在13.015.0;當(dāng)總0D在10.93時，將剩余補料培養(yǎng)基A—次補入發(fā)酵液中，并配制補料培養(yǎng)基B1噸，滅菌待用；在上步補料結(jié)束后開始按40L/hr補料，補料時間16~20hr后將剩余補料一次性加入發(fā)酵液中，同時將pH控制在4.9到發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時間周期控制在40小時左右。實施例3除變更單因素外，培養(yǎng)基其它成分維持不變，均121'C，20min滅菌制備；搖瓶培養(yǎng)配制搖瓶培養(yǎng)基3L，pH調(diào)節(jié)到7.0，分裝6份，滅菌，超凈臺上各接lml甘油管工作種子，30°C，16hr培養(yǎng)；種子培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基600L于1000L發(fā)酵罐中，pH調(diào)節(jié)到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌150~250轉(zhuǎn)/rain，通氣0.3vvm，30°C，8~10hr培養(yǎng)，總OD到4.18移種；發(fā)酵培養(yǎng)配制發(fā)酵培養(yǎng)基6噸于10噸發(fā)酵罐中，配制補料培養(yǎng)基A1噸于2個600L補料罐中，5W包敵于50L泡敵罐中，酸堿罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，100150轉(zhuǎn)/min，通氣0.3~0.6vvm，pH調(diào)節(jié)至7.2，3(TC培養(yǎng)；同時按50L/hr開始補料，每隔4hr補料速率加倍，并取樣檢測0D600，發(fā)酵過程總OD控制在13.0~15.0;當(dāng)總OD在11.54時，將剩余補料培養(yǎng)基A一次補入發(fā)酵液中，并配制補料培養(yǎng)基B1噸，滅菌待用；在上步補料結(jié)束后開始按40L/hr補料，補料時間1620hr后將剩余補料一次性加入發(fā)酵液中，同時將pH控制在5.2到發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時間周期控制在45小時左右。實施例4除變更單因素外，培養(yǎng)基其它成分維持不變，均12廠C，20min滅菌制備；搖瓶培養(yǎng)配制搖瓶培養(yǎng)基3L，pH調(diào)節(jié)到7.0，分裝6份，滅菌，超凈臺上各接lml甘油管工作種子，30°C，16hr培養(yǎng)；種子培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基600L于1000L發(fā)酵罐中，pH調(diào)節(jié)到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌15CT250轉(zhuǎn)/min，通氣0.3vvm，30°C，810hr培養(yǎng)，總OD到4.33移種；發(fā)酵培養(yǎng)配制發(fā)酵培養(yǎng)基6噸于10噸發(fā)酵罐中，配制補料培養(yǎng)基A1噸于2個600L補料罐中，5y。泡敵于50L泡敵罐中，酸堿罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，10(Tl50轉(zhuǎn)/min,通氣0.3~0.6vvm，pH調(diào)節(jié)至7.5，3(TC培養(yǎng)；同時按60L/hr開始補料，每隔4hr補料速率加倍，并取樣檢測OD600，發(fā)酵過程總OD控制在13.0-15.0;當(dāng)總OD在12.0時，將剩余補料培養(yǎng)基A—次補入發(fā)酵液中，并配制補料培養(yǎng)基B1噸，滅菌待用；在上步補料結(jié)束后開始按40L/hr補料，補料時間16~20hr后將剩余補料一次性加入發(fā)酵液中，同時將pH控制在5.5到發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時間周期控制在48小時左右。最佳實施例各培養(yǎng)基按權(quán)利要求書中的比例配制并滅菌；搖瓶培養(yǎng)配制搖瓶培養(yǎng)基3L，pH調(diào)節(jié)到7.0，分裝6份，滅菌，超凈臺上各接lml甘油管工作種子，3(TC，16h培養(yǎng)；種子培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基600L于1000L發(fā)酵罐中，pH調(diào)節(jié)到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌150~250轉(zhuǎn)/min，通氣0.3vvm，30°C，10h培養(yǎng)，總OD到4.2移種；發(fā)酵培養(yǎng)配制發(fā)酵培養(yǎng)基6噸于10噸發(fā)酵罐中，配制1)補料培養(yǎng)基1噸于2個600L補料罐中，5y。泡敵于50L泡敵罐中，酸堿罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發(fā)酵液中，100~150轉(zhuǎn)/min，通氣0.30.6vvm，pH調(diào)節(jié)至7土0.5，3(TC培養(yǎng)；同時按40L/h開始補加補料培養(yǎng)基A，每隔4h補料速率加倍，并取樣檢測0D600，發(fā)酵過程總OD控制在13.0~15.0;當(dāng)總OD在10.80時，將剩余補料培養(yǎng)基A—次補入發(fā)酵液中，并配制補料培養(yǎng)基B1噸，滅菌待用；在上步補料結(jié)束后開始按50L/hr補料，補料時間16hr后將剩余補料一次性加入發(fā)酵液中，同時將pH控制在5.0士0.2，8hr后結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過程數(shù)據(jù)如下:項目^\048121620242832364044溫度'c130.030.130.230.230.130.030.029.929.629.729.829.6230,130.230.830.130.130.229.829.729.129.930.2329.730.230.130.130.129.929.829.730.127.530.229.8pH16.997.197.036.956.986,987.006.986.986.935.105.0126.736.877.006.966.996.997.007.077,005.034.896.676.837.357.146.706.826.997.447.357.234.935.05溶氧。/n191.969.649.633.629.10.425.313.20.823.610.40.4297.490.933.51.605.50005070.395.163.655.2000001000轉(zhuǎn)速r/min199100100101150150151149.15014814914921021011001011501511501491491491483102100100100151150150149151150149147空氣流量L/m10.30.30.30.40.50.60.60.60.60.60.60.620.30.30.40.50.60.60.60.60.60.60.630.40.40.40.50.60.60.60.60.60.60.60.6罐壓MPa,10.040.040.040.040.040.050.060.060.060.060.060.0620.040.040.030.040.040.060.070.070.070.070.0630.040.040.030.030.040.060.060.060.060.060.060.06下面提供本發(fā)明所做的研究試驗實施例數(shù)據(jù):1、不同補料培養(yǎng)基對黃原膠產(chǎn)量的影響試驗除補料培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基中碳源采用葡萄糖，氮源采用水解大豆蛋白胨，其余成分維持不變，在補料培養(yǎng)基A成分改變時，補料培養(yǎng)基B不變，反之亦然，發(fā)酵工藝方法同上；1)補料培養(yǎng)基A碳源分別采用蔗糖、玉米淀粉、玉米粉，氮源采用玉米漿干粉，補料培養(yǎng)基B用蔗糖作為碳源；2)補料培養(yǎng)基B碳源分別采用蔗糖、玉米淀粉、玉米粉；補料培養(yǎng)基A碳源用玉米淀粉，氮源用玉米漿干粉。發(fā)酵結(jié)果如下表試驗l)12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>試驗2):<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3、補料更換菌體濃度對黃原膠產(chǎn)量的影響實驗設(shè)計發(fā)酵工藝方法不變，培養(yǎng)基配方按權(quán)利要求書中所述配方；補料培養(yǎng)基A更換為B時的發(fā)酵液總0D600分別為9.0、10.5、11.5、13.0進(jìn)行發(fā)酵實驗；發(fā)酵結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4、本發(fā)明與其它廠家生產(chǎn)的黃原膠性能對比情況A:本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的黃原膠，B、C:國內(nèi)其它兩個廠家生產(chǎn)地黃原膠；將三種黃原膠按相同比例與其他成分復(fù)配進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1、一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，包括斜面母種、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取階段，其特征在于全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段設(shè)計為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段包括補料培養(yǎng)基A流加，補料培養(yǎng)基B流加、PH調(diào)控環(huán)節(jié)，具體步驟如下(1)根據(jù)黃單胞菌可以充分快速利用單糖和水解蛋白等碳、氮源培養(yǎng)基，作為發(fā)酵培養(yǎng)基快速增殖黃單胞菌的原理，首先配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分(g/L重量體積比)與制備為葡萄糖10；水解大豆蛋白胨1；尿素2，玉米漿干粉3；K2HPO45，檸檬酸1，MgSO4·7H2O0.3，CaCO33，121℃20min滅菌，滅菌后NaOH調(diào)PH至6.5~7.5，裝料系數(shù)0.6；(2)將級聯(lián)放大培養(yǎng)后的黃單胞菌液體(菌種號CICC10258)接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10％(體積比)，pH值控制在6.5~7.5，溫度30℃，發(fā)酵時間持續(xù)8~12小時；補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B的組分(g/L重量體積比)與制備為a、補料培養(yǎng)基A玉米淀粉120，玉米漿干粉60，檸檬酸2；b、補料培養(yǎng)基B玉米粉300，檸檬酸2；培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)pH值6.5~7.5；培養(yǎng)方式耗氧培養(yǎng)；培養(yǎng)基采用上述組分，均121℃，20min滅菌制備；(3)用補料流加的方式按一定速率補加補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在其發(fā)酵液菌體繁殖到光密度為OD600條件下將補料培養(yǎng)基A一次性補入發(fā)酵液中，發(fā)酵時間持續(xù)6~8小時即發(fā)酵過程前期；在補料培養(yǎng)基A按以上步補料結(jié)束后，即使用補料培養(yǎng)基B開始流加補料，快速流加補料16~20小時后將補料培養(yǎng)基B一次性補入發(fā)酵液中，同時將發(fā)酵液PH值調(diào)節(jié)到4.5~5.5培養(yǎng)，發(fā)酵時間持續(xù)持6~8小時即發(fā)酵末期結(jié)束發(fā)酵。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，其特征在于，補料流加方式按一定速率流加是指補料培養(yǎng)基A的補料初始速率分別按30~60L/hr流加；補料培養(yǎng)基B的補料速率按40~50L/hr流加。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，其特征在于，發(fā)酵過程中發(fā)酵液光密度總0D600控制在13.015.0;當(dāng)總OD600在10.012.0時將補料培養(yǎng)基A—次性補加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的發(fā)酵過程前期發(fā)酵pH值控制在6.5、.5的范圍內(nèi)，發(fā)酵末期pH值控制在4.55.5的范圍內(nèi)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，其特征在于發(fā)酵時間周期控制在4048小時左右。全文摘要本發(fā)明公開一種黃單胞菌生產(chǎn)高黏度黃原膠的發(fā)酵方法，涉及利用微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)黃原膠
技術(shù)領(lǐng)域：
。傳統(tǒng)的黃單胞菌生產(chǎn)黃原膠的發(fā)酵方法，包括斜面母種、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取階段；本發(fā)明將發(fā)酵培養(yǎng)階段設(shè)計為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)階段包括補料培養(yǎng)基A流加、料培養(yǎng)基B流加、pH調(diào)控環(huán)節(jié)。在嚴(yán)格控制發(fā)酵液光密度的情況下依次分兩步流加淀粉和含有淀粉質(zhì)粗農(nóng)產(chǎn)品，逐步增加碳氮比，通過酸堿中和液控制發(fā)酵pH值，達(dá)到了將工藝發(fā)酵時間從60-75小時縮短至40-48小時，高成本的工業(yè)原料改進(jìn)為低成本的初農(nóng)產(chǎn)品替代，原料成本降低15～20％，發(fā)酵時間縮短使能源消耗降低25～30％，通過試驗數(shù)據(jù)表明，原料轉(zhuǎn)化率達(dá)到85～90％，黏度提高10～20％。文檔編號C12R1/64GK101560537SQ20091005932公開日2009年10月21日申請日期2009年5月19日優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日發(fā)明者張永奎,李亨全申請人:四川恒益科技有限公司