專利名稱：一種油菜黃單胞菌致病變種的熒光pcr快速檢測引物及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種油菜黃單胞菌致病變種的熒光PCR快速檢測引物及包含該引物的試劑盒。
背景技術：
油菜黃單胞菌木薯致病變種是油菜黃單胞菌的一種致病變種，是木薯作物最為嚴重的侵染病害，該病不僅在熱帶地區(qū)的非洲、中北美洲國家肆虐流行，給當?shù)啬臼砩a(chǎn)多次造成無法挽回的損失，也隨著國外優(yōu)質(zhì)品種引種，伴隨著這些繁殖材料的定植和育種推廣，傳播入侵至我國。并逐步擴大危害范圍，危害趨勢愈演愈烈，危害后果更趨嚴重。目前，在我國廣西、廣東、海南等主要木薯產(chǎn)區(qū)，在該地區(qū)固有的熱帶風暴的推動下，在特有的地形、栽培屏障、溫濕度等環(huán)境因子的作用下，病原微生物和植物病原組織材料、土壤隨風或雨水飄移，在空中、地面被氣流、水流沖往不同方向和不同距離的其他種植地點，侵染該地健康植株，造成疫情的新的爆發(fā)和流行。該病危害面積大，侵染致死率高，海南儋州、廣西北海、象州及鄰近的泰國都已有該病的發(fā)病報道油菜黃單胞菌木薯致病變種的傳統(tǒng)檢測與鑒定方法主要為病菌培養(yǎng)基平板檢測、血清學檢測技術、常規(guī)PCR檢測、巢式PCR檢測、雜交檢測。利用LPG培養(yǎng)基進行平板檢測，三天后即可呈現(xiàn)特異性的菌落特征。但是，這種方法往往會存在或出現(xiàn)大量的干擾菌落，限制了該方法的應用。我國的王中康等制備了該病菌的多克隆抗體，ELISA的檢測靈敏度較高，可以達到DNA點雜交的水平。然而在檢測過程中，ELISA檢測出現(xiàn)顯現(xiàn)了嚴重的局限性:某些感病莖組織檢測時結(jié)果為假陰性，`有些木薯細菌性萎蔫病菌菌系不發(fā)生酶聯(lián)反應，另外一些黃單胞致病變種病菌如citri, euphorbiae,和vasculorum卻會發(fā)生交義反應。這些局限性不僅阻礙了 ELISA檢測最終限值的研究，也使其應用受到了很大限制?，F(xiàn)代檢測技術越來越傾向于聚合酶鏈式反應法(PCR法)等分子檢測手段，油菜黃單胞菌木薯致病變種熒光PCR是一種以高分辨率熔解曲線分析為核心技術的高精度核酸檢測手段，該種技術無需后期圖像處理，所有檢測信息全部由熒光PCR儀自動采集完成，無需使用熒光探針即可完成基因、單堿基篩查，對于植物病原細菌一類病原微生物是一種理想的分子生物學檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供油菜黃單胞菌木薯致病變種熒光PCR快速檢測，即一種能夠通過檢測油菜黃單胞菌木薯致病變種特異性片段來判斷檢測樣品中是否存在油菜黃單胞菌木薯致病變種的熒光引物。本發(fā)明的熒光引物，包括:I)序列為SEQ ID NO:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物；2)對I)中的引物對通過轉(zhuǎn)換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產(chǎn)物在嚴謹條件下與I)的引物的擴增產(chǎn)物發(fā)生雜交；3)在I)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對本發(fā)明的油菜黃單胞菌木薯致病變種的熒光PCR快速檢測試劑盒，包括如下組分
1)2倍濃度的PCR體系預混合物；2)上游引物和下游引物，濃度分別為lOymol/L ；3) 20倍濃度的熒光染料；4)DNA 樣品 / 報告質(zhì)粒，10 μ g/μ L ;5)雙蒸水。本發(fā)明根據(jù)油菜黃單胞菌木薯致病變種保守基因序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該保守基因序列為不同油菜黃單胞菌木薯致病變種菌系所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源菌株的可靠性。另外，本發(fā)明的引物采用熒光標記，與普通PCR技術相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實現(xiàn)了檢測流程一體化封閉檢測。
具體實施例方式本發(fā)明根據(jù)油菜黃單胞菌木薯致病變種保守基因序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該引物包括:I)序列為SEQ ID NO:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物；2)對I)中的引物對通過轉(zhuǎn)換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產(chǎn)物在嚴謹條件下與I)的引物的擴增產(chǎn)物發(fā)生雜交；3)在I)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對對于2)中描述的引物，包括在引物的5’添加了內(nèi)切酶識別標識片段所形成的長度不同引物，以及堿基替換、插入、刪除所形成的變異引物。這些由序列為SEQ ID Ν0:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物所衍生出的引物也能用來檢測油菜黃單胞菌木薯致病變種，即2)中所描述的衍生引物所擴增出的核苷酸片段能夠在嚴謹條件下與I)的引物的擴增產(chǎn)物發(fā)生雜交；所述的嚴謹條件參照Roche公司的DIG高效DNA標記及檢測Starter Kitl手冊中的雜交條件。本發(fā)明的引物用于熒光PCR檢測油菜黃單胞菌木薯致病變種，PCR反應體系中各組分構(gòu)成比例如下:
成份_濃度體積(ML)
PCR體系預混合物 2倍 12.5 上游引物 10 Mmol/L 0.5 下游引物 10 Umol/L 0.5 熒光染料 20倍 1.25 DNA樣品/報告質(zhì)粒10 I 雙蒸水 9.25 總體積_25
PCR反應程序:(1)94°C預變性 3min ;(2)94°C變性 25s ;53°C退火，30s，72°C延伸 30s，循環(huán) 40 次。(3)最后加做熔解曲線(950C 15sec，60°C 15sec，95°C，15sec)本發(fā)明的引物用于檢測油菜黃單胞菌木薯致病變種，檢測過程如下:1、設計并合成特異性寡核苷酸引物用于熒光染料嵌合熒光PCR檢測；構(gòu)建可以使用上游引物和下游引物擴增的報告質(zhì)粒，作為陽性對照質(zhì)粒，防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本發(fā)明所用的報告質(zhì)?？梢赃x用人工合成的油菜黃單胞菌木薯致病變種pthBXamand Tn3 (GenBank:HQ113297.1)基因的部分片段，其序列為SEQ ID NO:3，將該擴增片段插入PMC-T載體得到本發(fā)明所應用的報告質(zhì)粒。2、以本發(fā)明的熒光引物作為引物，以待測樣品總DNA為模板，進行目的基因的特異性擴增；擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并在PCR反應結(jié)束后測定所合成DNA片段的熔解溫度，將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過熒光PCR儀配套軟件進行分析，可以觀察到對保守基因序列進行特異性擴增產(chǎn)生的熒光，并得到擴增產(chǎn)生的特異性片段所持有的熔解曲線(主峰86°C ±0.5°C )，則證明待測樣品中存在油菜黃單胞菌木薯致病變種；如僅觀測到熒光信號，而熔解曲線不符合油菜黃單胞菌木薯致病變種特有的熔解曲線，且可以觀察到陽性對照報告質(zhì)粒熒光信號及其產(chǎn)生的熔解曲線，則證明待測樣品中不存在油菜黃單胞菌木薯致病變種；如出現(xiàn)其他結(jié)果則表明此次檢驗失敗，不能確定是否存在油菜黃單胞菌木薯致病變種，需重新檢驗。實施例1:本發(fā)明的效果檢測本發(fā)明特異性引物通過熒光嵌合PCR報告熒光信號對油菜黃單胞菌木薯致病變種標準菌株進行檢測，擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并在PCR反應結(jié)束后測定所合成DNA片段的熔解溫度，將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過熒光PCR儀配套軟件進行分析，可以觀察到對油菜黃單胞菌木薯致病變種進行特異性擴增產(chǎn)生的熒光，并得到對油菜黃單胞菌木薯致病變種進行擴增產(chǎn)生的特異性片段所持有的熔解曲線(主峰860C ±0.5°C)。結(jié)果表明，本發(fā)明的引物和試劑盒可以準確地檢測出攜帶油菜黃單胞菌木薯致病變種的陽性樣品，不會產(chǎn)生假陰性。實施例2:陰性對照用本發(fā)明的引物和試劑盒，按本發(fā)明的檢測步驟對野油菜黃單胞菌錦葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.Malvacearum)、野油菜黃單胞菌棲絨毛草致病變種(Xanthomonas campestris pv.holcicola)、野油菜黃單胞菌棲絨毛草致病變種(Xanthomonas campestris pv.holcicola)、7jC稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)、巴氏黃單胞菌(Xanthomonas ba drii)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、野油菜黃單胞菌青覓致病變種(Xanthomonas campestris pv.amaranthicola)、豌豆細菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)等9種陰性對照菌株進行熒光檢測，擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并在PCR反應結(jié)束后測定所合成DNA片段的熔解溫度，將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過熒光PCR儀配套軟件進行分析，沒有檢測到與油菜黃單胞菌木薯致病變種擴增所得到的相近熔解曲線(主峰86°C ±0.5°C)，且可以觀察到陽性對照報告質(zhì)粒熒光信號及其產(chǎn)生的熔解曲線。從而證明對非油菜黃單胞菌木薯致病變種的陰性 對照病原細菌進行檢測時，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
權利要求
1.一種油菜黃單胞菌木薯致病變種的實時熒光PCR快速檢測引物，其特征在于，所述的引物包括序列為SEQ ID NO:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物。
2.油菜黃單胞菌木薯致病變種的熒光PCR快速檢測試劑盒，包括如下組分: 1)2倍濃度的PCR體系預混合物； 2)上游引物和下游引物，濃度分別為lOymol/L; 3)20倍濃度的熒光染料； 4)DNA樣品/報告質(zhì)粒，10 yg/μ L 5)雙蒸水。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于上述的DNA樣品/報告質(zhì)粒中包括序列為SEQ ID NO:3 的片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種油菜黃單胞菌致病變種的實時熒光PCR快速檢測引物及試劑盒，所述的引物包括序列為SEQ ID NO1的上游引物和序列為SEQ ID NO2的下游引物。本發(fā)明根據(jù)油菜黃單胞菌木薯致病變種的pthBXam and Tn3基因序列，利用分子生物學分析獲得了具有特異性的保守序列，并設計其特異性擴增引物。該保守基因序列為黃單胞菌木薯致病變種不同菌系所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源的油菜黃單胞菌木薯致病變種的可靠性。另外，本發(fā)明的引物采用熒光標記，與普通PCR技術相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實現(xiàn)了檢測流程一體化封閉檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103114136SQ201310027570
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權日2013年1月25日
發(fā)明者鄭媛 申請人:鄭媛