一株高耐受性拜氏梭菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株高耐受性拜氏梭菌Clostridium?beijerinckii?M17?CCTCC?NO：M?2013425及其在生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用。該菌株通過(guò)常溫等離子體誘變和篩選獲得，對(duì)未脫毒木質(zhì)纖維酸解糖液中的毒素物質(zhì)具有高度耐受性，在酚濃度高達(dá)2.0g/L的發(fā)酵液中，能非常好地發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，其總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了10.9g/L和7.9g/L，即使酚濃度高達(dá)2.4g/L，本發(fā)明菌株仍具有可觀的產(chǎn)丁醇能力，說(shuō)明本發(fā)明菌株拜氏梭菌M17不僅對(duì)甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且對(duì)其中的毒素抑制物，尤其是酚類化合物具有高度耐受性，是一種適合利用甘蔗渣發(fā)酵產(chǎn)丁醇的優(yōu)良菌種。
【專利說(shuō)明】一株高耐受性拜氏梭菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株能利用未脫毒甘蔗渣酸解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的高耐受性拜氏梭菌及其應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]丁醇是無(wú)色液體，有酒味，與乙醇/乙醚及其他多種有機(jī)溶劑混溶；已廣泛應(yīng)用于增塑劑等各種精細(xì)化學(xué)品的制造。丁醇具有能量密度大、可與汽油任意比混合、可直接用于內(nèi)燃機(jī)、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)；作為可再生的新型液體燃料受到越來(lái)越多的重視。
[0003]隨著化石能源的日益枯竭和價(jià)格飛漲，利用可再生的木質(zhì)纖維質(zhì)原料(如秸桿、甘鹿洛等)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，成為研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。Thaddeus Ezeji等(BioresourceTechnology.2008, 99: 5915-5922)利用拜氏梭菌突變株 BA101，以 XAD-4 resin 脫毒的玉米芯酸解和酶解糖液為底物發(fā)酵，總?cè)軇┊a(chǎn)量為9.30 g/L ;但突變株BAlOl不能利用未脫毒的酸解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇。龐浩等(生物技術(shù)，2011，21(5)，79-82)報(bào)道拜氏梭菌13-2株對(duì)甘蔗渣水解液具有較高的發(fā)酵效率，在0.5%硫酸用量條件下，它的丁醇發(fā)酵量最高可達(dá)到4.5g /L0中國(guó)專利ZL 201110020102.6報(bào)道:通過(guò)粒子束誘變育種得到的拜氏梭菌iflostridium beijerinckii) IB4對(duì)酹類化合物具有較高的抗逆性,其能以未脫毒的玉米芯酸解糖液作為碳源，在2L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了 10.3g/L和 7.1 g/L ;同時(shí)，以未脫毒的甘蔗渣酸解糖液作為碳源，在2L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了 10.6 g/L和 7.3 g/L。然而,郭亭等(J Ind Microbiol Biotechnol., 2012,39(3)，401-407)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)玉米芯和甘蔗渣酸解糖液中的酚類化合物的濃度提升到1.5g/L以上時(shí),拜氏梭菌{Clostridium bei jerinckii) IB4基本不生長(zhǎng)。
[0004]甘蔗渣是一種重要的可再生木質(zhì)纖維原料，利用蔗渣生產(chǎn)丁醇，不僅節(jié)約資源，還促進(jìn)制糖產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排，產(chǎn)業(yè)升級(jí)。但是，甘蔗渣等原料經(jīng)稀酸處理后，會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、糠醛、酚類等抑制物，這些抑制物的去除成本較高、并對(duì)微生物生長(zhǎng)有一定的抑制作用；Thaddeus Ezeji 等(Biotechnology & Bioengineering.2007, 97 (6): 1460-1469)研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸、糠醛等抑制物不影響丁醇的發(fā)酵，而酚類抑制物對(duì)丁醇發(fā)酵有明顯的抑制效果?；诖?，甘蔗渣酸解糖液中的毒素抑制物(尤其是酚類化合物)嚴(yán)重抑制產(chǎn)丁醇梭菌的發(fā)酵性能；而菌種改良是提高菌株對(duì)抑制物的耐受性、發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵手段之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)誘導(dǎo)突變和篩選的方法獲取一株不僅對(duì)甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且對(duì)其中的毒素抑制物(尤其是酚類化合物)具有高度耐受性的突變菌株。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一株新菌種:拜氏梭菌iClos tridium beijerincki?)M17。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述菌株在丁醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
申請(qǐng)人:將菌株保藏在位于武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心于2013年9月14日收到 申請(qǐng)人:提供的菌株。保藏中心給予該培養(yǎng)物的保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2013425，提議的分類命名為知clostridium beijerinckiim17，已于2013年9月23日鑒定保藏的菌株是存活的。
[0009]一種生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于:包括以下步驟:
1)平板培養(yǎng):將拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) Ml7接種至平板培養(yǎng)基上,進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33~37 °C，培養(yǎng)時(shí)間12~24 h，使菌種活化；
2)種子培養(yǎng):將平板培養(yǎng)活化的拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) M17接種到種子培養(yǎng)基中，100 mL的厭氧瓶裝液量40~60mL，充氮?dú)?~5min，培養(yǎng)溫度33~37 °C,培養(yǎng)時(shí)間12~24h ；
3)發(fā)酵產(chǎn)丁醇:將種子培養(yǎng)后的拜氏梭菌ijOlostridiumbeijerinckii) M17菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量按5~15%的體積百分比，充氮?dú)?~5min，發(fā)酵溫度33~37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為70~90 h，即可發(fā)酵產(chǎn)出丁醇。
[0010]進(jìn)一步的，步聚I)所述的平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分:碳源0.3%~1%、氮源0.5%~1%、無(wú)機(jī)鹽0.5%~0.8%、瓊脂1.5%~2%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中的至少一種；無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的至少一種。
[0011]進(jìn)一步的，步聚2)所述的種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分:碳源0.5%~1%、氮源0.5%~1%、無(wú)機(jī)鹽0.5%~0.8%、其余為水；其中，碳源選自淀粉、葡萄糖中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中至少一種；無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種。
[0012]進(jìn)一步的，步聚3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分:碳源3%~6%、氮源0.1%~0.3%、無(wú)機(jī)鹽0.1%~0.2%、生長(zhǎng)因子0.05%~0.1%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、酵母粉中至少一種；無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種；生長(zhǎng)因子選自對(duì)氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中至少一種。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明菌株拜氏梭菌beijerinckii M17對(duì)未脫毒木質(zhì)纖維酸解糖液中的毒素物質(zhì)具有高度耐受性，在酚濃度高達(dá)2.0 g/L的發(fā)酵液中，能非常好地發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，其總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了 10.9 g/L和7.9 g/L，即使酚濃度高達(dá)2.4 g/L，本發(fā)明菌株仍具有可觀的產(chǎn)丁醇能力，說(shuō)明本發(fā)明菌株拜氏梭菌M17對(duì)毒素物質(zhì)耐受性強(qiáng)、溶劑產(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量高、重復(fù)性好，是一種適合利用甘蔗渣發(fā)酵產(chǎn)丁醇的優(yōu)良菌種。
[0014]本發(fā)明菌株拜氏梭菌CViosirii/iw? beijerinckii M17對(duì)甘鹿洛酸解糖液具有高效的利用率，且對(duì)其中的毒素抑制物(尤其是酚類化合物)具有高度的耐受性，這不僅有利于丁醇的生產(chǎn)，還有利于資源的節(jié)約，促進(jìn)制糖產(chǎn)業(yè)的節(jié)能減排，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級(jí)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為拜氏梭菌的等離子體誘變存活率曲線。【具體實(shí)施方式】
[0016]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1
一、等離子體誘變?cè)及菔纤缶?br> 拜氏梭菌原始菌株進(jìn)行第一步等離子體誘變的方法如下:
將拜氏梭菌NCMB 8052原始菌株活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33~37°C，50ml肖特厭氧瓶裝液量為15~20ml，充氮?dú)?min，培養(yǎng)時(shí)間12~18 h，得到生長(zhǎng)旺盛的菌液；取新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞稀釋至細(xì)胞濃度OD6tltl=0.1~1.0，滴加在滅菌冷卻后的載片上，用無(wú)菌空氣吹干；以氦氣為放電氣體，以100W作為射頻功率，以10SLM作為氣體流量，以10~240s作為輻照時(shí)間對(duì)菌株進(jìn)行等離子體誘變，誘變后，將載體上的菌膜洗脫下來(lái)，計(jì)算存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示；由圖1可知，180s是最佳的誘變輻照時(shí)間。
[0018]二、篩選誘變后的目的拜氏梭菌株 (I)培養(yǎng)基配方(％為質(zhì)量百分比):
1.甘蔗渣酸解糖 液平板培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸銨0.2%，氯化鈉0.2%，七水合硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水合硫酸亞鐵0.01%,瓊脂1.5%，刃天青0.02%,甘蔗渣酸解糖液25% (v/v)，其余為水，pH 6。
[0019]2.種子培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸銨0.2%，氯化鈉
0.2%，七水合硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水合硫酸亞鐵0.01%,其余為水，pH 6。
[0020]3.搖瓶發(fā)酵初篩培養(yǎng)基:葡萄糖3%，乙酸銨0.22%，磷酸二氫鉀0.05%,磷酸氫二鉀0.05%,氯化鈉0.001%,七水合硫酸鎂0.02%,七水合硫酸亞鐵0.001%, 一水合硫酸錳
0.001%，玉米漿0.1%，其余為水，pH 6.6ο
[0021]5.搖瓶發(fā)酵復(fù)篩培養(yǎng)基:甘蔗渣酸解糖液3%，乙酸銨0.22%，磷酸二氫鉀0.05%，磷酸氫二鉀0.05%,氯化鈉0.001%,七水合硫酸鎂0.02%,七水合硫酸亞鐵0.001%, 一水合硫酸錳0.001%，玉米漿0.1%，其余為水，pH 6.6ο
[0022](2)篩選步驟:
1、甘蔗渣酸解糖液平板培養(yǎng)基培養(yǎng)
將誘變后的載片置于裝有I~2ml生理鹽水的具塞試管中，劇烈震蕩，將載片上的菌株洗脫，稀釋成不同濃度涂布于甘蔗渣酸解糖液平板培養(yǎng)基上，33~37°C厭氧培養(yǎng)12~36h，挑選出透明圈和菌落較大的菌落50株，分別編號(hào)Ml~M50，將其分別用種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并保種。
[0023]2、搖瓶發(fā)酵初篩
將初篩的擴(kuò)大培養(yǎng)后的50株菌落和原始菌株接種到搖瓶發(fā)酵初篩培養(yǎng)基中，接種量10% (v/v), 100 mL肖特厭氧瓶裝液量50 mL，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵時(shí)間72 h后檢測(cè)各菌株的總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量，結(jié)果顯示菌株M17、M39和M48可發(fā)酵產(chǎn)出較高的丁醇產(chǎn)量，如表I所示。[0024]表1各菌株的總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量
【權(quán)利要求】
1.一株拜氏梭菌，其分類命名為CVo1Siribeijerinckii M17,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2013425。
2.權(quán)利要求1所述的Clostridiumbeijerinckii M17在生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用。
3.—種生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)平板培養(yǎng):將拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) Ml7接種至平板培養(yǎng)基上,進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33~37 °C，培養(yǎng)時(shí)間12~24 h，使菌種活化； 2)種子培養(yǎng):將平板培養(yǎng)活化的拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) M17接種到種子培養(yǎng)基中，100 mL的厭氧瓶裝液量40~60mL，充氮?dú)?~5min，培養(yǎng)溫度33~37 °C,培養(yǎng)時(shí)間12~24h ； 3)發(fā)酵產(chǎn)丁醇:將種子培養(yǎng)后的拜氏梭菌ijOlostridiumbeijerinckii) M17菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量按5~15%的體積百分比，充氮?dú)?~5min，發(fā)酵溫度33~37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為70~90 h，即可發(fā)酵產(chǎn)出丁醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于:步聚I)所述的平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分:碳源0.3%~1%、氮源0.5%~1%、無(wú)機(jī)鹽0.5%~0.8%、瓊脂1.5%~2%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中的至少一種；無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3 所述的一種生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于:步聚2)所述的種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分:碳源0.5%~1%、氮源0.5%~1%、無(wú)機(jī)鹽0.5%~0.8%、其余為水；其中，碳源選自淀粉、葡萄糖中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中至少一種；無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于:步聚3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分:碳源3%~6%、氮源0.1%~0.3%、無(wú)機(jī)鹽0.1%~0.2%、生長(zhǎng)因子0.05%~0.1%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、酵母粉中至少一種；無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種；生長(zhǎng)因子選自對(duì)氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中至少一種。
【文檔編號(hào)】C12P7/16GK103898010SQ201410086648
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】郭亭, 張九花, 梁達(dá)奉, 蟻細(xì)苗, 柳穎, 常國(guó)煒, 曾練強(qiáng), 李雨虹 申請(qǐng)人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所