一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種通過逆向灌注方式高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，主要包括含血清培養(yǎng)階段和無血清培養(yǎng)階段，并且每個階段均包括逆流灌注和提速攪拌過程。本發(fā)明通過由生物反應(yīng)器底部向上逆流灌注培養(yǎng)基，從而保障新鮮的培養(yǎng)基可均勻到達(dá)各載體間隙，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)可進(jìn)行充分、及時的交換，可避免細(xì)胞生長速度不一和死細(xì)胞比例增加的問題。通過間隔將轉(zhuǎn)速提高至300-500rpm并保持一定時間，可進(jìn)一步保障營養(yǎng)物質(zhì)可進(jìn)行充分、及時的交換，從而避免因接觸面積增大而致使局部細(xì)胞密度減少、細(xì)胞分布不均勻的問題。本生產(chǎn)方法使細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)?？蛇_(dá)100L，從而提高產(chǎn)量，降低了EPO的生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種通過逆向灌注方式高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, ΕΡ0)是一種促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖、分化和紅細(xì)胞成熟的糖蛋白激素，由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和肝臟分泌，進(jìn)入血液循環(huán)，作用于骨髓中的紅系祖細(xì)胞，促進(jìn)紅細(xì)胞生成。人體缺氧時，此種激素產(chǎn)生應(yīng)激增加，致使紅細(xì)胞加快生成，增加血流比溶度(即增加血液中紅細(xì)胞百分比)，改善缺氧癥狀。在基因重組技術(shù)誕生之前，EPO主要從貧血患者的尿和綿羊血中提取，得率非常低，且極不穩(wěn)定，理化和生物性質(zhì)難以測定，亦無法大規(guī)模應(yīng)用。應(yīng)用DNA重組技術(shù)將紅細(xì)胞生成素的基因構(gòu)建到中國倉鼠卵巢細(xì)胞中(CH0細(xì)胞)，通過工程細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)，純化精制后得到基因工程重組蛋白ΕΡ0，主要用于治療因長期接受腎透析而導(dǎo)致的惡性貧血癥，還可用于改善癌癥病人因做化療或其他手術(shù)等所引起的貧血癥。1990年初入市場的EPO在全球只拿到了 2億美元年銷售額。但時隔15年后，其在2004年全球總銷售額已達(dá)驚人的119億美元，銷售額增長了 60倍，并因此成為世界上第一只銷售額突破百億美元的生物工程藥品。據(jù)DATAM0NIT0R咨詢公司的一份報告預(yù)測，到2015年，全球EPO市場將達(dá)143億~150億美元，總體呈上升趨勢。
[0003]動物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)制備治療性重組蛋白質(zhì)藥物已成為當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域中的主流技術(shù)，動物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化最關(guān)鍵的技術(shù)是使細(xì)胞的培養(yǎng)條件達(dá)到最優(yōu)化，盡可能消除或減輕培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞的影響，維持細(xì)胞高活力和提高細(xì)胞密度，達(dá)到大規(guī)?；潭?。目前進(jìn)行促紅細(xì)胞生成素 生產(chǎn)中，培養(yǎng)的CHO細(xì)胞的生物反應(yīng)器主要是傳統(tǒng)的固定床生物反應(yīng)器，其原理在于將片狀纖維載體置于生物反應(yīng)器中間，并使其固定進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，并靠生物反應(yīng)器的底部攪拌產(chǎn)生的負(fù)壓迫使培養(yǎng)基不斷從上而下流經(jīng)載體。細(xì)胞培養(yǎng)是通過攪拌器將培養(yǎng)基循環(huán)供給至貼附在片狀載體上的細(xì)胞，以達(dá)致營養(yǎng)成分和溶氧的傳遞；但隨著細(xì)胞的增殖，片狀載體的重量也隨之增加而使載體與載體之間的接觸面積增大，從而使實(shí)際細(xì)胞擴(kuò)增面積減少，這時，現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的灌注方式及攪拌方式就不能保證培養(yǎng)基和溶氧得到及時的供給，導(dǎo)致細(xì)胞因局部密集而呈現(xiàn)生長速度不一及死細(xì)胞的比例增加，直接影響整個擴(kuò)增和表達(dá)，最終導(dǎo)致促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)量減少。因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素工藝的重點(diǎn)和難點(diǎn)在于如何使?fàn)I養(yǎng)成分能夠進(jìn)行充分的交換，減少乳酸、氨離子、二氧化碳、甲基乙二醛等的有毒代謝產(chǎn)物的積累，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明可解決目前促紅素生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)無法突破最大14L培養(yǎng)規(guī)模瓶頸的技術(shù)難題，提高CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中促紅素表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和產(chǎn)量，從而提供一種可使?fàn)I養(yǎng)成分充分交換、減少有毒代謝產(chǎn)物積累并且使固定床生物反應(yīng)器的培養(yǎng)規(guī)?？蛇_(dá)IOOL的促紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，包括以下步驟:
[0006]將載體和CHO細(xì)胞懸液加入已滅菌的生物反應(yīng)器中，然后加入含血清培養(yǎng)基，并將生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速設(shè)為100-250rpm，培養(yǎng)細(xì)胞12_24h。
[0007]優(yōu)選的，接種后的生物反應(yīng)器內(nèi)的CHO細(xì)胞的細(xì)胞濃度大于0.5X105cell/mL，更優(yōu)選的細(xì)胞濃度為0.5-5X 105cell/mL ;所述載體的用量為10_40g/L。
[0008]優(yōu)選的，所述含血清培養(yǎng)基為含10%牛血清DEMA培養(yǎng)基；所述載體為聚酯片。 [0009]優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)條件為:壓力≤0.2MPa，溶氧量為30_80%，pH為7.0-7.4，溫度為35-38。。。
[0010](2)由生物反應(yīng)器的底部向上連續(xù)逆流灌注含血清培養(yǎng)基，使生物反應(yīng)器內(nèi)的含血清培養(yǎng)基的糖濃度保持在1.5g/L以上；當(dāng)糖的日消耗量3 100g/d時，停止含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0011]優(yōu)選的，生物反應(yīng)器先以常速攪拌6-24h后，再將轉(zhuǎn)速提高至高速并攪拌Ι-lOmin，然后再調(diào)回常速。優(yōu)選的，常速為100-250rpm，高速為300-500rpm。更優(yōu)選的，常速為200rpm,高速為300rpm。
[0012]優(yōu)選的，每天提高轉(zhuǎn)速1-4次。
[0013](3)將生物反應(yīng)器中的含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞6_12h。
[0014]優(yōu)選的，將生物反應(yīng)器內(nèi)的含血清培養(yǎng)基排空后再加入無血清培養(yǎng)基。
[0015]優(yōu)選的，所述無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑組成；基礎(chǔ)培養(yǎng)基由質(zhì)量份額比為1:9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基組成；添加劑及其用量為D-半乳糖250mg/L、D-甘露糖250mg/L、N-乙酰氨基葡萄糖250mg/L、D_葡萄糖l_3g/L和正丁酸鈉1.0mmol/L0
[0016]優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)條件為:壓力≤0.2MPa，溶氧量為30_80%，pH為7.0-7.4，溫度為35-38。。。
[0017](4)由生物反應(yīng)器的底部向上連續(xù)逆流灌注無血清培養(yǎng)基，使生物反應(yīng)器內(nèi)的無血清培養(yǎng)基的糖濃度保持在1.5g/L以上；培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)胞收獲液的體外活性〈3000IU/mL ；
[0018]優(yōu)選的，生物反應(yīng)器先以100-250rpm的轉(zhuǎn)速攪拌6-24h后，再將轉(zhuǎn)速提高至300-500rpm 并保持 l_10min，然后再調(diào)回 100_250rpm。
[0019]優(yōu)選的，每天提高轉(zhuǎn)速1-4次。
[0020](5)細(xì)胞收獲液經(jīng)分離、純化得ΕΡ0。
[0021]優(yōu)選的，細(xì)胞收獲液依次通過親和層析、DEAE離子交換層析、反相層析和凝膠過濾層析，分離純化得到ΕΡ0。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過由生物反應(yīng)器底部向上逆流灌注培養(yǎng)基，從而保障新鮮的培養(yǎng)基可均勻到達(dá)各載體間隙，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)可進(jìn)行充分、及時的交換，可避免細(xì)胞生長速度不一和死細(xì)胞比例增加的問題。在培養(yǎng)過程中，通過采用100-250rpm的轉(zhuǎn)速，并間隔將轉(zhuǎn)速提高至300_500rpm且保持一定時間，使載體不斷的翻轉(zhuǎn)從而可與新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行更充分的接觸，進(jìn)一步保障營養(yǎng)物質(zhì)可進(jìn)行充分、及時的交換，從而避免因接觸面積增大而致使局部細(xì)胞密度減少、細(xì)胞分布不均勻的問題。通過逆流灌注培養(yǎng)基和循環(huán)調(diào)整轉(zhuǎn)速，可減少乳酸、氨離子、二氧化碳和甲基乙二醛等有毒代謝產(chǎn)物的積累，并且細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)?？蛇_(dá)100L，從而提高產(chǎn)量，降低了 EPO的生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為實(shí)施例4、19、20和比較例I生產(chǎn)的EPO中唾液酸含量的對比；
[0024]圖2為實(shí)施例4、19、20和比較例I中細(xì)胞收獲液與傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的EPO對照品的中高唾液酸EPO比重的對比；
[0025]圖3為HPLC檢測實(shí)施例4、19,20和比較例I生產(chǎn)的EPO的純度的對比；
[0026]圖4為實(shí)施例4、19、20生產(chǎn)的EPO與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法生產(chǎn)的EPO對照品的肽圖對比；
[0027]圖5為實(shí)施例4、19、20和比較例I的每一亞批(每100L細(xì)胞收獲液為一亞批)的EPO表達(dá)量；
[0028]圖6為實(shí)施例4、19、20和比較例I中無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)天數(shù)及對應(yīng)的糖的日消耗量。
【具體實(shí)施方式】
[0029]為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步介紹和說明。
[0030]含血清培養(yǎng)基:10%牛血清DEMA培養(yǎng)基。
[0031]無血清培養(yǎng)基:由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑組成。其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基由質(zhì)量份額比為1:9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基組成；添加劑及其用量為D-半乳糖250mg/L、D-甘露糖250mg/L、N-乙酰氨基葡萄糖250mg/L、D_葡萄糖l_3g/L和正丁酸鈉1.0mmol/L。
[0032]載體:聚酯片。
[0033]實(shí)施例1-16
[0034]第一階段:含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)階段。
[0035]CHO細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)培養(yǎng)制備成細(xì)胞懸液，備用。
[0036]向30L裝有載體且已高溫高壓滅菌的生物反應(yīng)器中加入含血清培養(yǎng)基。同時將生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)條件分別設(shè)為:溫度37°C，pH7.20，D050%，常速攪拌，罐內(nèi)壓力(0.2Mpa。然后接種CHO細(xì)胞，使罐內(nèi)細(xì)胞濃度達(dá)到一定量，并補(bǔ)給含血清培養(yǎng)基至罐內(nèi)載體、細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基的總體積等于生物反應(yīng)器的工作體積，開始進(jìn)行細(xì)胞固定培養(yǎng)。
[0037]完成細(xì)胞固定培養(yǎng)后，由生物反應(yīng)器的底部向上連續(xù)逆流灌注含血清培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞灌注培養(yǎng)。其中，逆流灌注的流量為0.5-3.0L/h,舊培養(yǎng)基的排出流量為0.5-3.5L/h，且舊培養(yǎng)基的排出流量大于逆流灌注的流量，并使生物反應(yīng)器內(nèi)的含血清培養(yǎng)基的糖濃度保持在1.5g/L以上。在灌注培養(yǎng)過程中，先以常速攪拌培養(yǎng)一段時間(記為常速時間)，然后將轉(zhuǎn)速提高至高速并保持一段時間(記為高速時間)，接著再將轉(zhuǎn)速重新調(diào)回常速。每天提高轉(zhuǎn)速幾次，使罐內(nèi)的載體不斷翻轉(zhuǎn)。當(dāng)生物反應(yīng)器加入含血清培養(yǎng)基流量>3.0L/h,糖的日消耗量3 200g/d時，停止含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0038]第二階段:無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)階段。[0039]將罐內(nèi)的含血清培養(yǎng)基排空，然后加入無血清培養(yǎng)基至生物反應(yīng)器的工作體積，并將生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)條件分別設(shè)為:溫度37°C，pH7.20，D050%，常速攪拌，罐內(nèi)壓力(0.2Mpa，開始進(jìn)行細(xì)胞無灌注培養(yǎng)。
[0040]完成細(xì)胞無灌注培養(yǎng)后，由生物反應(yīng)器的底部向上連續(xù)逆流灌注無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞灌注培養(yǎng)。其中，逆流灌注的流量為0.5-3.0L/h，舊培養(yǎng)基的排出流量為
0.5-3.5L/h，且舊培養(yǎng)基的排出流量大于逆流灌注的流量，并使生物反應(yīng)器內(nèi)的含血清培養(yǎng)基的糖濃度保持在1.5g/L以上。在灌注培養(yǎng)過程中，先以常速攪拌培養(yǎng)一段時間(記為常速時間)，然后將轉(zhuǎn)速提高至高速并保持一段時間(記為高速時間)，接著再將轉(zhuǎn)速重新調(diào)回常速。每天提高轉(zhuǎn)速幾次，使罐內(nèi)的載體不斷翻轉(zhuǎn)。
[0041]當(dāng)細(xì)胞收獲液的體外活性< 3000IU/mL，終止表達(dá)培養(yǎng)，下罐。
[0042]所述細(xì)胞收獲液為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)階段中排出的舊培養(yǎng)基。
[0043]第三階段:ΕΡ0的分離、純化。
[0044]根據(jù)現(xiàn)有的分離、純化技術(shù)，將細(xì)胞收獲液依次經(jīng)親和層析、DEAE-離子交換層析、反相層析和凝膠過濾層析，分離純化得到EPO終產(chǎn)物。
[0045]在其它實(shí)施方案中，在含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)階段和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)階段，還可將生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)條件分別設(shè)為:溫度35-38°C，pH7.0-7.4，D030_80%，罐內(nèi)壓力^ 0.2Mpa。
[0046]實(shí)施例1-16中的各工藝參數(shù)如表1和表2所不。
[0047]表1含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)階段的工藝條件
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，包括以下步驟: S1、將載體和CHO細(xì)胞懸液加入已滅菌的生物反應(yīng)器中，然后加入含血清培養(yǎng)基，并將生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速設(shè)為100-2S0rpm，培養(yǎng)細(xì)胞12_24h ； S2、由生物反應(yīng)器的底部向上連續(xù)逆流灌注含血清培養(yǎng)基，使生物反應(yīng)器內(nèi)的含血清培養(yǎng)基的糖濃度保持在1.Sg/L以上；當(dāng)糖的日消耗量3 100g/d時，停止含血清培養(yǎng)基培養(yǎng); S3、將生物反應(yīng)器中的含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞6-12h； S4、由生物反應(yīng)器的底部向上連續(xù)逆流灌注無血清培養(yǎng)基，使生物反應(yīng)器內(nèi)的含血清培養(yǎng)基的糖濃度保持在1.Sg/L以上；培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)胞收獲液的體外活性<3000IU/mL ； SS、細(xì)胞收獲液經(jīng)分離、純化得ΕΡ0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述步驟S2中，生物反應(yīng)器先以常速攪拌6-24h后，將轉(zhuǎn)速提高至高速并攪拌Ι-lOmin，然后再調(diào)回常速。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述常速為 100-2S0rpm，所述高速為 300_S00rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述常速為200rpm,所述高速為300rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述步驟S2中，每天提高轉(zhuǎn)速1-4次。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述步驟S4中，生物反應(yīng)器以100-2S0rpm攪拌6-24h后，將轉(zhuǎn)速提高至300-S00rpm并保持1-lOmin，然后再調(diào)回100-2S0rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，每天提高轉(zhuǎn)速1-4次。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)條件為:壓力≤0.2MPa，溶氧量為30-80%，pH為7.0-7.4，溫度為3S_38°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述CHO細(xì)胞在接種后生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞濃度為0.S-S X IOSCel 1/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，所述載體的用量為10-40g/L。
【文檔編號】C12R1/91GK103820514SQ201410086688
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】盛光陽, 黃俊龍, 張滌平, 吳園園, 張向榮, 黃健, 王康 申請人:深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司