專利名稱：回收促紅細(xì)胞生成素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種回收促紅細(xì)胞生成素的方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是存在人體內(nèi)的一種造血因子，1985年體外基因克隆成功，1989年獲準(zhǔn)上市應(yīng)用于治療貧血類疾病的注射類藥物。常規(guī)EPO是目前世界上應(yīng)用最成功的蛋白類藥物，每年銷售額達(dá)百億美元。但常規(guī)EPO在體內(nèi)易被腎小體清除，半衰期短，病人需要頻繁注射(一周三次)以維持藥效，而且EPO在體內(nèi)有一定的抗原性。EPO通過聚乙二醇(PEG)化后，得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(PEG-EPO)，可以很好克服常規(guī)EPO的缺點(diǎn)，注射次數(shù)顯著減少(半個(gè)月甚至一個(gè)月一次)，從而提高病人的生活質(zhì)量。羅氏的抗貧血藥mircera正是這一類藥，于2007年在歐洲上市，取得醫(yī)藥上和商業(yè) 上的巨大成功。生產(chǎn)PEG-EPO的原材料EPO需要通過基因重組CHO細(xì)胞表達(dá)，再經(jīng)過純化等技術(shù)獲得，并且產(chǎn)品質(zhì)量要求完全符合2010國家藥典要求，因此EPO的價(jià)格十分昂貴。然而，使用EPO制備PEG-EPO時(shí)，一般有30%左右的EPO無法轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，而未反應(yīng)的EPO通常在提取了目標(biāo)產(chǎn)物PEG-EPO后被丟棄，造成了極大的浪費(fèi)。有的EPO回收工藝不僅復(fù)雜，回收得率也較低；或者回收得到的EPO質(zhì)量不能符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)的要求，同時(shí)與PEG反應(yīng)的活性也極低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，而提供一種工藝簡(jiǎn)單的回收促紅細(xì)胞生成素的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種回收促紅細(xì)胞生成素的方法，包括以下步驟a、將制備促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的反應(yīng)液進(jìn)行疏水層析并收集含促紅細(xì)胞生成素的組分；b、對(duì)所述含促紅細(xì)胞生成素的組分進(jìn)行超濾濃縮；C、對(duì)超濾濃縮所得產(chǎn)物進(jìn)行緩沖液的置換；其中，步驟a中所述的反應(yīng)液包含促紅細(xì)胞生成素、促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物和具有以下結(jié)構(gòu)的親水性聚合物的混合物，所述促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物是促紅細(xì)胞生成素分子與有以下親水性聚合物結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的偶聯(lián)物；
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Τ —UN — C-CHg-O- P-O-CHi- C — 0~~ N I
11. K
OO其中
P為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯嗎啉或其共聚物，分子量為10-50kD ；優(yōu)選分子量為30-40kD的聚乙二醇；T為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖中的任一種或任一種的衍生物或任一種的寡糖；優(yōu)選葡萄糖；步驟a中所述疏水層析的層析填料為含有丁基、辛基、苯基、烷基、己基或乙醚基的疏水填料。疏水層析采用梯度洗脫的方式進(jìn)行，該梯度洗脫的第一流動(dòng)相是含O. 5-2M硫酸銨，O. 05-0. 25M的磷酸緩沖液，pH 6. 0-9. 0，優(yōu)選是2M硫酸銨，O. 15M的磷酸緩沖液，pH7. 3 ;該梯度洗脫的第二流動(dòng)相是O. 05-0. 25M的磷酸緩沖液，pH 6. 0-9. 0，優(yōu)選是O. 15M的磷酸緩沖液，pH 7. 3。步驟b中所述超濾濃縮使用截留分子量為5-10kD的超濾膜。超濾膜的材質(zhì)為聚醚砜或再生纖維素材質(zhì)，優(yōu)選再生纖維素材質(zhì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、效果顯著；經(jīng)本發(fā)明從 混合液中回收的促紅細(xì)胞生成素的純度高、收率高；經(jīng)本發(fā)明所回收的促紅細(xì)胞生成素具有良好的體內(nèi)活性，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合2010國家藥典標(biāo)準(zhǔn)；并且所回收的促紅細(xì)胞生成素與聚乙二醇衍生物的反應(yīng)活性較強(qiáng)，可以回收再用或其它用途，從而避免了浪費(fèi)，極大的降低了生產(chǎn)成本。該發(fā)明可進(jìn)行放大生產(chǎn)，具有較高的醫(yī)藥價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。


圖I為實(shí)施例步驟一中反應(yīng)液的體積排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)圖；圖2為疏水層析的層析譜圖；圖3為回收EPO的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)結(jié)果；圖4為回收EPO中PEG殘留量的檢測(cè)結(jié)果；圖5為回收EPO的SEC-HPLC譜圖；圖6為試驗(yàn)三中反應(yīng)液的SEC-HPLC譜圖。
具體實(shí)施例方式為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步介紹和說明。實(shí)施例步驟一 ΕΡ0與葡萄糖聚乙二醇NHS酯(GLUC-NHS)反應(yīng)及反應(yīng)液成分檢測(cè)。向300ml的廣口瓶中先加入40ml EPO原液(ΕΡ0含量為2. 5mg/ml )，再向該廣口瓶中加入60ml pH7. 2濃度為20mM的磷酸緩沖液使EPO的濃度為lmg/ml。用21. 88ml pH3. O濃度為2mM的磷酸緩沖液溶解2188mg分子量為35kD的GLUC_NHS(在其它實(shí)施例中，GLUC-NHS與EPO的摩爾比也可在10-25:1范圍內(nèi))，溶解后，將GLUC-NHS溶液全部加入EPO中，用pH試紙測(cè)定反應(yīng)液的pH為7. 2(在其它實(shí)施例中，反應(yīng)液的pH可在7. 0-7. 5范圍內(nèi)進(jìn)行選擇，不影響本發(fā)明的目的)。反應(yīng)混合液放置于震蕩器上，室溫震蕩反應(yīng)至少2小時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用的反應(yīng)時(shí)間為2. 5小時(shí)。結(jié)束反應(yīng)后用SEC-HPLC對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)液中含有未反應(yīng)的 EP0、PEG、單取代 PEG-EPO(mPEG-EPO)、二取代 PEG-EPO(d PEG-EP0)和多取代 PEG-EPO(oli PEG-EP0,三取代以上 PEG-EP0)。
SEC-HPLC 檢測(cè)條件SEC-HPLC 柱GE super pos e610/300GL(球蛋白分離范圍 δ-δΟΟΟΗ))流動(dòng)相3.2mM Na2HPO4,1. 5mM KH2PO4,0. 4M NaClHPLC:島津 HPLC，PDA 檢測(cè)器，LC solution 工作站檢測(cè)波長(zhǎng)280nm上樣量20μ I流速0.5ml/min如圖I所示，為上述反應(yīng)液的SEC-HPLC圖，圖上的峰依次為d EP0、mPEG_EP0、EP0和鹽峰。SEC-HPLC的檢測(cè)數(shù)據(jù)如下表所示，其中m PEG_EP0、EP0和d PEG-EPO的峰面積比為 m PEG-EPO EP0 d PEG_EP0=23. 4 :51. 3:25. 3。
權(quán)利要求
1.一種回收促紅細(xì)胞生成素的方法，包括將制備促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的反應(yīng)液進(jìn)行疏水層析并收集含促紅細(xì)胞生成素的組分，其特征在于對(duì)所述含促紅細(xì)胞生成素的組分進(jìn)行超濾濃縮，該超濾濃縮使用截留分子量為5000-10000道爾頓的超濾膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于還包括置換緩沖液的步驟，對(duì)所述超濾濃縮所得產(chǎn)物進(jìn)行緩沖液的置換。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于所述反應(yīng)液包含促紅細(xì)胞生成素、促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物和具有以下結(jié)構(gòu)的親水性聚合物的混合物，所述促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物是促紅細(xì)胞生成素分子與有以下親水性聚合物結(jié)構(gòu)的偶聯(lián)物；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于所述促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物是聚乙二醇衍生物化促紅細(xì)胞生成素，所述親水性聚合物是聚乙二醇衍生物；其中聚乙二醇的分子量為30000-40000道爾頓。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于所述疏水層析的層析填料為含有丁基、辛基、苯基、烷基、己基或乙醚基的疏水填料。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于所述疏水層析采用梯度洗脫，該梯度洗脫的第一流動(dòng)相是含O. 5-2M硫酸銨，O. 05-0. 25M的磷酸緩沖液，pH6.0-9. O ;該梯度洗脫的第二流動(dòng)相是O. 05-0. 25M的磷酸緩沖液，pH 6. 0-9. O。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于所述第一流動(dòng)相是含2M硫酸銨，O. 15M的磷酸緩沖液，pH 7. 3，所述第二流動(dòng)相是O. 15M的磷酸緩沖液，pH7.3。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述回收促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于所述超濾膜的材質(zhì)為聚醚砜或再生纖維素材質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種回收促紅細(xì)胞生成素的方法，包括將制備促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的反應(yīng)液進(jìn)行疏水層析并收集含促紅細(xì)胞生成素的組分，對(duì)所述含促紅細(xì)胞生成素的組分進(jìn)行超濾濃縮，該超濾濃縮使用截留分子量為5000-10000道爾頓的超濾膜。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、效果顯著；經(jīng)本發(fā)明從反應(yīng)液中回收的促紅細(xì)胞生成素的純度高、得率高；經(jīng)本發(fā)明所回收的促紅細(xì)胞生成素具有良好的體內(nèi)活性，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合2010國家藥典標(biāo)準(zhǔn)；并且所回收的促紅細(xì)胞生成素與聚乙二醇衍生物的反應(yīng)活性較強(qiáng)，可以回收再用，從而避免了浪費(fèi)，極大地降低了生產(chǎn)成本。該發(fā)明可進(jìn)行放大生產(chǎn)，具有較高的醫(yī)藥價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102816227SQ20121031386
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者黎雄輝 申請(qǐng)人:深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司