專利名稱：：Has化的多肽,特別是has化的促紅細胞生成素的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及與羥烷基淀粉(HAS)特別是與羥乙基淀粉偶聯(lián)的多肽，特別是促紅細胞生成素。
背景技術：
：為了獲得一種特定的生理效果而對循環(huán)系統(tǒng)應用多肽特別是酶或細胞因子，是現(xiàn)代醫(yī)學中一種眾所周知的方法。促紅細胞生成素(EP0)是紅系祖細胞成熟為紅細胞所必需的一種糖蛋白激素。成人在腎臟中產(chǎn)生EPO。EPO是調節(jié)循環(huán)中紅細胞水平所必需的。以低組織氧水平為標志的疾病引起EPO生物合成增加，隨后刺激紅細胞生成。例如，在慢性腎衰竭中，腎功能的喪失一般導致EPO的生物合成減少，伴有紅細胞減少。促紅細胞生成素是一種分子量約為34,000Da的酸性糖蛋白激素。人促紅細胞生成素是一種166個氨基酸的多肽，其作為一種單體天然存在(Lin等人，1985，PNAS82,7580-7584，EP148605B2,EP411678B2)。例如，美國專利4，703，008描述了對編碼促紅細胞生成素的基因的鑒定、克隆和表達。例如，美國專利4，667，016描述了從支持含有重組促紅細胞生成素質粒的哺乳動物細胞生長的細胞培養(yǎng)基中純化重組促紅細胞生成素。在本
技術領域：
中公認，EPO的體內(nèi)生物活性主要取決于唾液酸與EPO結合的程度(參見，例如，EP428267Bl)。理論上，14個唾液酸分子能夠與一個EP0分子在與N-和0-糖基化位點連接的碳水化合物側鏈末端結合。獲得高度唾液酸化的EPO制品需要非常復雜的純化步驟。關于促紅細胞生成素的更詳細的信息，見Krantz，Erythropoietin,1991,Blood,77(3):419-34(Review),和Cerami，Beyonderythropoiesis:novelapplicationsforrecombinanthumanerythropoietin,，2001，SeminHematol.，(3S卿17):33-9(Review)。多肽和酶應用的一個眾所周知的問題是這些蛋白質通常不能顯示令人滿意的穩(wěn)定性。具體而言，促紅細胞生成素的血漿半衰期相對較短(Spivak和Hogans，1989，Blood73，90;McMahon等人，1990,Blood76,1718)。這意味著治療性血漿水平快速降低，必須進行重復靜脈內(nèi)施用。此外，在某些情況下，還觀察到針對這些肽的免疫應答。通常認為，當多肽與聚合分子偶聯(lián)時，多肽的穩(wěn)定性能夠提高且針對這些多肽的免疫應答降低。W094/28024公開了用聚乙二醇(PEG)修飾的生理活性多肽顯示免疫原性和抗原性降低，在血流中的循環(huán)遠長于未偶聯(lián)的蛋白質，即清除所需時間更長。然而，PEG-藥物偶聯(lián)物也有幾個缺點，例如，它們不具有能夠被體內(nèi)降解途徑組件識別的天然結構。因此，除了PEG-偶聯(lián)物之外，還制備了其它偶聯(lián)物和蛋白質聚合物。交聯(lián)不同蛋白質和大分子(如聚合酶)的多種方法在文獻中已有描述(參見，例如，Wong，《蛋白質偶聯(lián)和交聯(lián)的化學》(Chemistryofproteinconjugationandcross-linking),1993，CRCS,Inc.)。羥乙基淀粉(HES)是天然存在的支鏈淀粉衍生物，可被體內(nèi)a-淀粉酶降解。本領域已經(jīng)了解HES-蛋白質偶聯(lián)物的制備(參見，例如，DE2616086或DE2646854中的HES-血紅蛋白偶聯(lián)物)。DE2646854公開了血紅蛋白與HES的偶聯(lián)方法。在這些方法中，HES與高硤酸鈉反應，產(chǎn)生與血紅蛋白連接的二醛。與此不同，DE2616086公開的血紅蛋白與HES的偶聯(lián)方法中，交聯(lián)劑(例如bromocyane)首先與HES結合，隨后血紅蛋白與中間產(chǎn)物連接。HES是碳水化合物聚合物支鏈淀粉的取代衍生物，在玉米淀粉中以濃度高達95%重量存在。HES顯示有利的生物學性質，可以用作血容量替代劑，在臨床血液稀釋治療中使用(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspha函zie，8(8),271-278;Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschimg/DrugRes.,41,494-498)。支鏈淀粉由葡萄糖部分(moiety)組成，其中主鏈中存在a-l,4-糖苷鍵，在分支位點處有a-l,6-糖苷鍵。該分子的物理化學性質主要取決于糖苦鍵的類型。由于a-1,4-糖苷鍵具有切口，產(chǎn)生每圏大約有6個葡萄糖單體的螺旋結構。該聚合物的物理化學以及生物化學性質能夠通過取代改變。通過堿羥乙基化作用可以引入羥乙基。通過改變反應條件，能夠研究未取代葡萄糖單體中各羥基對羥乙基化的不同反應性。由于這一事實，技術人員能夠有限程度地影響取代模式。因此，HES的特征主要在于分子量分布和取代程度。有兩種方式可以描述取代程度1.以取代葡萄糖單體相對于所有葡萄糖部分的比例描述取代程度(DS)。2.以描述每葡萄糖部分的羥乙基數(shù)的"摩爾取代"(MS)來描述取代程度。HES溶液作以多分散組合物存在，每個分子在聚合程度、分支位點數(shù)量和型式以及取代型式等方面彼此不同。因此HES是不同分子量化合物的混合物。因此，利用統(tǒng)計學方法，根據(jù)平均分子量確定具體的HES溶液。在本文中，M。被計算為取決于分子數(shù)的算術平均值。此外，重量平均值Mw代表取決于HES質量的單位。本領域中公開的HES-藥物偶聯(lián)物具有HES不能與藥物位點特異性偶聯(lián)的缺點。因此，這種偶聯(lián)產(chǎn)生含有多種成分的非常不均一的產(chǎn)物，由于在偶聯(lián)步驟中三維結構被破壞，這些成分可能沒有活性?？傊匀恍枰€(wěn)定性和/或生物活性提高的進一步改進的多肽。對于促紅細胞生成素尤其如此，必須將含高度唾液酸因此具有高活性的同種型從唾液酸含量低的同種型中純化(見EP428267Bl)。因此，如果可以采用能夠產(chǎn)生高活性多肽而不需要復雜純化的生產(chǎn)方法，將是非常有利的。遺憾的是，在細菌或昆蟲細胞中生產(chǎn)多肽通常較困難，因為通常產(chǎn)生的多肽不具有正確折疊和天然構象，并且缺乏適當?shù)奶腔?br/>發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個目的是提供體內(nèi)生物活性高、能夠以低成本容易生產(chǎn)的多肽衍生物，特別是促紅細胞生成素衍生物。此外，本發(fā)明的另外一個目的是提供一種生產(chǎn)多肽衍生物的方法，其易于進行，并且產(chǎn)生高生物活性的產(chǎn)物。本發(fā)明的另外一個目的是提供含有高生物活性的多肽衍生物的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，該問題用含有一個或多個HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-促紅細胞生成素(EP0)-偶聯(lián)物(HAS-EP0)來解決，其中每個HAS與EP0通過a)碳水化合物部分；或b)石克醚偶聯(lián)。本發(fā)明的HAS-EP0具有以下優(yōu)點與偶聯(lián)前的促紅細胞生成素相比，生物穩(wěn)定性提高。此外，它也顯示比標準BRPEP0更高的生物活性。這主要是基于以下事實HAS-EPO很少甚至不被肝臟和腎臟的清除系統(tǒng)識別，因此在循環(huán)系統(tǒng)中長時間存在。此外，由于HAS以位點特異性的方式連接，因此EPO體內(nèi)生物活性因HAS與EPO偶聯(lián)而被破壞的危險被最小化。在此方面，本發(fā)明涉及1.一種含有一個或多個HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-促紅細胞生成素(EPO)偶聯(lián)物(HAS-EPO)，其中每個HAS都與EPO通過ap友水化合物部分；或b)石克醚偶聯(lián)。2.如第1項所述的HAS-EP0，其中EP0具有人EPO的氨基酸序列。3.如第1或2項所述的HAS-EPO,其中EPO含有通過N-和/或0-連接糖基化作用與EPO連接的一個或多個碳水化合物側^i。4.如第3項所述的HAS-EPO,其中在哺乳動物特別是人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側鏈已與EPO連接。5.如第1-4中任一項所述的HAS-EPO，其中HAS通過接頭分子與EPO偶聯(lián)。6.如第3-5中任一項所述的HAS-EPO，其中HAS通過碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分并優(yōu)選是被氧化的。7.如第6項所述的HAS-EPO，其中HAS與碳水化合物側鏈的半乳糖或唾液酸殘基偶聯(lián)。8.如第1-7中任一項所述的HAS-EPO，其中石克醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者添加的半胱氨酸。9.如第8項所述的HAS-EPO,其中EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。10.如第9項所述的HAS-EPO,其中HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)，半胱氨酸33被置換為另一種氨基酸。11.如第9項所述的HAS-EPO,其中HAS與半胱氨酸33偶聯(lián)，半胱氨酸29被置換為另一種氨基酸。12.如第8-11中任一項所述的HAS-EPO，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。13.如第12項所述的HAS-EPO，其中EPO是人EPO，被置換的氨基酸殘基是絲氨酸126。14.如第1-13中任一項所述的HAS-EPO，其中每個EPO分子具有1-12個、優(yōu)選1-6個或1-3個、最優(yōu)選1-4個HAS分子。15.如第1-14中任一項所述的HAS-EPO,其中HAS選自羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉。16.如第15項所述的HAS-EPO，其中HAS是羥乙基淀粉(HES)。17.如第16項所述的HAS-EP0，其中HES的分子量為1-300kDa，優(yōu)選5-100kDa。18.如第16或17項所述的HAS-EP0，其中HES顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代度和2-20的C2:C6取代比。19.一種生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-促紅細胞生成素(EP0)偶聯(lián)物(HAS-EPO)的方法，包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應的EPO,b)提供能夠與步驟a)中EPO反應的修飾的HAS,和c)使步驟a)的EPO與步驟b)的HAS反應，從而產(chǎn)生含有一個或多個HAS分子的HAS-EPO，其中每個HAS都與EPO通過i)碳水化合物部分；或ii)硫醚偶聯(lián)。20.如第19項所述的方法，其中EP0具有人EP0的氨基酸序列。21.如第19或20項所述的方法，其中EPO是重組產(chǎn)生的。22.如第19-21中任一項所述的方法，其中EPO含有通過N-和/或0-連接糖基化作用與EPO連接的一個或多個碳水化合物側鏈。23.如第22項所述的方法，其中在哺乳動物特別是人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側鏈已與EPO連接。24.如第22或23項所述的方法，其中HAS通過碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)，并且該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。25.如第24項所述的方法，其中在步驟a)中，通過氧化EPO的一個或多個碳水化合物側鏈的至少一個碳水化合物部分、優(yōu)選至少一個末端糖單元、更優(yōu)選半乳糖來修飾EPO。26.如第25項所述的方法，其中在部分或完全(酶和/或化學)除去末端唾液酸后氧化末端糖單元。27.如第25或26項所述的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與氧化的末端糖單元偶聯(lián)。28.如第19-27中任一項所述的方法，其中EPO含有至少一個游離SH基。1029.如第28項所述的方法，其中游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。30.如第29項所述的方法，其中EP0具有人EP0的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。31.如第30項所述的方法，其中半胱氨酸33被置換為另一種氨基酸，在步驟c)中修飾的HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)。32.如第30項所述的方法，其中半胱氨酸29被置換為另一種氨基酸，在步驟c)中修飾的HAS與半胱氨酸33偶聯(lián)。33.如第29-32中任一項所述的方法，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。34.如第33項所述的方法，其中EPO是人EPO，被置換的氨基酸殘基是絲氨酸126。35.如第33或34項所述的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。36.如第19-35中任一項所述的方法，其中修飾HAS，使得如果HAS與氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)，則其含有游離的酰肼、羥胺、硫醇或氨基脲官能團，或者如果HAS與SH基偶聯(lián)，則其含有游離的馬來酰亞胺、二硫醚或卣代乙酰胺官能團。37.如第19-36中任一項所述的方法，其中步驟c)在至少含有10%重量H20的反應介質中進行。38.如第19-37中任一項所述的方法，其中HAS通過接頭分子與EPO偶聯(lián)。39.如第19-38中任一項所述的方法，其中HAS是羥乙基淀粉、羥丙基淀粉或羥丁基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉(HES)。40.如第39項所述的方法，其中HES具有如第17或18項所限定的性質。41.通過如第19-40中任一項所述的方法獲得的HAS-EPO。42.如第41項所述的HAS-EPO,其具有如第1-18中任一項所限定的特征。43.用于人或動物體治療方法的根據(jù)第1-18、41或42中任一項的HAS-EP0。44.一種藥物組合物，其含有根據(jù)第1-18、41或42中任一項的HAS-EP0。45.如第44項所述的藥物組合物，進一步含有至少一種藥學可接受的載體。46.根據(jù)第1-18、41或42中任一項的HAS-EPO在制備治療貧血性疾病或造血功能障礙性疾病的藥物中的應用。47.含有一個或多個HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)，其中每個HAS都與多肽通過a)碳水化合物部分；或b)碌u醚偶聯(lián)。48.如第47項所述的HAS-多肽，其中多肽是人源性的。49.如第47或48項所述的HAS-多肽，其中多肽選自促紅細胞生成素、白介素特別是白介素-2、IFN-p、IFN-oc、CSF、白介素6和治療性抗體。50.如第47-49中任一項所述的HAS-多肽，其中多肽含有通過N-和/或0-連接糖基化作用與多肽連接的一個或多個碳水化合物側鏈。51.如第50項所述的HAS-多肽，其中在哺乳動物特別是人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側鏈已與多肽連接。52.如第47-51中任一項所述的HAS-多肽，其中HAS通過接頭分子與多肽偶聯(lián)。53.如第49-52中任一項所述的HAS-多肽，其中HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分，并優(yōu)選是被氧化的。54.如第53項所述的HAS-多肽，其中HAS與碳水化合物側鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)。55.如第47-54中任一項所述的HAS-多肽，其中碌^醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者添加的半胱氨酸。56.如第55項所述的HAS-多肽，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。57.如第47-56中任一項所述的HAS-多肽，其中每個多肽分子具有1-12個、優(yōu)選1-6或1-3個、最優(yōu)選1-4個HAS分子。58.如第47-57中任一項所述的HAS-多肽，其中HAS選自羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉。59.如第58項所述的HAS-多肽，其中HAS是羥乙基淀粉(HES)。60.如第59項所述的HAS-多肽，其中HES的分子量為1-300kDa,優(yōu)選5-100kDa。61.如第59或60項所述的HAS-多肽，其中HES顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2:G取代比。62.—種生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)的方法，包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應的多肽，b)提供能夠與步驟a)中多肽反應的修飾的HAS,和c)使步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應，從而產(chǎn)生含有一個或多個HAS分子的HAS-多肽，其中每個HAS都與多肽通過i)碳水化合物部分；或H)硫醚偶聯(lián)。63.如第62項所述的方法，其中多肽是人源性的。64.如第62或63項所述的方法，其中多肽選自促紅細胞生成素、白介素特別是白介素-2、IFN-p、IFN-a、CSF、白介素6和治療性抗體。65.如第62-64中任一項所述的方法，其中多肽是重組產(chǎn)生的。66.如第62-65中任一項所述的方法，其中多肽含有通過N-和/或0-連接糖基化作用與多肽連接的一個或多個碳水化合物側鏈。67.如第66項所述的方法，其中在哺乳動物特別是人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中所述碳水化合物側鏈已與多肽連接。68.如第66或67中任一項所述的方法，其中HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。69.如第68項所述的方法，其中在步驟a)中，通過氧化多肽的一個或多個碳水化合物側鏈的至少一個碳水化合物部分、優(yōu)選至少一個末端糖單元、更優(yōu)選半乳糖來修飾該多肽。70.如第69項所述的方法，其中在部分或完全(酶和/或化學)除去末端唾液酸后氧化末端糖單元。71.如第69或70所述的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與氧化的末端糖單元偶聯(lián)。72.如第62-71中任一項所述的方法，其中多肽含有至少一個游離SH基。73.如第72項所述的方法，其中游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。74.如第62-73中任一項所述的方法，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。75.如第73或74項所述的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。76.如第62-75中任一項所述的方法，其中修飾HAS,使得如果HAS與氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)則含有游離的酰肼、羥胺、硫醇或氨基脲官能團，或者如果HAS與SH基偶聯(lián)則含有游離的馬來酰亞胺、二硫醚或卣代乙酰胺官能團。77.如第62-76中任一項所述的方法，其中步驟c)在至少含有10%重量H20的反應介質中進行。78.如第62-78中任一項所述的方法，其中HAS通過接頭分子與多肽偶聯(lián)。79.如第62-78中任一項所述的方法，其中HAS是羥乙基淀粉、羥丙基淀粉或羥丁基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉(HES)。80.如第79項所述的方法，其中HES具有如權利要求60或61中任一項所限定的性質。81.可通過如第62-80中任一項所述的方法獲得的HAS-多肽。82.如第41項所述的HAS-多肽，其具有權利要求47-61中任一項所限定的特征。83.在人或動物體治療方法中使用的根據(jù)第47-61、81或82中任一項的HAS-多肽。84.—種藥物組合物，其含有根據(jù)第47-61、81或82中任一項的HAS-多肽。85.如第84項所述的藥物組合物，進一步含有至少一種藥學可接受的載體。本發(fā)明的HAS-EP0主要含有兩種成分，即促紅細胞生成素(EP0)多肽和與之連接的羥烷基淀粉(HAS)。EP0可以是4壬4可人來源的(參見，例^口，Inoue，Wada,Takeuchi,1994，Animprovedmethodforthepurificationofhumanerythropoietinwithhighinvivoactivityfromtheurineofanemicpatients,BiolPharmBull.17(2)，180-4;Miyake，Kung，Goldwasser,1977,Purificationofhumanerythropoietin,JBiolChem.，252(15)，5558-64)或者另外一種哺乳動物來源的，可以從天然存在的來源(如人腎臟、人胚胎肝臟，或動物優(yōu)選猴腎)中通過純化獲得。此外，表述"促紅細胞生成素，，或"EPO，，也包括具有紅細胞生成活性的EP0變體，其中一個或多個氨基酸(例如1-25個，優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選1-5個，最優(yōu)選1個或2個)已經(jīng)被置換為另外的氨基酸(參見，例如EP640619Bl)。紅細胞生成活性的測量在本領域中有描述(關于體外活性的測量參見例如Fibi等人，1991'Blood,77,1203ff;KiUmura等人，1989，J.CellPhys.，140,323-334;關于EPO體內(nèi)活性的測量參見Ph.Eur.2001,911-917;Ph.Eur.2000，1316Erythropoietinisolutioconcentrata，780-785;歐洲藥典(1996/2000);歐洲藥典，1996,Erythropoietinconcentratedsolution,Pharmaeuropa.，8,371-377;Fibi，Hermentin，Pauly，15Lauffer，Zettlmeissl.,1995,N-and0-glycosylationmuteinsofrecombinanthumanerythropoietinsecretedfromBHK—21cells,Blood,85(5)，1229-36;(在第1、2、3天向雌性NMRI小鼠注射EPO和修飾的EP0型(等量蛋白質50ng/小鼠)，在第4天采集血樣，測定網(wǎng)織紅細月包))。測量EPO活性試馬全的其它出X反物包4舌Barbone，Aparicio，Anderson,Natarajan,Ritchie,1994,Reticulocytesmeasurementsasabioassayforerythropoeitin,J.Pharm.Biomed.Anal.，12(4)，515-22;Bowen，CuUigan,Beguin,Kendall,Villis，1994，Estimationofeffectiveandtotalerythropoiesisinmyelodysplasiausingserumtransferringreceptoranderythropoietinconcentrations,withautomatedreticulocyteparameters,Leukemi,8(1)，151-5;Delorme,Lorenzini，Giffin，Martin,Jacobsen，Boone,Elliott,1992，Roleofglycosylationonthesecretionandbiologicalactivityoferythropoietin,Biochemistry,31(41),9871-6;Higuchi，0h-eda,Kuboniwa，Tomonoh，Shimonaka,Ochi，1992;Roleofsugarchainsintheexpressionofthebiologicalactivityofhumanerythropoietin,J.Biol.Chem.，267(11)，7703-9;Yamaguchi，Akai，Kawanishi，Ueda，Masuda,Sasaki,1991,Effectsofsite-directedremovalofN-glycosylationsitesinhumanerythropoietinonitsproductionandbiologicalproperties,J.Biol.Chem"266(30)，20434-9;Takeuchi,Inoue，Strickland,Kubota，Wada，Shimizu，Hoshi，Kozutsumi，Takasaki，Kobata，1989,RelationshipbetweensugarchainstructureandbiologicalactivityofrecombinanthumanerythropoietinproducedinChinesehamsterovarycells,Proc.Natl,Acad.Sci.USA,85(20)，7819-22;Kurtz，Eckardt，1989,Assaymethodsforerythropoietin,Nephron.,51(1)，11-4(German);Zucali，Sulkowski,1985，Purificationofhumanurinaryerythropoietinoncontrolled—poreglassandsilicic16acid，Exp.Hematol.,13(3)，833-7;Krystal,1983，Physicalandbiologicalcharacterizationoferythroblastenhancingfactor(EEF),alateactingerythropoeticstimulatorinserumdistinctfromerythropoietin,Exp.Hematol.,11(1)，18-31。優(yōu)選地，EPO通過重組產(chǎn)生。這包括在真核或原核細胞中產(chǎn)生，優(yōu)選地在哺乳動物、昆蟲、酵母、細菌細胞中或者在適于重組生產(chǎn)EPO的其它任何細胞類型中產(chǎn)生。此外，EPO也可以在轉基因動物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉基因鳥特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉基因植物中表達。多肽的重組產(chǎn)生為本領域公知。通常包括用一種適當?shù)谋磉_載體轉染宿主細胞，在能夠生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以及從宿主細胞中純化多肽。關于詳細信息，參見例如Krystal，Pankratz，F(xiàn)arber，Smart,1986，Purificationofhumanerythropoietintohomogeneitybyarapidfive-stepprocedure,Blood,67(1)，71-9;Quelle,Caslake,Burkert，Wojchowski，1989，High-levelexpressionandpurificationofarecombinanthumanerythropoietinproducedusingabaculovirusvector,Blood，74(2),652-7;EP640619Bl和EP668351Bl。在一個優(yōu)選實施方案中，EP0具有人EPO的氨基酸序列(見EP148605B2)。EPO可以含有通過N-和/或0-連接的糖基化作用與EPO連接的一個或多個碳水化合物側鏈(優(yōu)選1-4個，優(yōu)選4個)，即EPO被糖基化。當在真核細胞中生產(chǎn)EPO時，多肽通常在翻譯后被糖基化。因此，在哺乳動物特別是在人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生物合成過程中，碳水化合物側鏈可以與EPO連接。糖基化EPO的結構和性質在本領域中已經(jīng)廣泛研究(參見EP428267Bl;EP640619Bl;Rush,Derby,Smith,Merry,Rogers,Rohde，Katta,1995，Microheterogeneityoferythropoietincarbohydratestructure,AnalChem.，67(8)，1442-52;Takeuchi，Kobata，1991，Structuresandf露tiona1rolesofthesugarchainsofhumanerythropoietins,Glycobiology,1(4),337-46(Review)。HAS可以與EP0直接偶聯(lián)，或者也可以通過一個4妄頭分子偶聯(lián)。接頭分子的性質取決于HAS與EP0連接的方式。表1及下文描述了可能的接頭官能團。有幾種接頭可以作為商品獲得(例如，來自Pierce,可獲自PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國))。表2描述了一些合適的接頭。接頭的性質及其用途在下文關于HES-EPO生產(chǎn)方法的部分中詳細描述。根據(jù)本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物的一個優(yōu)選實施方案，HAS通過一個碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)。在本發(fā)明上下文中，術語"碳水化合物部分"指羥基醛或羥基酮，以及它們的化學修飾(見R6mppChemielexikon，ThiemeVerlagStuttgart,德國，第9版1990,第9巻，2281-2285,以及此處引用的文獻)。此外它還指天然存在的碳水化合物部分(如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等)的衍生物。該術語也包括環(huán)結構已經(jīng)打開并被化學氧化的天然存在碳水化合物部分。碳水化合物部分可以與EPO多肽骨架直接連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。在這種情況下，HAS連接的碳水化合物部分與EPO多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的末端部分。在一個更優(yōu)選的實施方案中，HAS與碳水化合物側鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)，優(yōu)選與碳水化合物側鏈的末端半乳糖殘基偶聯(lián)。通過除去末端唾液酸，隨后氧化，該半乳糖殘基能夠用于偶聯(lián)(見下文)。在另外一個更優(yōu)選的實施方案中，HAS與碳水化合物側鏈的唾液酸殘基偶聯(lián)，優(yōu)選與碳水化合物側鏈的末端唾液酸殘基偶聯(lián)。此外，HAS也可以通過碌u醚與EPO偶聯(lián)。如下文詳述的，S原子可以來自于附于EPO上的任何天然或非天然存在的SH基團。在一個優(yōu)選實施方案中，S原子可以來源于被引入HES氧化碳水化合物部分(優(yōu)選作為EPO碳水化合物側鏈一部分的氧化碳水化合物部分)中的SH基團(見下文)。優(yōu)選地，硫醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者添加的半胱氨酸。更優(yōu)選EP0具有人EP0的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。在一個更優(yōu)選的實施方案中，HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)，半胱氨酸33被置換為另外一種氨基酸。此外，HAS也可以與半胱氨酸33偶聯(lián)，而半胱氨酸29被置換為另外一種氨基酸。在本發(fā)明中，術語"添加的半胱氨酸"是指多肽(優(yōu)選地EP0)含有在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。在本發(fā)明該方面，半胱氨酸可以是在EP0的N端或C端添加的額外氨基酸。此外，也可以通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。適當?shù)姆椒ㄔ诒绢I域中公知(見上文)。在本發(fā)明該方面的上下文中，EPO優(yōu)選是人EPO,置換的氨基酸殘基優(yōu)選是絲氨酸126。HAS-EP0的第二種組分是羥烷基淀粉(HAS)。在本發(fā)明中，術語"羥烷基淀粉"指被羥烷基取代的淀粉衍生物。此處，烷基可以被取代。優(yōu)選地，羥烷基含有2-10個碳原子，更優(yōu)選2-4個碳原子。因此，"羥烷基淀粉"優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。HAS的羥烷基至少含有一個0H基團。表述"鞋烷基淀粉，，也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基被卣素特別是氟、或者被芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。此外，也可以使用線性或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。對于本發(fā)明的所有實施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量(重量平均值)可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量是更優(yōu)選的。羥乙基淀粉可以進一步顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2:C6取代比。HAS-EP0的每個EP0分子可以含有1-12個，優(yōu)選1-9、1-6或l-3個，最優(yōu)選1-4個HAS分子?？梢栽诋a(chǎn)物水解及所得單糖衍生化后，利用GC-MS,通過定量碳水化合物組成分析確定每個EPO分子的HAS分子數(shù)(見Chaplin和Kennedy(編著)，1986，《碳水化合物分析一種實用方法》(CarbohydrateAnalysis:apractica1approach)，IRLPressPracticalapproachseries(ISBN0-947946-44-3)，具體見第1章，單糖，第1-36頁；第2章，寡糖，第37-53頁，第3章，中性多糖，第55-96頁)。本發(fā)明的HAS-EPO偶聯(lián)物可以顯示與重組天然EPO基本相同的體外生物活性，因為體外生物活性只取決于EPO受體的結合親和力。測定體外生物活性的方法在本領域公知(見上文)。此外，HAS-EPO也顯示比用作偶聯(lián)初始材料的EPO(未偶聯(lián)的EPO)更高的體內(nèi)活性。測定體內(nèi)生物活性的方法在本領域公知(見上文)。此外，實施例9和10也給出了測定體內(nèi)和體外EPO活性的測定法。如果將未偶聯(lián)的EPO的體內(nèi)活性設為100%,則HAS-EPO偶聯(lián)物可能顯示出110-500%、優(yōu)選300-400%,或者110%-300%、優(yōu)選、110%-200%、更優(yōu)選110%-180%，或者110-150%、最優(yōu)選110%-140%的體內(nèi)活性。與Amgen的高度唾液酸化EPO相比(見EP428267Bl),如果將高度唾液酸化EPO的體內(nèi)活性設為100%，則HAS-EPO顯示優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少85%,或者至少95%、至少150°/。、至少200%或者至少300%的高度唾液酸化EPO的體內(nèi)活性。最優(yōu)選地，它顯示至少95%的高度唾液酸化EPO的體內(nèi)活性。本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物的高體內(nèi)生物活性主要是基于以下事實該HAS-EPO偶聯(lián)物在循環(huán)中保持的時間比未偶聯(lián)的EPO更長，因為它較少被肝臟清除系統(tǒng)識別，并且由于分子量較高，腎清除減少。測定EPO在體內(nèi)4盾環(huán)半衰期的方法在本4頁》或/>^口(Sytkowski，Limn,DavisFeldman，Siekman，1998，Humanerythropoietindimmerswithmarkedlyenhancedinvivoactivity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(3),1184-8)。因此，本發(fā)明的一個明顯優(yōu)點是提供可以比目前作為商品獲得的EPO制品以更^f氐頻率施用的HAS-EPO。標準EPO制品必須至少連續(xù)施用3天，而本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物優(yōu)選每周施用兩次，更優(yōu)選每周一次。下文公開的涉及EPO或HAS特性的關于本發(fā)明生產(chǎn)HAS-EPO方法的所有實施方案，也適用于本發(fā)明的HAS-EPO偶聯(lián)物。羥烷基淀粉是淀粉的一種醚衍生物。除了所述醚衍生物以外，在本發(fā)明中也能夠使用其它淀粉衍生物。例如，可以使用含有酯化羥基的衍生物。這些衍生物可以是，例如，具有2-12個碳原子的未取代單羧酸或二羧酸的衍生物，或者其取代衍生物的衍生物。特別有用的是具有2-6個碳原子的未取代單羧酸的衍生物，特別是乙酸的衍生物。對此，乙?；矸?、丁基淀粉或丙基淀粉是優(yōu)選的。此外，含有2-6個碳原子的未取代二羧酸的衍生物也是優(yōu)選的。對于二羧酸的衍生物，二羧酸的第二個羧基也被酯化是有利的。此外，二羧酸的單烷基酯衍生物在本發(fā)明中也是適用的。對于取代的單羧酸或二羧酸，取代基優(yōu)選可以與上述用于取代烷基殘基的取代基相同。淀粉的酯化技術在本領域公知(參見，例如KlemmD.等人，《綜合纖維素化學》(ComprehensiveCelluloseChemistry)第二巻，1998，Whiley-VCH，Weinheim,紐約，具體見第4.4章，纖維素的酯化(ISBN3-527-29489-9)。另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-促紅細胞生成素(EPO)偶聯(lián)物(HAS-EPO)的方法，其包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應的EPO,b)提供能夠與步驟a)中EPO反應的修飾的HAS,和c)使步驟a)的EPO與步驟b)的HAS反應，從而產(chǎn)生一種含有一個或多個HAS分子的HAS-EPO，其中每個HAS都與EPO通過i)碳水化合物部分；或ii)硫醚偶聯(lián)。本發(fā)明的方法具有產(chǎn)生顯示高生物活性的HAS-EP0偶聯(lián)物的優(yōu)點。此外，本發(fā)明的方法也具有能夠以低成本生產(chǎn)有效的EPO衍生物的優(yōu)點，因為該方法不包括導致低終產(chǎn)率的復雜且耗時的純化步驟，例如，不需要純化掉已知顯示低體內(nèi)生物活性或者無體內(nèi)生物活性的低唾液酸化的EPO型。具體而言，實施例20證實，用極少修飾步驟生產(chǎn)的一種HES-EPO顯示3倍于標準BRP-EPO的活性。因此，在本發(fā)明方法的第一個步驟中，提供一種能夠與修飾的HAS反應的EPO。本發(fā)明所用的術語"提供，，解釋為在各步驟后，可以獲得一種具有所需特性的分子(在步驟a)中為EPO,在步驟b)中為HAS)。對于步驟a),包括從天然來源中純化EPO，以及在宿主細胞或生物中重組生產(chǎn)，以及必要時對這樣獲得的EPO進行修飾。任何關于作為本發(fā)明初始材料的EPO的情況，同樣適用于作為本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物一部分的促紅細胞生成素。對此，以上公開的優(yōu)選實施方案也適用于本發(fā)明方法。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，EPO具有人EPO的氨基酸序列。優(yōu)選EPO重組產(chǎn)生。包括在真核或原核細胞中產(chǎn)生，優(yōu)選在哺乳動物、昆蟲、酵母、細菌細胞中或者在適于重組生產(chǎn)EPO的其它任何細胞類型中產(chǎn)生。此外，EPO也可以在轉基因動物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉基因鳥類特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉基因植物中表達。多肽的重組產(chǎn)生在本領域中公知。通常包括用一種適當?shù)谋磉_栽體轉染宿主細胞，在能夠生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以及從宿主纟田胞中纟屯化多肽(Krystal，Pankratz,Farber，Smart,1986,Purificationofhumanerythropoietintohomogeneitybyarapidfive-stepprocedure,Blood，67(1)，71-9;Quelle,Caslake,Burkert,Wojchowski,1989，High—levelexpressionandpurificationofarecombinanthumanerythropoietinproducedusingabaculovirusvector,Blood,74(2)，652-7;EP640619Bl和EP668351Bl)。EPO可以含有通過N-和/或0-連接的糖基化作用與EPO連接的一個或多個碳水化合物側鏈，即EP0被糖基化。當在真核細胞中生產(chǎn)EPO時，多肽通常在翻譯后糖基化。因此，在哺乳動物，特別是在人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生物合成過程中，碳水化合物側鏈可以與EPO連接，這些細胞可以是轉基因動物的細胞(見上文)，或從動物中提取的或者仍然保留在動物中的細胞。這些碳水化合物側鏈可以在適當細胞中表達后進行化學或酶修飾，例如通過除去或添加一個或多個碳水化合物部分(參見，例如，Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer，Linde腿aier,1989，蛋白質設計進展(AdvancesinProteindesign);Bloecker,Collins,Schmidt和Sch。mburg編著，GBF-專著(GBF-Monographs)12,231-246，VCHPublishers,Weinheim，NewYork,Cambridge)。本發(fā)明方法的目的是提供一種HAS-EP0,其含有一個或多個HAS分子，其中該HAS通過碳水化合物部分(i)或者通過疏醚(ii)與EPO偶聯(lián)。因此，步驟a)提供的EP0應當具有以下特性能夠通過碳水化合物部分和/或通過硫醚偶聯(lián)。因此，在步驟a)之后，EPO優(yōu)選地可以含有(1)至少一個直接或者通過一個接頭分子與巰基團或者碳水化合物部分連接的反應性基團，其能夠與HES或修飾的HES反應，(2)至少一個修飾的HAS能夠與之偶聯(lián)的碳水化合物部分，和/或(3)至少一個游離SH基。對于上述可能性(1),步驟a)的EPO優(yōu)選地可以通過將適當?shù)慕宇^分子與EPO的SH基或碳水化合物部分偶聯(lián)獲得。實施例4中的2.1提供了這種修飾的EP0的一個實例。重要的是確保接頭分子的添加不損害EP0。而這為本領域^支術人員所/^知。對于上述可能性(2),在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的HAS通過碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)。碳水化合物部分可以與EPO多肽骨架直接連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。在這種情況下，與HAS連接的碳水化合物部分與EPO多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的末端部分。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的HAS與碳水化合物鏈連接(通過一個接頭，或者不通過接頭，見下文)，后者與EPO的N-和/或O-糖基化位點連接。然而，本發(fā)明也包括，EPO含有與修飾的HAS偶聯(lián)的其它碳水化合物部分。本領域公知通過酶或者通過遺傳工程連接碳水化合物部分與多肽的才支術，以及隨后在適當細胞中的表達(Berger,Greber,Mosbach，1986,Galactosyltransferase-dependentsialylationofcomplexandendo-NacetylglucosaminidaseH-treatedcoreN-glycansinvitro,FEBSLett.，203(1),64-8;Dittmar，Conradt,Hauser，Hofer，Lindenmaier，1989，《蛋白質設計進展》；Bloecker，Collins,Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著，12,231-246，VCHPublishers,Weinheim，NewYork,Cambridge)。在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，為了能夠與修飾的HAS反應而氧化碳水化合物部分。這種氧化能夠以化學或酶學方法進行?；瘜W氧化多肽碳水化合物部分的方法在本領域公知，包括用高碘酸鹽處理(Chamow等人，1992,J.Biol.Chem.,267,15916-15922)。通過化學氧化，原則上能夠氧化位于末端或者不位于末端的任何碳水化合物部分。然而，通過選擇溫和的條件(lmM高碘酸鹽，0,不同于嚴格條件lOmM高碘酸鹽，室溫l小時)，可以優(yōu)選地氧化碳水化合物側鏈的末端碳水化合物部分，例如唾液酸或半乳糖。此外，碳水化合物部分也可以酶氧化。用于氧化各碳水化合物部分的酶為本領域公知，例如，對于半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。如果準備氧化末端半乳糖部分，如果在能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細胞例如哺乳動物細胞中，或者在遺傳修飾后能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細胞中生產(chǎn)EP0，最終必須(部分或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化學或酶法在本領域中公知(Chaplin和Kennedy(編著)，1996,《碳水化合物分析一種實用方法》(CarbohydrateAnalysis:apracticalapproach),具體見第5章Montreuill,糖蛋白，第175—177頁；IRLPressPracticalapproachseries(ISBN0-947946-44-3))。本發(fā)明還包括，在步驟a)中將要與修飾的HAS連接的碳水化合物部分與EPO連接。如果希望連接半乳糖，可以利用半乳糖轉移酶實現(xiàn)。這些方法在本領域中公知(Berger，Greber,Mosbach，1986，Galactosyltransferase—dependentsialylationofcomplexandendo—N-acetylglucosaminidaseH-treatedcoreN-glycansinvitroFEBSLett.，203(1)，64-8)。在一個最優(yōu)選的實施方案中，在步驟a)中，必要時，優(yōu)選部分或完全除去(酶和/或化學)末端唾液酸之后，通過氧化EPO的一個或多個碳水化合物側鏈的至少一個末端糖單位(優(yōu)選半乳糖)來修飾EPO(見上文)。因此，優(yōu)選地，修飾的HAS與碳水化合物鏈氧化的末端糖單位偶聯(lián)，優(yōu)選與半乳糖偶聯(lián)。此外，修飾的HAS優(yōu)選地也可以與末端唾液酸偶聯(lián)，后者優(yōu)選地在本發(fā)明的方法的步驟a)中氧化。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中(見上述第(3)點)，EP0含有至少一個游離SH基。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，該SH基可以與一個優(yōu)選氧化的碳水化合物部分連接，例如通過使用羥胺衍生物，例如2-(氨氧基)乙硫醇鹽酸鹽(BauerL.等人，1965,J.Org.Chem.,30，949),或者通過使用酰肼衍生物，例如巰基乙酸酰肼(Whitesides等人，1977,J.Org.Chem.，42，332)。偶聯(lián)這些分子與EPO氧化碳水化合物部分的方法可以與實施例方案8和9所述類似。在一個進一步優(yōu)選的實施方案，游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。哺乳動物EPO含有幾個通常形成二好"建的半胱氨酸。然而，通過將至少一個半胱氨酸置換為另外一種氨基酸(例如通過重組方法)，可以獲得具有至少一個含游離SH基的天然存在半胱氨酸的EP0。氨基酸置換方法在本領域中公知(El1iott，Lorenzini，Chang，Barzilay，Delorme，1997，Mappingoftheactivesiteofrecombinanthumanerythropoietin,Blood，89(2)，493-502;Boissel,Lee，Presnell，Cohen,Bunn,1993，Erythropoietinstructure-functionrelationships.Mutantproteinsthattestamodeloftertiarystructure,JBiolChem.，268(21)，15983-93))。優(yōu)選地，EP0具有人EP0的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，半胱氨酸33被置換為另外一種氨基酸，在步驟c)中，修飾的HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，半胱氨酸29被置換為另一種氨基酸，在步驟c)中，修飾的HAS與半胱氨酸33偶聯(lián)。在本發(fā)明中，術語"添加的半胱氨酸"是指多肽(優(yōu)選EPO)含有—個在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。這能夠如下實現(xiàn)在多肽的N端或C端添加(例如通過重組方法)一個半胱氨酸殘基，或者將一個天然存在的氨基酸置換(例如通過重組方法)為半胱氨酸。本領域技術人員公知這些方法(見上文)。優(yōu)選地，通過將一個天然存在的氨基酸置換為一個半胱氨酸來添加半胱氨酸。在一個優(yōu)選實施方案中，EPO是人EP0，被置換的氨基酸殘基是絲氨酸126。優(yōu)選地，修飾的HAS在步驟c)中與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。在本發(fā)明方法的步驟b)中，提供能夠與步驟a)的EPO反應的修飾的HAS。對此，HAS優(yōu)選地可以在其還原性末端纟皮修飾。這樣有化學反應易于控制且技術人員能夠確保HAS的哪個基團在反應過程中被修飾的優(yōu)點。由于只將一個基團引入HAS中，能夠防止不同EP0分子通過多功能HAS分子交聯(lián)和其它副反應。因此，修飾的HAS能夠與下列成分反應(1)至少一個直接或者通過接頭分子與EP0的巰基團或碳水化合物部分連接的基團，(2)至少一個碳水化合物部分，優(yōu)選其被氧化，和/或(3)至少一個游離SH基。對于上述第(l)點，HAS的修飾取決于與EP0連接的基團。其機制在本領域中公知。實施例4中的2.1給出了一個實例。對于上述第(2)點和第(3)點，本領域公知幾種修飾HAS的方法。這些方法的基本原理是，為了能夠與碳水化合物部分或SH基反應而修飾HAS的反應性基團，或者一個接頭分子與HAS偶聯(lián)，后者含有能夠與碳水化合物部分或SH基反應的反應性基團。對于第(2)點，修飾的HAS能夠與氧化的碳水化合物部分反應，優(yōu)選與末端糖殘基、更優(yōu)選與半乳糖或者與末端唾液酸反應。已知有幾種方法可以修飾HAS，使其能夠與氧化的優(yōu)選末端糖殘基反應。如上所述，可以在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。在這種情況下，在第一步中，醛基被氧化為內(nèi)酯。這些修飾包括但不限于直接或者通過一個接頭向HAS上添加酰肼、氨基(以及羥氨基)、氨基脲或硫醇功能基團。這些技術在實施例2-4中進一步詳細描述。此外，機制本身在本領域中公知(參見，例如DE19628705Al;Hpoe等人，1981，CarbohydrateRes.,91，39;Fissekis等人，1960,JournalofMedicinalandPharmaceutica1Chemistry,2，47;Frie,1998,畢業(yè)論文，F(xiàn)achhochschuleHamburg,DE)。在本發(fā)明中，優(yōu)選添加酰肼或羥氨基官能團。在這種情況下，優(yōu)選地通過在pH5.5下進行本發(fā)明方法步驟c)的反應，確保修飾的HAS與EP0的氧化的碳水化合物部分選擇性反應，而沒有賴氨酸側鏈與氧化的糖殘基形成亞胺從而引起分子間或分子內(nèi)EP0交聯(lián)。對于第(3)點，也公知幾種用于修飾HAS的方法，使其能夠與游離SH基反應。優(yōu)選地，在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。這些方法包括但不限于向HAS添加馬來酰亞胺、二硫醚或卣代乙酰胺官能團。這些技術在實施例2-4中進一步詳細描述。關于這些技術的進一步的細節(jié)，可見Chamov等人，1992，J.Biol.Chem.,267,15916;Thorpe等人，1984，Eur.J.Biochem.，140，63;Greenfield等人,1990，CancerResearch,50,6600，以及實施例2中的1.3引用的文獻。表l列出了其它一些可能的官能團，提供了對可能的接頭分子的系統(tǒng)綜述。此外，機制本身在本領域公知?？梢栽诒景l(fā)明中使用的幾種接頭分子在本領域中公知，或者可以作為商品獲得(例如來自Pierce,可以獲自PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)。表2列出了實例。在本發(fā)明方法的步驟c)中，步驟a)的EPO與步驟b)的HAS反應，從而產(chǎn)生含一個或多個HAS分子的HAS-EPO，其中HAS通過碳水化合物部分或者通過硫醚與EPO偶聯(lián)。原則上，使EPO與修飾HAS反應的詳細方法取決于EPO和/或HAS各自的修飾，為本領域7>知(參見，例如，Rose,1994，J.Am.Chem.Soc.，116，30,0'Sha畫ssay和Wichek,1990,AnalyticalBiochemistry,191，1;Thorpe等人，1984，Eur.J.Biochem.,140，63;Chamov等人，1992,J.Biol.Chem.267,15916)。關于本發(fā)明舉例說明的方法，實施例2-4，特別是實施例4給出了詳細描述。步驟c)可以在至少含有10%重量H20的反應介質中進行。在本發(fā)明方法的這一優(yōu)選實施方案中，反應介質含有至少10°/。重量的水，優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少80%，例如90%或者可達100%。據(jù)此可以計算有機溶劑的含量。因此，該反應在水相中進行。優(yōu)選的反應介質是水。本發(fā)明方法這一實施方案的一個優(yōu)點是，不必使用在毒理學上危28此外，對于殘余的毒理學上危險的溶劑，不必進行額外的質量控制。優(yōu)選使用毒理學上不危險的溶劑作為有機溶劑，如乙醇或丙二醇。本發(fā)明方法的另外一個優(yōu)點是，避免了有機溶劑誘導的不可逆的或可逆的結構改變。因此，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的多肽不同于在有機溶劑(如DMS0)中制備的多肽。此外，也意外地發(fā)現(xiàn)，HAS與藥物在水溶液中的偶聯(lián)最小化或者避免了副反應。因此，本發(fā)明方法的這個實施方案產(chǎn)生高純度的改良產(chǎn)物。在本發(fā)明中，術語"羥烷基淀粉"指被羥烷基取代的淀粉衍生物。其中，烷基可以被取代。優(yōu)選羥烷基含有2-10個碳原子，更優(yōu)選2-4個碳原子。因此"羥烷基淀粉"優(yōu)選地包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。HAS的羥烷基含有至少一個OH基。對于本發(fā)明的所有實施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。表述"羥烷基淀粉，，也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基可以被卣素特別是氟、或者芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。此外，除了烷基，也可以使用線性或分支的取代或未取代的歸基。在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量可以是1-300kDa，其中5-10GkDa的平均分子量是更優(yōu)選的。羥乙基淀粉可以進一步顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度，和2-20的C2:C6取代比。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的HAS-EPO能夠被如下純化和表征HAS-EPO的分離可以用已知的純化天然和重組EPO的方法進行(例如大小排阻層析、離子交換層析、RP-HPLC、羥基磷灰石層析、疏水作用層析、實施例20.8所述的方法或其組合)。HAS與EPO多肽的共價連接能夠在修飾蛋白質水解后通過碳水化合物組成分析證實(EPO的三個N-糖基化位點上存在羥乙基葡萄糖與甘露糖之比)。EP0的N-連接寡糖處的HAS修飾能夠如下證實除去HAS修飾的N-聚糖，利用SDS-PAGE+/-WesternBlotting觀察預知的向較高遷移率的轉變。EPO在半胱氨酸殘基處的HAS修飾能夠根據(jù)以下情況證實通過RP-HPLC和MALDI/TOF-MS不能在HAS修飾產(chǎn)物的蛋白水解片段中檢測到相應的蛋白水解Cys-肽(Zhou等人，1998，Applicationofcapillaryelectrophoresis,liquidchromatography,electrospray-massspectrometryandmatrix—assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometrytothecharacterizationofrecombinanthumanerythropoietin.Electrophoresis,19(13)，2348-55)。在蛋白水解消化Cys-修飾的EP0后，分離含有HAS的級分能夠通過常規(guī)氨基酸組成分析證實該級分中含有相應的肽。以上公開的涉及EPO或HAS特性的關于本發(fā)明HAS-EPO的所有實施方案，也適用于本發(fā)明制備HAS-EPO的方法。本發(fā)明還涉及一種可通過本發(fā)明方法獲得的HAS-EP0。優(yōu)選地，該HAS-EPO具有上述限定本發(fā)明HAS-EPO的特征。本發(fā)明還涉及在治療人或動物體的方法中使用的本發(fā)明HAS-EPO。此外，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明HAS-EPO的藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，該藥物組合物還含有至少一種在促紅細胞生成素治療中使用的藥學可接受稀釋劑、佐劑和/或載體。優(yōu)選地，該藥物組合物用于治療貧血性疾病或造血功能障礙疾病或與之有關的疾病。如此處所用的"治療有效量"是指對于指定病癥和施用方案提供治療效果的量。促紅細胞生成素同種型優(yōu)選地通過腸胃外途徑施用。選擇的具體途徑取決于治療的疾病。促紅細胞生成素同工型優(yōu)選作為含有適當載體(如人血清白蛋白)、適當稀釋劑(如緩沖液)和/或30適當佐劑的制劑的一部分施用。需要的劑量是足以提高患者血細胞比容的量，根據(jù)治療疾病的嚴重程度、施用方法等而不同。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物治療的目的是將血液中血紅蛋白值提高至6.8mmo1/1以上。為此，可以施用藥物組合物，使得血紅蛋白值每周提高0.6mmol/1-l.6mmo1/1。如果血紅蛋白值超過8.7mmo1/1，優(yōu)選地應當中斷治療，直到血紅蛋白值低于8.1mmo1/1。本發(fā)明組合物優(yōu)選地在適于皮下或靜脈內(nèi)或腸胃外注射的制劑中使用。為此，適當?shù)馁x形劑和載體是，例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯酸鈉、聚山梨醇酯80(polysorbate80)、HAS和注射用水。該組合物可以每周施用三次，優(yōu)選每周兩次，更優(yōu)選每周一次，最優(yōu)選每兩周一次。優(yōu)選地，該藥物組合物以0.01-10pg/kg患者體重的量施用，更優(yōu)選G.1-5pg/kg,G.1-1ng/kg或0.2-0.9|tig/kg，最優(yōu)選0.3-0.7pg/kg,最優(yōu)選O.4-0.6pg/kg體重。優(yōu)選地，每次劑量通常施用10pg-200fig，優(yōu)選15w100pg本發(fā)明還涉及本發(fā)明HAS-EPO在制備治療貧血疾病或造血功能障礙疾病或與之有關疾病的藥物中的應用。根據(jù)本發(fā)明的另外一個方面，用含有一個或多個羥烷基淀粉(HAS)分子的HAS-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)解決了問題，其中每個HAS與多肽通過a)碳水化合物部分；或b)硫醚偶聯(lián)。本發(fā)明HAS-多肽具有以下優(yōu)點與偶聯(lián)前的多肽相比，其顯示生物穩(wěn)定性提高。這主要是由于以下事實HAS-多肽很少或者不被肝臟和腎臟的清除系統(tǒng)識別，因此在循環(huán)系統(tǒng)中長時間存在。此外，由于HAS一皮位點特異性地連接，因HAS與多肽偶聯(lián)而石皮壞該多肽體內(nèi)生物活性的危險被最小化。本發(fā)明HAS-多肽主要含有兩種成分，即多肽和與之連接的羥烷基淀粉(HAS)。該多肽可以是任何人或動物來源的。在一個優(yōu)選實施例中，該多肽是人來源的。該多肽可以是細胞因子特別是促紅細胞生成素，抗凝血酶(AT)如ATin,白介素特別是白介素-2、IFN-(3、IFN-ot、G-CSF、CSF、白介素-6和治療抗體。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，該多肽是抗凝血酶(AT)，優(yōu)選是ATIII(LevyJH，WeisingerA，ZiomekCA，EchelardY，RecombinantAntithrombin:ProductionandRoleinCardiovascularDisorder,SeminarsinThrombosisandHemostasis27，4(2001)405-416;EdmundsT,VanPattenSM，PollockJ，HansonE,BernasconiR，HigginsE,ManavalanP，ZiomekC，MeadeH，McPhersonJ，ColeES,Transgenica1lyProducedHumanAntithrombin:StructuralandFunctionalComparisontoH畫anPlasma-DerivedAntithrombin，Blood91，12(1998)4661-4671;Mi謎maMC，ChangACK，JansenPM，LubbersYTP，PrattBM，WhittakerBG，TaylorFB，HackCE，F(xiàn)riedmanB，RecombinanthumanantithrombinIIIimprovessurvivalandattenuatesinflammatoryresponsesinbaboonslethallychallengedwithEscherichiacoli,Blood95，4(2000)1117-1123;VanPattenSM，HansonEH，BernasconiR，ZhangK，ManavalnP，ColeES，McPhersonJM，EdmundsT,OxidationofMethionineResiduesinAntithrombin,J.Biol.Chemistry274，15(1999)10268-10276)。根據(jù)另外一個優(yōu)選實施方案，該多肽是人IFN-(3,特別是IFN-(3la(參見Avo證⑧，REBIF⑧)和IFN-)3lb(參見BETASERON)。另外一種優(yōu)選的多肽是人G-CSF(粒細胞集落刺激因子)。參見，例^口，Nagata等人,ThechromosomalgenestructureandtwomRNAsforhumangranulocytecolony-stimulatingfator，EMBOJ.5:575-581，1986;Souza等人，Recombinanthumangranulocyte32colony-stimulatingfactor:effectsonnormalandleukemicmyeloidcells,Science232(1986)61-65;Herman等人，Characterization,formulation,andstabilityofNeupogen(Filgrastim),arecombinanthumangranulocyte-colonystimulatingfactor,見《蛋白質藥物的配制、表^正和穩(wěn)、定性》(Formulalion，characterization,andstabilityofproteindrugs)，RodneyPearlman和Y.JohnWang編著，PlenumPress,NewYork,1996，303-328。關于促紅細胞生成素，以上公開的所有實施方案在此也適用。優(yōu)選地，該多肽通過重組產(chǎn)生。包括在真核或原核細胞中產(chǎn)生，優(yōu)選在哺乳動物、昆蟲、酵母、細菌細胞中，或者在適于重組生產(chǎn)多肽的其它任何細胞類型中產(chǎn)生。此外，多肽也可以在轉基因動物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉基因鳥特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉基因植物中表達。多肽的重組產(chǎn)生在本領域中公知。通常包括用一種適當?shù)谋磉_載體轉染宿主細胞，在能夠產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以及從宿主細胞中純化多肽。關于詳細信息，參見，例如Krystal，Pankratz，F(xiàn)arber，Smart,1986，Purificationofhumanerythropoietintohomogeneitybyarapidfive-stepprocedure,Blood，67(1)，71-9;Quelle,Caslake，Burkert,Wojchowski，1989，High-levelexpressionandpurificationofarecombinanthumanerythropoietinproducedusingabaculovirusvector,Blood,74(2),652-7;EP640619Bl和EP668351Bl。多肽可以含有通過N-和/或0-連接的糖基化作用與該多肽連接的一個或多個碳水化合物側鏈，即該多肽^皮糖基化。當在真核細胞中生產(chǎn)多肽時，該多肽通常在翻譯后被糖基化。因此，在哺乳動物特別是人、昆蟲或酵母細胞中生物合成過程中，碳水化合物側鏈可以與該多肽連接。HAS可以直接與多肽偶聯(lián)，或者可以通過接頭分子偶聯(lián)。接頭分33子的性質取決于HAS與多肽連接的方式。有幾種接頭可以作為商品獲得(例如，來自Pierce，見上文)。接頭的性質及其用途在以下關于HES-多肽生產(chǎn)方法的部分中詳細描述。根據(jù)本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物的一個優(yōu)選實施方案，HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)。優(yōu)選地，當多肽是抗凝血酶優(yōu)選ATIII時，同樣適用。在本發(fā)明中，術語"碳水化合物部分"指羥基醛或羥基酮，以及它們的化學修飾(見R6mppChemielexikon,ThiemeVerlagStuttgart,德國，第9版，9，2281-2285,和此處引用的文獻)。此外，它也指天然存在的碳水化合物部分(如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等)的衍生物。該術語也包括環(huán)結構已經(jīng)打開并被化學氧化的天然存在碳水化合物部分。碳水化合物部分可以直接與多肽骨架連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。在這種情況下，HAS連接的碳水化合物部分與多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的末端部分。在一個更優(yōu)選的實施方案中，HAS與碳水化合物側鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)，優(yōu)選地與碳水化合物側鏈的末端半乳糖殘基偶聯(lián)。通過除去末端唾液酸，隨后氧化，該半乳糖殘基可以用于偶聯(lián)(見下文)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，HAS與^友水化合物側《連的唾液酸殘基偶聯(lián)，優(yōu)選與碳水化合物側鏈的末端唾液酸殘基偶聯(lián)。此外，HAS也可以通過碌u醚與多肽偶聯(lián)。如下文詳述的，S原子可以來自于附于多肽上的任何天然或非天然存在的SH基團。在一個優(yōu)選實施方案中，S原子可以來源于被引入HES氧化碳水化合物部分(優(yōu)選作為多肽碳水化合物側鏈一部分的氧化碳水化合物部分)中的SH基團(見下文)。優(yōu)選地，辟u醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者來源于添加的半胱氨酸。在本發(fā)明的上下文中，術語"添加的半胱氨酸"指多肽含有在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。在本發(fā)明該方面中，半胱氨酸可以是在多肽的N端或C端添加的額外氨基酸。此外，也可以通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。HAS-多肽的第二種組分是HAS。在本發(fā)明中，術語"羥烷基淀粉"指被羥烷基取代的淀粉衍生物。其中，烷基可以被取代。優(yōu)選地，羥烷基含有2-10個碳原子，更優(yōu)選2-4個碳原子。因此，"羥烷基淀粉"優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。HAS的羥烷基至少含有一個0H基。"羥烷基淀粉，，也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基被卣素特別是氟、或者芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。此外，也可以使用線性或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。對于本發(fā)明的所有實施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量(重量平均值)可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量更優(yōu)選。羥乙基淀粉可以進一步顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2:C6取代比。HAS-多肽每個多肽分子可以含有1-12個，優(yōu)選1-9、1-6或l-3個，最優(yōu)選1-4個HAS分子。每個多肽分子的HAS分子數(shù)能夠在產(chǎn)物水解及所得單糖衍生化后，利用GC-MS,通過定量碳水化合物組成分析來確定(Chaplin和Kennedy(編著)，1986，《碳水化合物分析一種實用方法》(CarbohydrateAnalysis:apractica1approach),第1章，單糖，第1-36頁；第2章，寡糖，第37-53頁，第3章，中性多糖，第55-96頁；IRLPressPracticalapproachseries(ISBN0-947946-44-3"。以下公開的涉及多肽或HAS性質的本發(fā)明生產(chǎn)HAS-多肽的方法的所有實施方案也適用于本發(fā)明HAS-多肽。此外，以上公開的通常涉及肽或HAS的關于HAS-EPO或其制備的所有實施方案也適用于本發(fā)明的HAS-多肽。羥烷基淀粉是淀粉的一種醚衍生物。除了所述醚衍生物以外，在本發(fā)明中也能夠使用其它淀粉衍生物。例如，可以使用含有酯化羥基的衍生物。這些衍生物可以是，例如，具有2-12個碳原子的未取代單羧酸或二羧酸的衍生物，或其取代衍生物的衍生物。特別有用的是具有2-6個碳原子的未取代單羧酸的衍生物，特別是乙酸的衍生物。在上下文中，乙?；矸邸⒍』矸刍虮矸凼莾?yōu)選的。此外，具有2-6個碳原子的未取代二羧酸的衍生物也是優(yōu)選的。對于二羧酸的衍生物，二羧酸的第二個羧基也被酯化是有利的。此外，二羧酸的單烷基酯衍生物在本發(fā)明中也是適用的。對于取代的單羧酸或二羧酸，取代基優(yōu)選可以與上述用于取代烷基殘基的取代基相同。淀粉的酯化技術在本領域公知(參見，例如，KlemmD.等人，《綜合纖維素化學》(ComprehensiveCelluloseChemistry)第2巻，1998，Whiley-VCH，Weinheira,紐約，具體見第4.4章，纖維素的酯化(ISBN3-527-29489-9)。另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)的方法，其包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應的多肽，b)提供能夠與步驟a)中多肽反應的修飾的HAS,和c)使步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應，從而產(chǎn)生一種含有一個或多個HAS分子的HAS-多肽，其中每個HAS都與該多肽通過i)碳水化合物部分；或n)碌u醚偶聯(lián)。本發(fā)明的方法具有生產(chǎn)顯示高生物活性的HAS-多肽偶聯(lián)物的優(yōu)點。此外，本發(fā)明的方法也具有能夠以低成本生產(chǎn)有效的多肽衍生物的優(yōu)點，因為該方法不包括導致低終產(chǎn)量的復雜且耗時的純化步驟。因此，在本發(fā)明的方法的第一個步驟中，提供能夠與修飾的HAS反應的一種多肽。本發(fā)明所用的術語"提供，，解釋為在各步驟后，可以獲得一種具有所需特性的分子(在步驟a)中為多肽，在步驟b)中為HAS)。對于步驟a),包括從天然來源中純化多肽，以及在宿主細胞或生物中重組生產(chǎn)，以及必要時對這樣獲得的多肽進行修飾。任何關于作為本發(fā)明初始材料多肽的情況，同樣適用于作為本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物一部分的促紅細胞生成素。對此，以上公開的優(yōu)選實施方案也適用于本發(fā)明方法。優(yōu)選多肽是重組產(chǎn)生的。包括在真核或原核細胞中產(chǎn)生，優(yōu)選地在哺乳動物、昆蟲、酵母、細菌細胞中或者在適于重組生產(chǎn)多肽的其它任何細胞類型中產(chǎn)生。此外，多肽也可以在轉基因動物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉基因鳥特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉基因植物中表達。多肽的重組產(chǎn)生在本領域中公知。通常包括用一種適當?shù)谋磉_載體轉染宿主細胞，在能夠生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以及從宿主細胞中純化多肽(Krystal,Pankratz，F(xiàn)arber，Smart,1986，Purificationofhumanerythropoietintohomogeneitybyarapidfive-stepprocedure,Blood,67(1)，71-9;Quelle,Caslake，Burkert,Wojchowski，1989,High—levelexpressionandpurificationofarecombinanthumanerythropoietinproducedusingabaculovirusvector,Blood,74(2),652-7;EP640619Bl和EP668351Bl)。多肽可以含有通過N-和/或0-連接的糖基化作用與該多肽連接的一個或多個碳水化合物側鏈，即該多肽被糖基化。當在真核細胞中生產(chǎn)多肽時，多肽通常在翻譯后糖基化。因此，在哺乳動物特別是在人、昆蟲或酵母細胞中生物合成過程中，碳水化合物側鏈可以與多肽連接，這些細胞可以是轉基因動物的細胞(見上文)。這些碳水化合物側鏈可以在適當細胞中表達后化學或酶修飾，例如通過除去或添加一個或多個,友水化合物部分(參見，例如，Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer，Linde腿aier，1989,蛋白質設計進展；Bloecker，Collins,Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著，12，231-246,VCHPublishers,Weinheim，NewYork,Cambridge)。本發(fā)明的方法的目的是提供一種含有一個或多個HAS分子的HAS-多肽，其中該HAS通過碳水化合物部分(i)或者通過^L醚(ii)與多肽偶聯(lián)。因此，步驟a)提供的多肽應當具有以下特性能夠通過碳水化合物部分和/或通過硫醚偶聯(lián)。因此，在步驟a)之后，多肽優(yōu)選地可以含有(1)至少一個直接或者通過接頭分子與巰基團或者碳水化合物部分連接的反應性基團，能夠與HES或修飾的HES反應，(2)至少一個能夠與修飾的HAS偶聯(lián)的碳水化合物部分，和/或(3)至少一個游離SH基。對于上述可能性(l),步驟a)的多肽優(yōu)選地可以通過將適當?shù)慕宇^分子與多肽的SH基或碳水化合物部分偶聯(lián)獲得。實施例4中的2.1提供了這種修飾的多肽的一個實例。重要的是確保接頭分子的添加不損害多肽。而這為本領域技術人員所公知。對于上述可能性(2)，在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)。碳水化合物部分可以與多肽骨架直接連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。在這種情況下，與HAS連接的碳水化合物部分與多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的末端部分。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的HAS與碳水化合物鏈連接(通過一個接頭，或者不通過接頭，見下文)，后者與多肽的N-和/或0-糖基化位點連接。然而，本發(fā)明也包括，多肽含有與修飾的HAS偶聯(lián)的其它碳水化合物部分。本領域公知通過酶或者通過遺傳工程連接碳水化合物部分與多肽的沖支術，以及隨后在適當細胞中的表達(Berger,Greber，Mosbach，1986,Galactosy1transferase-dependentsialylationofcomplexandendo-NacetylglucosaminidaseH—treatedcoreN-glycansinvitro，F(xiàn)EBSLett.，203(1)，64-8;Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer,Linde腿aier,1989，《蛋白質設計進展》；Bloecker，Collins,Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著，12,231-246，VCHPublishers,Weinheim,NewYork,Cambridge)。在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，為了能夠與修飾的HAS反應而氧化碳水化合物部分。這種氧化能夠以化學或酶學方法進行?；瘜W氧化多肽碳水化合物部分的方法在本領域公知，包括用高碘酸鹽處理(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267,15916-15922)。通過化學氧化，原則上能夠氧化位于末端或者不位于末端的任何碳水化合物部分。然而，通過選擇溫和的條件(lmM高碘酸鹽，0，不同于嚴格條件10mM高碘酸鹽，室溫l小時)，可以優(yōu)選地氧化碳水化合物側鏈的末端碳水化合物部分，例如唾液酸或半乳糖。此外，碳水化合物部分也可以酶氧化。用于氧化各碳水化合物部分的酶在本領域公知，例如，對于半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。如果準備氧化末端半乳糖部分，如果在能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細胞例如在哺乳動物細胞中，或者在遺傳修飾后能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細胞中生產(chǎn)多肽，最終必須(部分或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化學或酶法在本領域中7>知(Chaplin和Kennedy(編著)，1996,《碳水化合物分析一種實用方法》，具體見第5章Montreuill,糖蛋白，第175—177頁；IRLPressPracticalapproachseries(ISBN0-947946-44-3))。然而，本發(fā)明也包括在步驟a)中將要與修飾的HAS連接的碳水化合物部分與多肽連接。如果希望連接半乳糖，可以利用半乳糖轉移酶實現(xiàn)。這些方法在本領域中公知(Berger，Greber，Mosbach,1986，Galactosy1transferase—dependentsialylationofcomplexandendo-N—acetylglucosaminidaseH—treatedcoreN-glycansinvitroFEBSLett.，203(1)，64-8)。在一個最優(yōu)選的實施方案中，在步驟a)中，必要時，優(yōu)選在部分或完全(酶和/或化學)除去末端唾液酸之后，通過氧化多肽的一個或多個碳水化合物側鏈的至少一個末端糖單位(優(yōu)選半乳糖)來修飾多肽(見上文)。因此，優(yōu)選修飾的HAS與碳水化合物鏈被氧化的末端糖單位偶聯(lián)，優(yōu)選與半乳糖偶聯(lián)。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中(見上文第(3)點)，多肽含有至少一個游離SH基。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。氨基酸置換方法在本領域中公知(Elliott,Lorenzini，Chang,Barzilay，Delorme，1997,Mappingoftheactivesiteofrecombinanthumanerythropoietin,Blood,89(2),493-502;Boissel,Lee，Presnell，Cohen,Bunn,1993，Erythropoietinstructure-functionrelationships.Mutantproteinsthattestamodeloftertiarystructure,JBiolChem.，268(21),15983-93))。在本發(fā)明中，術語"添加的半胱氨酸"是指多肽含有一個在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。這能夠如下實現(xiàn)在多肽的N端或C端添加(例如通過重組方法)一個半胱氨酸殘基，或者將一個天然存在的氨基酸置換(例如通過重組方法)為半胱氨酸。本領域技術人員公知這些方法(見上文)。優(yōu)選地，通過將一個天然存在的氨基酸置換為一個半胱氨酸來添加半胱氨酸。優(yōu)選地，修飾的HAS在步驟c)中與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。在本發(fā)明的方法的步驟b)中，提供能夠與步驟a)的多肽反應的修飾的HAS。對此，HAS優(yōu)選地可以在其還原性末端^皮修飾。這樣有化學反應40易于控制且技術人員能夠確保HAS的哪個基團在反應過程中被修飾的優(yōu)點。由于只將一個基團引入HAS中，能夠防止不同多肽分子通過多功能HAS分子交聯(lián)和其它副反應。因此，修飾的HAS能夠與下列成分反應(1)至少一個直接或者通過接頭分子與多肽的巰基團或碳水化合物部分連接的基團，(2)至少一個碳水化合物部分，優(yōu)選其被氧化，和/或(3)至少一個游離SH基。對于上述第(l)點，HAS的修飾取決于與多肽連接的基團。其機制在本領域中公知。實施例4中的2.1給出了一個實例。對于上述第(2)點和第(3)點，本領域公知幾種修飾HAS的方法。這些方法的基本原理是，為了能夠與碳水化合物部分或SH基反應而修飾HAS的反應性基團，或者一個接頭分子與HAS偶聯(lián)，后者含有能夠與碳水化合物部分或SH基反應的反應性基團。對于第(2)點，修飾的HAS能夠與氧化的碳水化合物部分反應，優(yōu)選與末端糖殘基、更優(yōu)選與半乳糖或者與末端唾液酸反應。公知幾種方法可以修飾HAS,使其能夠與氧化的優(yōu)選末端糖殘基反應。如上所述，可以在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。在這種情況下，在第一步中，醛基被氧化為內(nèi)酯。這些修飾包括但不限于直接或者通過接頭向HAS上添加酰肼、氨基(以及羥氨基)、氨基脲或硫醇官能基團。這些技術在實施例2-4中進一步詳細描述。此外，機制本身在本領域中公知(參見，例如DE19628705Al;Hpoe等人，1981,CarbohydrateRes.，91，39;Fissekis等人，1960，JournalofMedicinalandPharmaceuticalChemistry,2，47;Frie，1998,畢業(yè)i侖文，F(xiàn)achhochschuleHamburg,DE)。在本發(fā)明中，優(yōu)選添加酰肼或羥氨基官能團。在這種情況下，優(yōu)選地通過在pH5.5下進行本發(fā)明方法步驟c)的反應，確保修飾的HAS與多肽的氧化的碳水化合物部分選擇性反應，而沒有賴氨酸側鏈與氧化的糖殘基形成亞胺從而引起分子間或分子內(nèi)多肽交聯(lián)。對于第(3)點，也公知幾種用于修飾HAS的方法，使其能夠與游離SH基反應。優(yōu)選地，在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。這些方法包括但不限于向HAS添加馬來酰亞胺、二硫醚或鹵代乙酰胺官能團。這些技術在實施例2-4中進一步詳細描述。關于這些技術的進一步的細節(jié)，可見Chamov等人，1992,J.Biol.Chem.，267，15916;Thorpe等人，1984,Eur.J.Biochem.，140,63;Greenfield等人，1990，CancerResearch,50，6600,以及實施例2中的1.3引用的文獻。表l列出了其它一些可能的官能團，提供了對可能的接頭分子的系統(tǒng)綜述。此外，機制本身在本領域公知?？梢栽诒景l(fā)明中使用的幾種接頭分子在本領域中公知，或者可以作為商品獲得(例如來自Pierce,可以獲自PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)。在本發(fā)明的方法的步驟c)中，步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應，從而產(chǎn)生含有一個或多個HAS分子的HAS-多肽，其中HAS通過碳水化合物部分或者通過硫醚與該多肽偶聯(lián)。原則上，使多肽與修飾HAS反應的詳細方法取決于多肽和/或HAS各自的修飾，為本領域中/^知(參見，例如Rose，1994，J.Am.Chem.Soc.,116,30，O'Sha畫ssay和Wichek，1990,AnalyticalBiochemistry,191，1;Thorpe等人，1984，Eur.J.Bio-chem.，140，63;Chamov等人，1992，J,Biol.Chem.267,15916)。對于本發(fā)明舉例說明的方法，實施例2-4,特別是實施例4中給出了詳細描述。步驟c)可以在至少含有10%重量H20的反應介質中進行。在本發(fā)明方法的這一優(yōu)選實施方案中，反應介質含有至少10%重量的水，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少80%,例如90%或者可達100%。據(jù)此可以計算有機溶劑的含量。因此，該反應在水相中進行。優(yōu)選的反應介質是水。本發(fā)明方法的這一實施方案的一個優(yōu)點是，不必使用在毒理學上染。此外，對于殘余的毒理學上危險的溶劑，不必進行額外的質量控制。優(yōu)選使用毒理學上不危險的溶劑作為有機溶劑，如乙醇或丙二醇。本發(fā)明的方法的另外一個優(yōu)點是，避免了有機溶劑誘導的不可逆的或可逆的結構改變。因此，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的多肽不同于在有機溶劑(如DMSO)中制備的多肽。此外，也意外地發(fā)現(xiàn)，HAS與藥物在水溶液中的偶聯(lián)最小化或者避免了副反應。因此，本發(fā)明方法的這個實施方案產(chǎn)生高純度的改良產(chǎn)物。在本發(fā)明中，術語"羥烷基淀粉"是指被羥烷基取代的淀粉衍生物。其中，烷基可以被取代。優(yōu)選羥烷基含有2-10個碳原子，更優(yōu)選2-4個碳原子。因此"羥烷基淀粉"優(yōu)選地包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。HAS的羥烷基含有至少一個0H基。對于本發(fā)明的所有實施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。術語"羥烷基淀粉"也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基可以被卣素特別是氟、或者芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。此外，也可以使用線性或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量可以是1-300kDa,其中5-100kDa的平均分子量是更優(yōu)選的。羥乙基淀粉能夠進一步顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2:C6取代比。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的HAS-多肽能夠被如下純化和表征HAS-多肽的分離可以用已知的純化天然和重組多肽的方法進行(例如大小排阻層析、離子交換層析、RP-HPLC、羥基磷灰石層析、疏水相互作用層析、實施例20.8所述的方法或其組合)。HAS與多肽的共價連接能夠在修飾的蛋白質水解后通過碳水化合43物組成分析i正實。在多肽的N-連接寡糖處的HAS修飾能夠如下證實除去HAS修飾的N-聚糖，利用SDS-PAGE+/-WesternBlotting觀察預知的向較高遷移率的轉變。多肽在半胱氨酸殘基處的HAS修飾能夠根據(jù)以下情況證實在HAS修飾產(chǎn)物的蛋白水解片段中，通過RP-HPLC和MALDI/TOF-MS不能檢測到相應的蛋白水解Cys-肽(Zhou等人，1998，Applicationofcapillaryelectrophoresis,liquidchromatography,electrospray-massspectrometryandmatrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometrytothecharacterizationofrecombinanthumanerythropoietin-Electrophoresis,19(13)，2348-55)。在蛋白水解消化Cys-修飾的多肽后，分離含有HAS的級分能夠通過常^見氨基酸組成分析證實該級分中含有相應的肽。以上公開的涉及多肽或HAS性質的關于本發(fā)明HAS-多肽的所有實施方案，也適用于本發(fā)明生產(chǎn)HAS-多肽偶聯(lián)物的方法。此外，以上公開的涉及一般性肽或HAS的關于HAS-EPO或其制備的所有實施方案，也適用于本發(fā)明生產(chǎn)HAS-多肽偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明還涉及一種可通過本發(fā)明方法獲得的HAS-多肽。優(yōu)選地，該HAS-多肽具有上述用于限定本發(fā)明HAS-EPO的特征。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，使用的HAS具有下列通式(I)其中，R,、R2和R3分別是氫，或者是直鏈或支鏈羥烷基。本發(fā)明所用的術語"羥烷基淀粉"不只限于末端碳水化合物部分含有如通式(I)所示的羥烷基l、R2和/或R3的化合物(為了簡短起見)，也指如44下化合物在末端碳水化合物部分和/或淀粉分子的其余部分HAS，中任何處存在的至少一個羥基被羥烷基R,、R2或R3取代。其中，烷基可以是直鏈或支鏈烷基，它可以被適當?shù)娜〈?。?yōu)選地，羥烷基含有i-io個碳原子，更優(yōu)選1-6個碳原子，更優(yōu)選1-4個碳原子，更優(yōu)選2-4個碳原子。因此，"羥烷基淀粉"優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是特別優(yōu)選的，尤其優(yōu)選羥乙基淀粉。HAS(優(yōu)選HES)可以與交聯(lián)化合物反應，該交聯(lián)劑可以與HAS(優(yōu)選HES)反應，并且可與多肽(如上述多肽)反應。HAS與交聯(lián)化合物之間的反應可以在HAS的還原性末端或在HAS的氧化的還原性末端發(fā)生。因此，具有通式(I)結構的HAS和/或通式(11b)結構的HAS可以反應。如果通式(I)的HAS與交聯(lián)化合物反應，則反應優(yōu)選在水介質中發(fā)生。如果通式(IIa)和/或(IIb)的HAS與交聯(lián)化合物反應，則反應優(yōu)選在非水介質中發(fā)生，例如極性非質子溶劑或溶劑混合物如DMS0，和/或DMF。如果通過含有HAS和交聯(lián)化合物的HAS衍生物與多肽的氧化的碳水化合物部分反應產(chǎn)生本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物，則該交聯(lián)化合物優(yōu)選地是下述化合物H,N—NH.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>如果通過含有HAS和至少一種交聯(lián)化合物的HAS衍生物與多肽的巰基反應產(chǎn)生本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物，則優(yōu)選地，HAS在任選氧化的還原性末端與第一種交聯(lián)化合物反應，該交聯(lián)化合物優(yōu)選是下述化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>并且產(chǎn)生的HAS衍生物與第二種交聯(lián)化合物反應，第二種交聯(lián)化合物能夠與該HAS衍生物和多肽的巰基反應。例如，如果HAS衍生物含有結構-NH-作為與第二種交聯(lián)化合物反應的官能團，則如上詳述的，含有官能團Fl和F2的以下類型的第二種交聯(lián)化合物尤其是優(yōu)選的化合物類型(L)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula>是特別優(yōu)選的。根據(jù)各自的反應條件、使用的溶劑或溶劑混合物和/或在水介質中與HAS反應的化合物R'-NH-R"的殘基R'和/或R"，通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物可以具有下列結構(ma):因此，本發(fā)明也涉及如上所述具有通式(IIIa)結構的羥烷基淀粉書亍生物。例如，如果IT是氫，則通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物也可能具有下列結構(nia)或(IIIb)，其中(IIIa)和(nib)可以在反應混合物中同時存在，并具有一定的平衡分布<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>(Ilia)卿)因此，本發(fā)明也涉及如上所述具有根據(jù)通式(nib)結構的羥烷基淀粉衍生物。而且，本發(fā)明也涉及以上述通式(IIIa)和(IIIb)結構的混合物存在的羥烷基淀粉衍生物。根據(jù)反應條件和/或用于反應的化合物R'-NH-R"的化學性質，通式(IIIa)的化合物可以在平伏位置或直立位置含有N原子，也可能存在具有一定平衡分布的兩種型式的混合物。根據(jù)反應條件和/或用于反應的化合物IT-NH-R"的化學性質，通式(IIIb)化合物可能含有E或Z構象的C-N雙鍵，也可能存在具有一定平衡分布的兩種型式的混合物。在某些情況下，可能希望穩(wěn)定通式(ffla)的化合物，特別是在水溶液中生產(chǎn)并使用通式(IIIa)的化合物時。作為穩(wěn)定方法，特別優(yōu)選?；ㄊ?nia)的化合物，特別是當r是氫時?？梢允褂卯a(chǎn)生通式(iva)的羥烷基淀粉衍生物的任何適當試劑作為酰化劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>(IVa)根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案，作為酰化劑一部分的殘基Ra是甲基。優(yōu)選使用羧酸酐、羧酸酰卣和羧酸活化的酯作為?；瘎Ｒ虼?，本發(fā)明也涉及可以通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物，其中該衍生物具有通式(IVa)的結構。?；?-30下進行，優(yōu)選地在2-20下進行，特別優(yōu)選地在4-10下進4亍。在其它一些情況下，可能希望穩(wěn)定通式(nib)的化合物，特別是當在水溶液中生產(chǎn)和/或使用通式(IIIb)的化合物時。作為穩(wěn)定方法，還原通式(nib)的化合物是特別優(yōu)選的，特別是當R'是氫時?？梢允褂卯a(chǎn)生通式(IVb)的羥烷基淀粉衍生物的任何適當試劑作為還原劑。(IVb)HNHR'根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案，使用硼氫化物如NaCNBH.,或NaBH4,作為還原試劑。因此，本發(fā)明也涉及可以通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物，其中該衍生物具有通式(IVb)的結構。還原在4-100下進行，優(yōu)選地在10-90下進行，特別優(yōu)選地在25-80下進行。本發(fā)明還涉及化合物(nia)和(IIIb)、(IVa)和(IVb)、(IIIa)和(VIa)、(nia)和(IVb)、(nib)和(IVa)、(IIIb)和(IVb)、(ffla)和(IIIb)和(IVa)、(IIIa)和(IIIb)和(IVb)、(IVa)和(IVb)和(IIIa),以及(IVa)和(IVb)和(IIIb)的混合物，其中(IHa)和/或(IVa)可以獨立地以N原子位于平伏或直立位置的構象存在，和/或(IIIb)可以以E或Z構象的C-N雙鍵形式存在。本發(fā)明還涉及在治療人或動物體的方法中使用的本發(fā)明的HAS-多肽。此外，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明HAS-多肽的藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，該藥物組合物還含有至少一種在促紅細胞生成素治療中使用的藥學可接受的稀釋劑、佐劑和/或載體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明HAS-多肽在制備治療貧血性疾病或造血功能障礙性疾病或與之相關疾病的藥物中的應用。本發(fā)明通過下列附圖、表和實施例進一步說明，它們絕非旨在限制本發(fā)明的范圍。圖1圖1顯示兩種HES-EP0偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析mw:分子量標準1道根據(jù)實施例方案8產(chǎn)生的HES-EPO:EPO與酰肼基-HES12KDL偶聯(lián)2道根據(jù)實施例方案9產(chǎn)生的HES-EPO:EPO與羥胺基HES12KDK偶聯(lián)C:對照(未偶聯(lián)的EPO);上面的一條帶代表EPO二聚體圖2圖2通過顯示多肽N-糖苷酶對HAS修飾的EPO型的消化，證明HES與碳水化合物側鏈的碳水化合物部分偶聯(lián)1道根據(jù)實施例方案8產(chǎn)生的HES-EPO，N-糖苷酶消化2道根據(jù)實施例方案9產(chǎn)生的HES-EPO,N-糖苷酶消化3道BRPEPO標準4道BRPEPO標準，N-糖苷酶消化mw:分子量標準(Bio-RadSDS-PAGEStandardsLowrange,目錄號161-0305,Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)圖3圖3顯示根據(jù)實施例17.1產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。A道蛋白質分子量標準Roti-MarkPRESTAINED(CarlRothGmbH+Co,Karlsruhe,D);蛋白質標準的分子量(kD)從上到下依次為245,123，77，42，30，25.4和17。B道才艮據(jù)實施例17.1偶聯(lián)后的粗制品。C道EPO初始材料圖4圖4顯示根據(jù)實施例17.3產(chǎn)生的HES-EP0偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。A道才艮據(jù)實施例17.3偶聯(lián)后的粗制品。B道EPO初始材泮牛C道蛋白質分子量標準Roti-MarkPRESTAINED(CarlRothGmbH+Co，Karlsruhe,D);蛋白質標準的分子量(kD)從上到下依次為245，123,77，42，30，25.4和17。圖5圖5顯示根據(jù)實施例17.4和17.5產(chǎn)生的HES-EP0偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。A道蛋白質分子量標準Roti-MarkPRESTAINED(CarlRothGmbH+Co,Karlsruhe,D);蛋白質標準的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。B道才艮據(jù)實施例17.4偶聯(lián)后的粗制品。C道根據(jù)實施例17.5偶聯(lián)后的粗制品。D道EPO初始材料。圖6圖6顯示才艮據(jù)實施例19.1和19.4產(chǎn)生的HES-EP0偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。A道蛋白質分子量標準Roti-MarkPRESTAINED(CarlRothGmbH+Co，Karlsruhe,D);蛋白質標準的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30,25.4和17。B道根據(jù)實施例19.4偶聯(lián)后的粗制品。C道根據(jù)實施例19.1偶聯(lián)后的粗制品。D道EPO初始材料。圖7圖7顯示根據(jù)實施例19.2、19.3、19.5和19.6產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。A道蛋白質分子量標準Roti-MarkPRESTAINED(CarlRothGmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標準的分子量(kD)從上到下依次為245,123,77，42,30,25.4和17。B道才艮據(jù)實施例19.6偶if關后的4且制品C道根據(jù)實施例19.5偶聯(lián)后的粗制品D道根據(jù)實施例19.6偶聯(lián)后的粗制品E道根據(jù)實施例19.5偶聯(lián)后的粗制品F道根據(jù)實施例19.2偶聯(lián)后的粗制品G道根據(jù)實施例19.3偶聯(lián)后的粗制K道EPO初始材泮牛?；趯嵤├?3.3b)基于實施例13.1b)基于實施例13.3a)基于實施例13.1a)口卩圖8圖8顯示才艮據(jù)實施例19.7、19.8、19.9、19.10、19.11和19.12產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。A道蛋白質分子量標準Roti-MarkPRESTAINED(CarlRothGmbH+Co,Karlsruhe,D);蛋白質標準的分子量(kD)從上到下依次為245,123,77，42，30,25.4和17。B道才艮據(jù)實施例19.11偶if關后的粗制品。C道根據(jù)實施例19.IO偶聯(lián)后的粗制品。D道才艮據(jù)實施例19.7偶耳關后的^L制品。E道才艮據(jù)實施例19.8偶聯(lián)后的粗制品。F道才艮據(jù)實施例19.12偶聯(lián)后的粗制品。G道EP0初始材泮牛。K道才艮據(jù)實施例19.9偶Jf關后的斗且制品。圖9EPO-GT-1的SDS-PAGE分析，其中弱酸處理5分鐘=2道；10分鐘=3道；60分鐘=4道，未處理的EP04道；顯示除去N-聚糖后EPO的遷移率變化(+N-糖苷酶(PNGase))。圖10從未處理的EPO中以及在弱酸水解條件下溫育5分鐘、10分鐘、60分鐘的EP0中所分離的寡糖的HPAEC-PAD(高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法)圖。羅馬數(shù)字I-V表示洗脫位置，I=二唾液酸化的二分支結構，n-三唾液酸化的三分支結構(兩種異構體)，m=四唾液酸化的四分支結構+2個N-乙酰基乳糖胺重復，IV-四唾液酸化的四分支結構+1個N-乙?；樘前分貜?；V-四唾液酸化的四分支結構+不含N-乙酰基乳糖胺重復。不含及含有1-4個唾液酸的寡糖結構的洗脫區(qū)用括號表示。圖11去唾液酸化后N-連接寡糖的HPAEC-PAD;顯示了N-乙酰神經(jīng)氨酸的洗脫位置；數(shù)字1-9表示標準寡糖的洗脫位置；1=二分支；2=三分支(2-4種異構體)，3=三分支(2-6種異構體)，4=四分支；5=三分支+1個重復；6=四分支+1個重復；7=三分支+2個重復；8=四分支+2個重復；9=四分支+3個重復。圖12溫和處理的和未處理的EPO在唾液酸殘基經(jīng)受高硪酸鹽氧化后的SDS-PAGE分析。1=高碘酸鹽氧化，未酸處理；2=高石典酸鹽氧化5分鐘，酸處理；3=高碘酸鹽氧化和酸處理10分鐘；4=高石典酸鹽氧化，未酸處理；5=未高碘酸鹽氧化且未酸處理的BRPEP0標準。圖13從未處理的EPO中以及從在弱酸水解條件下溫育5分鐘和10分鐘隨后高碘酸鹽處理的EPO中分離的天然寡糖的HPAEC-PAD才莫式。不含及含有1-4個唾液酸的寡糖結構的洗脫區(qū)用括號1-5表示。圖14EP0-GT-1-A的HES修飾時間過程的SDS-PAGE分析20pg等份EPO-GT-1-A與羥胺修飾的HES衍生物X反應30分鐘、2、4、17小時。1道=30分鐘反應時間；2道=2小時反應時間；3道=4小時反應時間；4道=17小時反應時間；5道=沒有HES修飾的EPO-GT-1-A。左圖顯示在羥胺修飾的HES衍生物(流速1ml.mirf1)X存在下，隨著溫育時間延長，EPO-GT-1-A的遷移率改變1道=30分鐘反應時間；2道=2小時反應時間；3道=4小時反應時間；4道=17小時反應時間；5道-HES修飾的EP0-GT-1-A。右圖顯示相同樣品用N-糖苦酶處理后的分析。圖15HES-EPO偶聯(lián)物的Q-Sepharose級分的SDS-PAGE分析。各1%的穿流液(flow-through)以及在高鹽濃度下洗脫的1°/。級分用SpeedVac濃縮器濃縮，在樣品緩沖液中加樣到凝膠上。EPO蛋白用考馬斯藍染色。a—羊品I;B-樣品II;C-樣品III;K-對照EP0-GT-1;Al、Bl、CI和Kl表示穿流液部分；A2、B2、C2和K2表示用高鹽濃度洗脫的級分。圖16aHES修飾的EP0樣品A2(見圖15)、對照EP0樣品K2和EP0-GT-1-A的SDS-PAGE分析。為了除去N-連接的寡糖，在N-糖苷酶存在下消化EPO制品。所有EPO樣品都顯示遷移率向缺乏或含有0-聚糖的低分子量型轉變。對于HES-修飾的EPO樣品A2，在去-N-糖基化后觀察到0-糖基化與非糖基化蛋白帶的比值較低，在30KDa左右檢測到一條彌散的蛋白帶，這可能代表0-聚糖殘基的唾液酸處的HES-修飾(見星號標記的箭頭)。圖16b未處理的或者在N-糖苷酶存在下消化除去N-連接寡糖(見圖16a)的HES-修飾EPO樣品A2(見圖15)、對照EPO樣品K2和EPO-GT-1A在溫和水解后的SDS-PAGE分析。在N-糖苷酶處理之前的高分子量型A2和處理之后的高分子量型A(見有箭頭及無箭頭的括號)在樣品酸處理后都消失。用于比較的BRPEPO標準沒有進行弱酸處理。圖17從HES修飾的樣品A、EPO-GT-1-A以及與未修飾服S溫育的對照EPO樣品(K)中釋放的N-連接寡糖物質的HPAEC-PAD分析。羅馬數(shù)字I-V表示洗脫位置，I=二唾液酸化的二分支結構，II-三唾液酸化的三分支結構(兩種異構體)，111=四唾液酸化的四分支結構+2個N-乙酰基乳糖胺重復，IV-四唾液酸化的四分支結構+l個N-乙?；樘前分貜停籚-四唾液酸化的四分支結構+不含N-乙?；樘前分貜?；括號表示二、三、四唾液酸化的N-聚糖的洗脫區(qū)，如圖10和圖13的圖例所述。圖18從HES修飾的樣品A、EPO-GT-1-A以及與未修飾HES溫育的對照EPO樣品(K)中釋放的N-連接寡糖物質的HPAEC-PAD分析。顯示了標準寡糖混合物的保留時間數(shù)字1-9表示標準寡糖的洗脫位置1=二分支；2=三分支(2-4種異構體)，3=三分支(2-6種異構體)，4=四分支；5=三分支+1個重復；6=四分支+1個重復；7=三分支+2個重復；8=四分支+2個重復；9=四分支+3個重復。圖19-25圖19-25表示從HES修飾的EP0和對照EPO制品中分離的酶釋放的和化學去唾液酸化的N-聚糖的MALDI/T0F質^普。在m/z1809.7、2174.8、2539.9、2905.0和3270.1處的主要信號([M+Na]+)對應于二到四分支的不含、含有一個或兩個N-乙?；樘前分貜偷膹碗s型N-聚糖結構，并且伴有由于對MS分析的樣品去唾液酸化所使用的酸水解條件引起巖藻糖或半乳糖損失所致的弱信號。圖19MALDI/T0F鐠HES-修飾的EPOA2的去唾液酸化寡糖。圖20MALDI/T0F譜EPOGT-1-A的去唾液酸化寡糖。圖21MALDI/TOF語EPOK2的去唾液酸化寡糖。圖22MALDI/TOF"i普EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。圖23MALDI/TOF譜酸水解5分鐘EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。圖24MALDI/TOFi普酸水解10分鐘EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。圖25MALDI/TOFi普酸水解60分鐘EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。具體實施方式實施例1重組EP0的生產(chǎn)A)在哺乳動物細胞中的生產(chǎn)重組EP0如下在CH0細胞中生產(chǎn)將攜帶人EP0cDNA的質?？寺〉秸婧吮磉_載體中(pCR3，在下文中稱為pCREP0)。如述利用標準方法進行定點誘變(Grabenhorst，Nimtz，Costa等人，1998，Invivospecificityofhumanalpha1，3/4-fucosyltransferasesIII-VIIinthebiosynthesisofLewis(x)andsialylLewis(x)motifsoncomplex-typeN-glycans-CoexpressionstudiesfromBHK—21cellstogetherwithhumanbeta—traceprotein,J.Biol.Chem.,273(47),30985—30994)。穩(wěn)定表達人EP0或其氨基酸變體(例如Cys-29—Ser/Ala,或Cys-33~>Ser/Ala，Ser-126—Ala等)的CH0細胞用磷酸4丐沉淀法產(chǎn)生，如述(Grabenhorst等人)用硫酸G418篩選。轉染三天后，將細胞1:5傳代培養(yǎng)，在含有10%FBS和1.5g/1硫酸G418的DMEM中篩選。采用這種篩選操作，通常有100-500個克隆存活，在選擇培養(yǎng)基中再繁殖2-3周。然后通過Westernblot和IEF/WesternBlot分析匯合生長之單層的細胞培養(yǎng)上清液的EPO表達水平。EPO由穩(wěn)定的亞克隆在旋轉培養(yǎng)瓶中或者在21灌注反應器(perfusionreactors)中產(chǎn)生。按照發(fā)表的方案，含有不同數(shù)量NeuAc(例如2-8、4-10、8-12個NeuAc殘基)的EPO的不同沖唐型(glycoform)用如下所述多種層析法的組合分離。文獻Grabenhorst,Conradt，1999,Thecytoplasmic,transmembraneandstemregionsofglycosyltransferasesspecifytheirinvivofunctionalsubloca1izationandstabilityintheGolgi.JBiolChem.,274(51)，36107-16;Grabenhorst,Schlenke,Pohl,Nimtz，Conradt，1999,Geneticengineeringofrecombinantglycoproteinsandtheglycosylationpathwayinmammalianhostcells,GlycoconjJ.，16(2)，81-97;Mueller,Schlenke，Nimtz，Conradt，Hauser,1999，Recombinantglycoproteinproductqualiryinproliferation-controlledBHK—21cells,Biotechnologyandbioengineering,65(5)，529-536;Schlenke,Grabenhorst，Nimtz,Conradt，1999，ConstructionandcharacterizationofstablytransfectedBHK—21cellswithhuman—typesialylationcharacteristic，Cytotechnology，30(1-3)，17-25。B)在昆蟲細胞中的生產(chǎn)如文獻所述，用含有受多角體蛋白啟動子控制的人EPOcDNA的重組桿狀病毒載體轉染細胞后，由昆蟲細胞系SF9和SF21產(chǎn)生重組人EPO。在無血清培養(yǎng)基中生長的細胞以2xl06或2xlO'個細胞/mL的細胞密度轉染，每天測定細胞培養(yǎng)上清液中的EPO滴度。EPO通過Bluesepharose層析、Q-Sepharose上的離子交換層析、最后通過C4相上的RP-HPLC純化。產(chǎn)物的純度通過SDS-PAGE和N末端測序證實。詳細的石友水化合物結構分析(N-和0-糖基化)按照發(fā)表的操作進行。文獻Grabenhorst,Hofer,Nimtz，Jager，Conradt,1993，Biosynthesisandsecretionofhumaninterleukin2glycoproteinvariantsfrombaculovirus-infecrtedSf21cells.Charaterizationofpolypeptidesandposttranslationa1modifications,EurJBiochem.，215(1),189-97;Quelle,Caslake,Burkert，Wojchowski，1989，High-levelexpressionandpurificationofarecombinanthumanerythropoietinproducedusingabaculovirusvector,Blood,74(2),652-7.實施例261反應性HES書于生物的形成1.SH-反應性HES1.1EMCH與氧代-HES12KD反應，形成SH-反應性HES12KDBBO將0.144g(0.012mmoi)氧<戈-HES12KD(FreseniusGermanPatentDE19628705Al)溶解于0.3mL無水二曱亞石風(DMSO)中，在氮氣下逐滴力口至34mg(0.15mmol)EMCH(PerbioScience,DeutschlandGmbH,Bonn,德國)在1.5mLDMSO中的混合物中。在60下攪拌19小時后，將反應混合物加至16mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀，再溶解于3mLDMSO中，如上所述再次沉淀。通過離心及真空千燥獲得SH-反應性HES12KDB。與巰基-EPO的偶聯(lián)反應在實施例3的2.2中描述。備選方案在該反應中可以-使用具有^皮間隔區(qū)隔開的酰肼和馬來酰亞胺官能基的所有交聯(lián)劑。表2列出了可從PerbioScience,DeutschlandGmbH,Bonn,Germany獲得的這類分子的另外一些實例；用"A"標記。此外，也可以使用具有活化的二硫醚功能團而不是馬來酰亞胺的另外一類交聯(lián)劑。1.2HES糖基胺的卣代乙酰胺書于生物a)糖基胺的形成1將1mgHES12KD樣品溶解于3mL^1:包和石友酸氫銨中。然后另外加入固體碳酸氬銨，以使溶液在30120小時的溫育過程中保持飽和。氨基-HES12KDC通過直接凍干反應混合物脫鹽。Manger,Wong,Rademacher，Dwek,1992，Biochemistry,31，10733-10740;Manger,Rademacher,Dwek，1992,Biochemis'try，31,10724-10732b)用氯乙酸酐酰化糖基胺C將lmg氨基-HES12KDC樣品溶解于1mL1M碳酸氫鈉中，在冰上冷卻。加入固體氯乙酸酐晶體(5mg)，使反應混合物升溫至室溫。監(jiān)測pH，如果pH下降到7.0以下則另外加入堿。在室溫下2小時后，加入第二份堿和酸酐。6小時后產(chǎn)物氯乙酰胺-HESDl(X-Cl)通過混合床AmberliteMB-3(H)(OH)離子交換樹脂脫鹽。c)用溴乙酸酐?；腔?溴乙酸酐如Thomas所述制備3。將lmg氨基-HES12KDC樣品溶解于0.1mL干匿F中，在冰上冷卻，加入5mg溴乙酸酐。使反應混合物緩慢升溫至室溫，攪拌溶液3小時。在-20下將反應混合物加至1mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀，再溶解于0.1mLDMF中，如上所述再次沉淀。通過離心及真空干燥獲得溴乙酰胺-HESD2(X=Br)。與巰基-EPO的偶聯(lián)反應在實施例3的1.2中描述。2Black,Kiss，Tull，Withers,1993，Carbohydr.Res.，250，1953Thomas,1977,MethodesEnymol.，46，362d)相應的硪衍生物D3(X-I)如合成D2所述合成。使用碘乙酸N-琥珀酰亞胺酯代替溴乙酸酐，所有步驟都避光進行。備選方案:對于氨基的酰化，可以使用卣素、酸的其它活化形式，例如--溴化物或-氯化物-酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯，與取代酚的酯(對硝基酚、五氟酚、三氯酚等)此外，也可以使用含有被間隔區(qū)隔開的反應性氨基和囟代乙?；乃薪宦?lián)劑。一個例子是SBAP。該分子及其它一些分子可獲自PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國。它們在表2中用T標記。關于不需要分離卣代乙酰胺-HES衍生物就可以連接氨基-HES與巰基-EP0的交聯(lián)劑，見實施例3中1.2的解釋。1.3氨基-HESE的囟代乙酰胺衍生物1a)1，4-二氨基丁烷與氧代-HES12KD反應，產(chǎn)生氨基-HES12KDE44S.Frie，Diplomarbeit,FachhochschuleHamburg,1998將i.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無水二曱亞砜(DMS0)中，在氮氣下逐滴加至1.51mL(15mmol)1，4-二氨基丁烷在15mL畫S0中的混合物中。在40下攪拌19小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀氨基-HES12KDE，再溶解于40mL水中，對水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量(cutoff),PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)，凍干。b)氯乙酰胺-HES12KDFl按上述1.3中制備氯乙酰胺-HES12KDDl的所述方法制備。c)溴乙酰胺-HES12KDF2(X-Br)按上述1.3中制備溴乙酰胺-HES12KDD2的所述方法制備。與巰基-EPO的偶聯(lián)反應在實施例3的1.2中描述。d)相應的碘衍生物F3(XO在與巰基-EP0反應之前不分離。實驗在實施例3的1.1中描述。備選方案參見上文1.2。2.CH0-反應性HES2.1酰肼-HESa)肼與氧代-HES12KD的反應將1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無水二曱亞石風(DMS0)中，在氮氣下逐滴加至0.47mL(15mmol)肼在15mLDMS0中的混合物中。在40下攪拌19小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物J,再溶解于40mL水中，用0.5°/o(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn德國)，凍干。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應在實施例4的2.2中描述。b)己二酸二酰肼與氧代-HES12KD的反應在65下將1.74g(15mmol)己二酸二酰肼溶解于20mL無水二甲亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴加入溶解于3mL無水DMS0中的651.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD。在60下攪拌68小時后，將反應混合物加至200mL水中。含有L的溶液用0.5%(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn，德、國)，凍干。與fU匕的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應在實施例4的2.2中描述。備選方案此外，也可以使用2個酰肼基被任一間隔區(qū)分隔的衍生物。3,另外的氨基-HES12KD衍生物I和H1D或F的氨解如下分開進行將各1mg卣代乙酰胺樣品溶解于0.lmL飽和碳酸銨中。然后加入另外的固體碳酸銨，以使溶液在30120小時的溫育過程中保持飽和。在-20下將反應混合物加至1mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀物，再溶解于0.05mL水中，如上所述再次沉淀。通過離心及真空千燥獲得產(chǎn)物氨基HESH或1。與氧化的Glyco-EPO的偶if關反應在實施例4的4.1中描述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>4,羥胺修飾的HES12KDK<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>0-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺如Boturyn等人所述用可以購得的材料通過兩步合成5。將l.44g(0.12mmol)氧代-HESUKD溶解于3mL無水二甲亞砜(函S0)中，在氮氣下逐滴加至2.04g(l5mmol)0-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺在15mLDMS0中的混合物中。在65下攪拌48小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的l:l混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物K，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量,PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn，德國)，凍干。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應在實施例4的3.1中描述。備選方案此外，也可以使用兩個羥胺基團被任何間隔區(qū)隔開的衍生物。5Boturyn,Boudali,Constant,Defrancq，Lhomme，1997，Tetrahedron,53,54855.巰基-HES12KD5,1向氧代-HES12KD中添加M將1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無水二甲亞石風(DMS0)中，在氮氣下逐滴加至1.16g(15mmol)巰乙胺在15mL固S0中的混合物中。在40下攪拌24小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物M,再溶解于40mL水中，用0.5%(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn德國)，凍千。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應在實施例4的2.1中描述。備選方案也可以使用氨基和硫功能基被任何分隔區(qū)隔開的衍生物。此外，衍生物中的氨基也可以被置換為肼、酰肼或羥胺基團。硫功能基可以以例如二硫醚或三苯曱基衍生物的形式受到保護。但在這種情況下，在偶聯(lián)之前必須進行額外的脫保護步驟，該步驟將釋放一種類似于M的成分。5.2氨基HES12KDE、H或I的修飾a)用SATA/SATP修飾將1.44g(0.12mmol)氨基-HES12KDE、H或I溶解于3mL無水二曱亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴加至139mg(0.6mmol)SATA在5mLDMSO中的混合物中。在室溫下攪拌24小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物N，再溶解于40mL水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn，德國)，凍干。脫保護在含有25mMEDTA和0.5M羥胺的50mM磷酸鈉緩沖液pH7.5中進行，室溫下2小時，通過用含有1mMEDTA的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5透析來純化產(chǎn)物0。在脫保護反應之后立即進行實施例4的2.1中描述的偶聯(lián)反應。、i-Wo、》。廣、jVr、i68b)用SPDP修飾將1.44g(0.12mmol)氨基—HES12KDE、H或I溶解于3mL無水二甲亞石風(DMSO)中，在氮氣下逐滴加至187mg(0.6mmol)SPDP在5mLDMS0中的混合物中。在室溫下攪拌24小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物P，再溶解于40mL水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn，德國)，凍干。脫保護在每0.5mL含有12mg二硫蘇糖醇(DTT)的100mM乙酸鈉緩沖液(含100mM氯化鈉)pH4.5中進行，室溫下30分鐘，通過用含有1mMEDTA的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5透析來純化產(chǎn)物Q。在脫保護反應之后立即進行實施例4的2.1中描述的偶聯(lián)反應。備選方案對于氨基向游離形式或受保護的硫醇基的轉化，可以使用幾種試劑。在修飾后，可以分離產(chǎn)物。此外，關于交聯(lián)劑的使用，它們可以直接用于偶聯(lián)反應，優(yōu)選在純化步驟之后使用。受保護形式的巰基-HES衍生物的合成可以用于分離和貯存巰基-HES衍生物。為此，可以使用類似于SATA的所有衍生物，它們含有被任何間隔區(qū)隔開的活性酯官能團和硫酯官能團。表2中的SATP(用"H"標記)是該類的另外一個成員。與SPDP類似的衍生物可能含有被任何間隔區(qū)隔開的活性酯官能團和二硫醚官能團。表2中可見這些類的其它一些成員，用"P，標記。其它類似的衍生物可能含有被任何間隔區(qū)隔開的活性酯官能團和作為三苯甲基衍生物而受到保護的硫醇官能團。實施例3與巰基-EPO的偶聯(lián)反應1.巰基-EPO與卣代乙酰胺修飾的SH-反應性HES的反應1.1實施例方案1使用含有NHS-活性酯和碘乙酰胺基團的交聯(lián)劑例如SIA偶聯(lián)巰基-EPO與氨基-HES12KD(E、H或I)6Cumber,Forrester,Foxwell,Ross,Thorpe,1985，MethodsEnrymol.，112，207材料A.硼酸鹽緩沖液。組成為50mM硼酸鈉，pH8.3，5mMEDTA。B.PBS,磷酸鹽li沖鹽水10mM石粦酸鈉，150mMNaCl，pH7.4。C.氨基-HES12KDE、H或I。在硼酸鹽緩沖液中以1mg/mL制備。D.交聯(lián)劑貯存液14mgSIA溶解于1mL固SO中。E.D-Salt葡聚糖脫鹽柱，2x5mL柱床體積(PerbioScienceDeutschlandGmbH,Borm，德國)F.Coomassie⑧蛋白質斗企測i式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn，德國)G.巰基EP0溶液硼酸鹽緩沖液中的5mg/mL巰基EP01H.樣i量濃縮器MicroconYM-3(amicon,MiliporeGmbH，Eschborn，德國)方法將100SIA溶液加至400氨基HES12KDE溶液中，在室溫下攪拌使之反應0.5小時。用微量濃縮器以14000xg離心樣品60分鐘除去過量的交聯(lián)劑。離心后，用硼酸鹽緩沖液使樣品達到其初始體積，該步驟重復兩次以上。將所得溶液加至1mL巰基EPO溶液中，反應混合物在室溫下溫育16小時。在溫育結束時，通過加入半胱氨酸至終濃度為10mM來終止過量碘乙酰胺的反應性。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的脫鹽柱上，用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分中的蛋白質含量。合并含蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。備選方案在該反應中，可以使用含有被間隔區(qū)隔開的琥珀酰亞胺或石充代琥珀酰亞胺官能團和碘乙酰胺官能團的所有交聯(lián)劑。表2中可見其它一些實<列。它介〕用"C，，才'亍i己，可獲自PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國。1.2實施例方案2巰基EP01_與SH反應性HES12KD溴乙酰胺D2、F2或石典乙酰胺D3的偶聯(lián)7材料A.磷酸鹽緩沖液組成為100mM石粦酸鈉，pH6.1,5mMEDTA。B.PBS,磷酸鹽緩沖鹽水10mM石粦酸鈉，150mMNaCl，pH7,4。C.SH反應性HES12KD溴乙酰胺D2。在磷酸鹽緩沖鹽水中以10mg/mL制備。D.D-Salt葡聚糖脫鹽柱，2x5mL柱床體積(PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)E.Coomassie⑤蛋白質觀寸定i式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)F.巰基EP0溶液磷酸鹽緩沖鹽水中的5mg/mL巰基EP01方法1mLSH反應性HES12KD溴乙酰胺D2溶液與1mL巰基-EP0溶液混合，反應混合物在室溫下溫育48小時。在溫育結束時，通過加入半胱氨酸至終濃度10mM終止過量溴乙酰胺的反應性。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平ff的脫鹽柱上。用Coomassie蛋白質4全測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量，合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，在用水透析過夜后通過凍干荻得偶聯(lián)物。7deValasco,Merkus，Anderton，Verheul,Lizzio,VanderZeevanEden,Hoffmann,Verhoef，Snippe，1995,Infect.Immun.，63，961備選方案代替SH反應性HES12KD-溴乙酰胺D2的分離，氨基HES12KD(E，H，I)可以通過琥珀酰亞胺官能團和溴乙酰胺官能團用交聯(lián)劑連接(見71上文l.l)。SBAP是這類交聯(lián)劑的一個成員，在表2中可見，用"D"標記。2.巰基-EP0與馬來酰亞胺修飾的SH反應性HES的反應2.1實施例方案3用含有酰肼和馬來酰亞胺官能團的交聯(lián)劑例如M2C2H來偶聯(lián)琉基EP0與HES12KD材料A.M2C2H貯存液DMSO中的10mg/mLM2C2H,新鮮制備B.HES12KD:0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5中的10mg/mLC.巰基EP0溶液磷酸鹽/NaCl緩沖液中的5mg/mL巰基EP0D.磷酸鹽/NaCl:0.1M磷酸鈉，50mMNaCl，pH7.0E.微量濃縮器MicroconYM-3(amicon，MiliporeGmbH，Eschborn，德國)F.;疑月交過濾柱例如，SephadexG-200(1.5x45cm)G.Coomassie⑧蛋白質才全觀'H式齊l](PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)H.PBS,磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.4。方法將M2C2H溶液加至400HES12KD溶液中至終濃度為1mM,使之在室溫攪拌下反應2小時。用微量濃縮器以14000xg離心樣品60分鐘除去過量的交聯(lián)劑。離心后，用磷酸鹽/NaCl緩沖液使樣品達到其初始體積，該步驟重復兩次以上。向M2C2H修飾的HES12KD中加入0.5mL巰基EPO溶液，反應混合物在室溫下溫育2小時。在溫育結束時，通過加入半胱氨酸至終濃度為10mM終止過量馬來酰亞胺的反應性。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5x45cm)上，以lmL為單位收集級分。用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量。合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，在用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。操作注意事項腙加合物在極端pH下略不穩(wěn)定。對于可能涉及低pH下處理的應用，我們通過用PBS緩沖液中的30mM氰基硼氫化鈉處理，將腙還原為肼。對于大多數(shù)應用，該額外步驟是不必要的。2.2實施例方案4巰基EPO與馬來酰亞氨基-HES12KDB的偶聯(lián)材料A.馬來酰亞氨基-HES12KDB:0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5中的10mg/mLB.巰基EPO溶液磷酸鹽/NaCl緩沖液中的5mg/mL巰基EPOC.磷酸鹽/NaCl:0.1M石舞酸鈉，50mMNaCl,pH7.0D.l是月交過濾柱例如，SephadexG-200(1.5x45cm)E.Coomassie⑧蛋白質沖企觀'H式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)F.PBS，石岸酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.4。方法1mLSH反應性HES12KDB溶液與1mL巰基EPOL溶液混合，在室溫下溫育2小時。在溫育結束時，通過加入半胱氨酸至終濃度10mM終止過量馬來酰亞胺的反應性。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5x45cm)上，以1mL為單位收集級分。用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量。合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，在用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。2.3實施例方案12使用含有NHS-活性酯和馬來酰亞胺官能團的交聯(lián)劑例如SMCC來偶聯(lián)巰基EPO與氨基HES12KD(E，H,I)73材料A.孩t量濃縮器MicroconYM-10(amicon，MiliporeGmbH,Eschborn，德國)B.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.4C.氨基HES12KDE、H或I。在PBS緩沖液中以10mg/mL制備。D.SMCC溶液1mgSMCC溶解于50DMSO中E.D-Salt葡聚糖脫鹽柱，2x5mL柱床體積(PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)F.Coomassie⑥蛋白質才全測i式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)G.巰基EPO]J容液PBS緩沖液中的5mg/mL巰基EPO方法向50juLSMCC溶液中加入400氨基HES12KDE溶液，使反應混合物在室溫攪拌下反應80分鐘，在46下反應10分鐘。通過使用微量濃縮器以14000xg離心樣品60分鐘除去過量的交聯(lián)劑。用PBS緩沖液使體積達到450|uL,該步驟重復兩次以上。最后一次離心后，向所得溶液中加入PBS至450pL，加至1mL巰基EPO溶液中，反應混合物在室溫下溫育16小時。在溫育結束時，通過加入半胱氨酸至終濃度10mM終止過量馬來酰亞胺的反應性。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的脫鹽柱上。用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量，合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。備選方案在該反應中，可以使用含有被間隔區(qū)隔開的琥珀酰亞胺或硫代琥珀酰亞胺官能團和馬來酰亞胺官能團的所有交聯(lián)劑。表2中可見這類分子的其它一些例子，用"E，，標記，可以獲自PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國。還有另外一類交聯(lián)劑，它們含有活化的二硫醚官能團而不是馬來酰亞胺官能團。這些交聯(lián)劑也可以用于偶聯(lián)。而該偶聯(lián)物的二碌d建在還原條件下可以:帔切割。這一類的成員74在表2中用"F"標記。第三類交聯(lián)劑利用乙烯砜官能團代替馬來酰亞胺官能團作為SH反應性基團。這一類的一個成員是"SVSB"，在表2中用"G，，標記。實施例4與氧化的EP0的偶聯(lián)反應1.Glyco-EP0的氧化1.1用偏高碘酸鈉氧化Glyco-EP0:實施例方案5材料A.Glyco-EP0溶液乙酸鹽緩沖液中的10mg/mLGlyco-EP0B.偏高硤酸鈉溶液乙酸鹽緩沖液中的10mM或100mM高石典酸鈉，新鮮制備。暗處保存。使用這些溶液時，氧化混合物中高碘酸鈉的終濃度分別為1mM或10mM。C.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5D.甘油E.微量濃縮器MicroconYM-3(amicon，MiliporeGmbH,Eschborn，德國)方法所有步驟都避光進行。向1mL冷Glyco-EP0'溶液中加入0.1mL冷偏高石典酸鈉溶液，氧化反應避光進行1小時。如果待氧化的Glyco-EPO含有唾液酸殘基，則氧化條件是1mM高碘酸鈉，0。否則，使用室溫下10mM高碘酸鈉的條件。為了終止氧化，加入甘油至終濃度為15mM，并在0下溫育5分鐘。用微量濃縮器以14000xg離心產(chǎn)物60分鐘，除去過量的試劑和副產(chǎn)物。離心后，用下一修飾步驟所用的緩沖液例如乙酸鹽緩沖液，使樣品達到其初始體積。該步驟重復兩次以上。1.2Glyco-EPO的酶氧化實施例方案6EPO的酶氧化在別處已經(jīng)有描述(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267,15916-15922)。2.與肼/酰肼衍生物的偶聯(lián)2.1實施例方案7用含有酰肼和馬來酰亞胺官能團的交聯(lián)劑例如M2C2H(PerbioScience,DeutschlandGmbH,Bonn,德國)來偶聯(lián)氧化的Glyco—EPO與巰基-HES12KDM、0或Q。材料A.M2C2H貝i存液DMSO中的10mg/mLM2C2H,新鮮制備B.來自6.1.1的氧化的Glyco-EPO溶液乙酸鹽緩沖液中的5mg/mLGlyco-EPOC.巰基-HES12KDM、0或Q:磷酸鹽/NaCl緩沖液中的10mg/mLD.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5E.石粦酸鹽/NaCl:Q.1M石粦酸鈉，50mMNaCl，pH7.0F.農(nóng)i量濃縮器MicroconYM-3(amicon,MiliporeGmbH,Eschborn，德國)G.凝月交過濾柱例如，SephadexG-200(1.5x45cm)H.Coomassie⑧蛋白質才僉測i式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)I.PBS,磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.4方法向1mL氧化的Glyco-EP0中力口入M2C2H貯存液至終濃度為1mM,使之在室溫攪拌下反應2小時。通過使用微量濃縮器以14000xg離心樣品60分鐘，除去過量的交聯(lián)劑。離心后，用磷酸鹽/NaCl緩沖液使樣品達到其初始體積，該步驟重復兩次以上。向M2C2H修飾的Glyco-EPO中力口入1mL巰基-HES12KDM、0或Q溶液，反應混合物在室溫下溫育16小時。在溫育結束時，通過加入半胱氨酸終止過量馬來酰亞胺的反應性。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5x45cm)上，以1mL為單位收集級分。用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量，合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。76操作注意事項腙加合物在極端pH下略不穩(wěn)定。對于可能涉及低pH下處理的應用，我們用PBS緩沖液中的30mM氰基硼氫化鈉處理，將腙還原為肼。對于大多數(shù)應用，該額外步驟是不必要的。2.2實施例方案8氧化的Glyco-EPO與酰肼基-HES12KDL或J直接偶聯(lián)材料A.來自6.1.1的氧化的Glyco-EPO溶液乙酸鹽緩沖液中的5mg/mLGlyco-EPOB.酰肼基-HES12KDL或J:乙酸鹽緩沖液中10mg/mLC.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5D.凝月交過濾柱例如，SephadexG-200(1.5x45cm)E.Coomassie⑧蛋白質才企測i式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)F.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7,4方法1mL酰肼基-HES12KDL或J溶液與1mL氧化的Glyco-EP0溶液混合，反應混合物在攪拌下室溫溫育16小時。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平4軒的SephadexG-200(1.5x45cm)上，以1mL為單位收集級分。用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量，合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。偶聯(lián)結果在圖24中顯示。觀察到的分子位移證明偶聯(lián)是成功的。拖尾(smear)是由于HES的不均一性引起的。圖25證明HES與碳水化合物側鏈的碳水化合物部分偶聯(lián)。操作注意事項腙加合物在極端pH下略不穩(wěn)定。對于可能涉及低pH下處理的應用，我們通過用PBS緩沖液中的30mM氰基硼氫化鈉處理，將腙還原為肼。對于大多數(shù)應用，該額外步驟是不必要的。3.與輕胺衍生物的偶聯(lián)83.1實施例方案9氧化的Glyco-EP0與羥氨基-HES12KDK的偶聯(lián)材料A.來自6.1.1的氧化的Glyco-EP0溶液乙酸鹽緩沖液中的5mg/mLGlyco-EPOB.羥氨基-HES12KDK:乙酸鹽緩沖液中的10mg/mLC.乙酸鹽緩沖液0，1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5D.)疑月交過濾一主例如，SephadexG-200(1.5x45cm)E.Coomassie⑧蛋白質才僉測i式劑(PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)F.PBS,磷酸鹽緩沖鹽水lOmM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.48Rose,1994，Am.Chem.Soc.,116，30方法1mL羥氨基-HES12KDK溶液與1mL氧化的Glyco-EP0溶液混合，反應混合物在攪拌下室溫溫育16小時。將反應混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5x45cm)上，以1mL為單位收集級分。用Coomassie蛋白質檢測試劑監(jiān)測級分的蛋白質含量，合并含有蛋白質偶聯(lián)物的所有級分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。偶聯(lián)結果在圖24中顯示。在2道觀察到的分子位移證明偶聯(lián)是成功的。拖尾(smear)是由于HES的不均一性引起的。圖25證明HES與碳水化合物側鏈的碳水化合物部分偶聯(lián)。實施例5半乳糖氧化酶處理的EPON-聚糖的鑒定在過氧化氫酶存在下，在0.05M磷酸鈉緩沖液pH7.0中，重組78EPO或部分去唾液酸化的EPO型(有限弱酸水解產(chǎn)生的)與半乳糖氧化酶在37溫育30分鐘-4小時。通過取出50pg等份EPO,隨后用多肽N-聚糖酶處理蛋白質，監(jiān)測反應的進展。在除去唾液酸之前及之后，如(Grabenhorst等人，1999，Nimtz等人，1993/1994;Schlenke等人，1999)所述，對釋方文的N-連接寡糖(通過SDS-PAGE檢測去-N-糖基化多肽進行監(jiān)測)進行HPAEC-PAD作圖。根據(jù)HPAEC-PAD中觀察到的典型位移，定量各EPO寡糖中氧化的半乳糖殘基，也通過寡糖混合物的MALDI/TOFMS證實定量。實施例6HAS纟務飾的EPO的鑒定使用例如UUrogeiAcA44/54或類似的凝膠過濾介質，通過凝膠過濾實現(xiàn)HAS修飾的EPO型與未反應的EPO和HAS前體分子的分離。此外也可以如下除去未反應的HAS:在含有與Affigel(BioRad)偶聯(lián)的單克隆抗體的4mL柱上免疫親和分離EPO，隨后通過凝膠過濾分離未修飾的EPO(例如使用能夠分離分子量在20kDa-200kDa之間的球蛋白的介質)。通過SDS-PAGE分析(使用12.5%或10%丙稀酰胺凝膠)，通過考馬斯亮藍染色凝膠后檢測高于未修飾EPO的分子量，鑒定HAS修飾的EPO。使用抗重組人EPO的多克隆抗體對樣品進行WesternBlot分析，也能鑒定HAS修飾的EPO多肽的較高分子量。EPO型的N-聚糖修飾通過用多肽N-聚糖酶(重組N-糖苷酶，來自德國Roche,使用25單位/mgEPO蛋白，3716小時)從EP0蛋白上成功去除來證明；SDS-PAGE分析可見EPO蛋白向N-糖苷酶處理的未修飾EPO之遷移位置典型位移約20KDa。通過SDS-PAGE檢測與未反應的去-N-糖基化EPO相比去-N-糖基化產(chǎn)物的遷移位置，證實單去唾液酸化并經(jīng)半乳糖氧化酶處理的EPO0-聚糖在Ser126處的修飾。必要時，在SDS-PAGE分析之前通過在C8-相上的RP-HPLC分級修飾的EPO。通過0-聚糖的(3-去除以及使用79抗重組人EPO多克隆抗體的Westernblot碎企測EPO的去_0-糖基化形式，來分析EPO的HAS0-聚糖修飾。實施例7EPO和^修飾EPO型的定量用如歐洲藥典(2000，Erythropoietinisolutioconcentrata，1316，780-785)所述的UV測量對EPO定量，并且與國際BRP參照EPO標準比較。此外，也可以根據(jù)使用RP-C4-柱的RP-HPLC分析以及在254腿處的吸光度(用20、40、80、120jugBRP標準EPO參照制品進行校準)，測定EPO濃度。實施例8HES^f奮飾的重組人EPO的體外生物活性4吏用如Krystal[Krystal，1984，Exp.Heamatol.,11,649—660]活性。通過鹽酸苯肼處理在麗RI小鼠中誘導貧血，如[Fibi等人，1991，Blood,77，1203ff.]所述收集并使用脾細胞。EPO的稀釋液在96孔微量滴定板中與3><105細胞/孔溫育。在潮濕空氣(5WC0》下37溫育24小時后，細胞用每孔1pCi3H-胸苷標記4小時。通過液體閃爍計數(shù)測量摻入的放射性。國際參照EPO標準(BRP-標準)用于比較。此夕卜，也可以使用EP0敏感細胞系TF-l(Kitamura等人，[J.cellPhys.，140.323-334])，通過體外檢測來測量EPO的生物活性。洗去指數(shù)生長的細胞中的生長因子，在連續(xù)稀釋的EPO存在下再溫育48小時。使用Mosmann[Mosman，1983，J.Immunol.Methods,65,55-63]所述的MTT還原檢測來估計細胞的增殖。實施例9EPO和HAS-修飾的EPO型的體內(nèi)活性測定在紅細胞正常的小鼠中進行體內(nèi)活性測定，方法是在動物接受預定劑量的EP0或修飾EPO型4天后測量網(wǎng)織紅細胞的增加。^使用BRPEPO標準進行測定，該標準在紅細胞增多小鼠測定中用WHOEPO標準校準。EPO樣品用含有l(wèi)mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)的磚酸鹽緩沖鹽水稀釋。每只動物皮下注射0.5mlEPO在Dulbecco's緩沖鹽溶液中的抬，測溶液(相當于100、80、40或20IU/mlBRP標準EPO的EPO蛋白量)。注射4天后采集血樣，網(wǎng)織紅細胞用吖啶橙染色；在采集血樣后5小時內(nèi)用流式細胞儀計數(shù)總共30，000個血細胞，對網(wǎng)織紅細胞定量(參見歐洲藥典，2000，Erythropoietinisolutioconcentrata，1316，780-785和歐洲藥典(1996/2000，附件2002))。實施例10體內(nèi)半衰期測定給兔靜脈內(nèi)注射指定量的未修飾或HAS-修飾的EPO型。在指定時間采集血樣，制備血清。血清促紅細胞生成素水平通過體外生物測定或者通過EPO-特異性商品化ELISA測定。實施例11體內(nèi)藥代動力學小鼠每只動物皮下接受300IUEPO/kg。處理7天后測量每只動物的血細胞比容。在修飾EPO處理的所有動物中有9只觀察到血細胞比容顯著增加，由于未處理的EPO的半衰期相對較短，這是一個預料之中的結果。修飾EPO處理組的血細胞比容的平均變化與未處理EPO組和對照組顯著不同。兔兔用相當于200或者多達800ng/kg體重的單次劑量未修飾或HAS-修飾的EPO處理。2、6、16、24、48小時后用測定血漿濃度的商品化EPO-特異性ELISA分析血樣。測定平均血漿EPO濃度，如(Zettlmissl等人，1989，J.Biol.Chem.，264,21153—21159)所述，根據(jù)ELISA值計算平均初始半衰期(ot-相)和終末半衰期(J3-相)。Sytkowski，Lurm，Risinger和Davis，1999，AnErythropoietinFusionProteinComprisedofIdenticalRepeatingDomainsExhititisEnhancedBiologicalProperites，J.Biol.Chem.，274,24773-24778。實施例12HES-修飾的重組人IL-2的體外生物活性評估通過在UltrogelAcA54上凝力交過濾來回收纟務飾的IL2。無菌過濾相應級分的等份，使用依賴IL2的鼠CTLL-2細胞系測定IL2的生物活性[Gillis,Ferm，On和Smith,1978，J.Immunol.,120，2027-2032]?；钚耘c國際參照IL2標準制品相關聯(lián)。實施例13通過未氧化的還原性末端的還原胺化形成羥乙基淀粉衍生物實施例13.1羥乙基淀粉與1,3-二氨基-2-羥基丙烷的反應a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4,=18，000D，DS=0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol1，3-二氨基-2-羥基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在80下溫育17小時。將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的1:1冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D)，凍干。b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol1，3-二氨基-2-羥基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25下溫育3天。文獻:實施例13.2羥乙基淀粉與1，2-二羥基-3-氨基丙烷的反應OHa)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(MW-18，000D，DS=0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol1,2-二羥基-3-氨基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCN:BH3。獲得的混合物在80下溫育17小時。將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的1:1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D)，凍干。如G.Avigad，Anal.Biochem.134(1983)449-504所述，用高碘酸鹽氧化切割反應產(chǎn)物中的1，2-二醇產(chǎn)生醛，通過對醛定量間接證實1,2-二鞋基-3-氨基丙烷與HES的反應。b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol1，2-二羥基-3-氨基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25下溫育3天。實施例13.3羥乙基淀粉與1,4-二氨基丁烷的反應a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(匿=18，000D，DS-0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol1，4-二氨基丁烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在8G下溫育17小時。將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的l:l(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D)，凍干。b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol1，4-二氨基丁烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25下溫育3天。83實施例13.4羥乙基淀粉與1-巰基-2-氨基乙烷的反應a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(MW-18，000D,DS=0,4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol1-巰基-2-氨基乙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在80下溫育17小時。將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的1:1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D)，凍干。b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol1-巰基-2-氨基乙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25下溫育3天。實施例14:通過與未氧化的還原性末端偶聯(lián)形成羥乙基淀粉衍生物實施例14.1:羥乙基淀粉與碳酰肼的反應將0.96gHES18/0.4(MW=18，000D，DS=0.4)溶解于8ml0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol碳酰肼(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)。在25下攪拌18小時后，將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的l:l(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.SKD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D)，凍干。實施例14，2:羥乙基淀粉與己二酸二酰肼的反應將0.96gHES18/0.4(MW=18,000D，DS-0.4)溶解于8ml0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol己二酸二酰肼(LancasterSynthesis,Frankfurt/Main，D)。在25下攪拌18小時后，將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的1:1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D)，凍干。實施例14.3:羥乙基淀粉與1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲的反應HH將0.96gHES18/0.4(MW=18，000D，DS=0.4)溶解于8ml0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲(LancasterSynthesis,Frankfurt/Main，D)。在25下攪拌18小時后，向反應混合物中加入8ml水，懸液以4，500rpm離心15分鐘。將澄清的上清液傾析并隨后加至160mL丙酮與乙醇的1:1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，以4，S00rpm離心15分鐘。澄清的上清液用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D),凍干。實施例14.4:羥乙基淀粉與0-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺的反應0-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺如Boturyn等人Tetrahedron53(1997)5485-5492所述用可購得的材料通過兩步合成。將0.96gHES18/0.4(MW=18,000D，DS=0.4)溶解于8ml0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol0-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-85乙基]-羥胺。在25下攪拌18小時后，將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的l:l(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D),凍干。實施例15通過與氧化的還原性末端反應形成羥乙基淀粉衍生物實施例15.1羥乙基淀粉與碳酰肼的反應OH2N、人，NH22NN2HH將0.12mmol氧代-HES10/0.4(MW=10,000D,DS=0.4，根據(jù)DE19628705Al制備)溶解于3ml無水二曱亞砜(匿SO)中，在氮氣下逐滴加至15mmol碳酰肼(SigmaAldrich，Taufkirchen,D)在15mlDMSO中的混合物中。在65下攪拌88小時后，將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的l:l(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,D),凍干。實施例15.2羥乙基淀粉與1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲的反應將0.12mmol氧代-HES10/0.4(MW=10，000D，DS=0,4，根據(jù)DE19628705Al制備)溶解于3ml無水二曱亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴力口至15mmol1，4—亞苯基一二一3—氛基石克脈(LancasterSynthesisFrankfurt/Main，D)在15mlDMSO中的混合物中。在65下攪拌88小時后，將反應混合物加至160mL丙酮與乙醇的1:1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGrabH，Bonn,D)，凍干。實施例15.3羥乙基淀粉與肼的反應H2N-NH2將1.44g(0.12mmol)氧代-HES10/0.4(MW=10，000D，DS=0.4,根據(jù)DE19628705Al制備)溶解于3ml無水二甲亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴加至0.47ml(15mmol)肼在15mlDMSO中的混合物中。在40下攪拌19小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1(v/v)混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40mL水中，用0.5%(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH，Bonn,德國)，凍干。實施例15.4羥乙基淀粉與羥胺的反應o、^\—乂oh2ntv、。，v、Nh20-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺如Boturyn等人所述用可購得的材料通過兩步合成(Boturyn，Boudali，Constant,Defra闊，Lhomme，1997，Tetrahedron,53，5485)。將1.44g(0.12mmol)氧代-HES10/0.4(MW=10，000D，DS=0.4,根據(jù)DE19628705Al制備)溶解于3ml無水二甲亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴加至2，04g(15mmol)0-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺在15ml匿SO中的混合物中。在65下攪拌48小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的1:1(v/v)混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)，凍干。實施例15.5羥乙基淀粉與己二酸二酰肼的反應<formula>formulaseeoriginaldocumentpage88</formula>在65下將1.74g(15mmol)己二酸二酰肼溶解于20ml無水二曱亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴加入溶解于3ml無水二甲亞石風中的1.44g(0.12mmol)氧代-HES10/0.4(MW=10，000D，DS=0.4，根據(jù)DE19628705Al制備)。在60下攪拌68小時后，將反應混合物加至200mL水中。含有反應產(chǎn)物的溶液用0.5%(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)，凍干。實施例15.6羥乙基淀粉與1，4-二氨基丁烷的反應H2N^^^^2將1.44g(0.12mraol)氧代一HES10/0.4(磨=10,,D，DS=0,4,根據(jù)DE19628705Al制備)溶解于3ml無水二曱亞砜(DMSO)中，在氮氣下逐滴加至1.51ml(15ramol)1，4-二氨基丁烷在15mlDMSO中的混合物中。在40下攪拌19小時后，將反應混合物加至160mL乙醇與丙酮的l:l(v/v)混合物中。離心收集沉淀氨基-HES10KD/0.4,再溶解于40ml水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschlandGmbH,Bonn,德國)，凍干。實施例16促紅細胞生成素的氧化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage88</formula>氧化的促紅細胞生成素如實施例20所述生產(chǎn)。使用實施例20.11(c)所述的EP0-GT-1-A作為氧化的促紅細胞生成素(未進行酸水解，用溫和的高碘酸鹽氧化處理的EPO-GT-1)。實施例17:羥乙基淀粉衍生物與實施例4氧化的促紅細胞生成素的偶聯(lián)實施例17.1氧化的促紅細胞生成素與實施例14.1反應產(chǎn)物的反應用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055lug/pl)的20mMPBS緩沖液調節(jié)為pH5.3。向19piEPO溶液中加入根據(jù)實施例14.1產(chǎn)生的18piHES衍生物溶液(MW18kD;18.7iiig/^il,在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA,USA),如Invitrogeni兌明書所述，通過SDS-PAGE分析并且制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth,Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖3中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例17.2氧化的促紅細胞生成素與實施例14.3反應產(chǎn)物的反應用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055|ug/|ul)的20mMPBS緩沖液調節(jié)為pH5.3。向19piEPO溶液中加入#4居實施例14.3產(chǎn)生的18|ulHES衍生物溶液(MW18kD;18.7pg/fal，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25下溫育16小時。凍千后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA),如Invitrogeni兌明書所述，通過SDS—PAGE分斗斤4且制品。實施例17.3氧化的促紅細胞生成素與實施例14.4反應產(chǎn)物的反應用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055pg/|al)的20mMPBS緩沖液調節(jié)為pH5.3。向19julEPO溶液中加入根據(jù)實施例14.4產(chǎn)生的18piHES衍生物溶液(MW18kD;18.7pg/fxl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25下溫育16小時。凍千后，使用NuPAGE10%Bis—TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA),如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth,Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖4中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成89功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例17.4氧化的促紅細胞生成素與實施例15.1反應產(chǎn)物的反應用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055|ug/jLil)的20mMPBS緩沖液調節(jié)為pH5.3。向19)ilEPO溶液中加入根據(jù)實施例15.1產(chǎn)生的18piHES衍生物溶液(MW10kD;18.7pg/Vl,在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/M0PS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA),如Invitr。gen說明書所述，通過SDS—PAGE分沖斤凈且制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖5中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例17.5氧化的促紅細胞生成素與實施例15.2反應產(chǎn)物的反應用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055|Lig/V)的20mMPBS緩沖液調節(jié)為pH5.3。向19piEPO溶液中加入根據(jù)實施例15.1產(chǎn)生的18piHES衍生物溶液(MW10kD;18.7ng/pl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA),如Invitrogeni兌明書所述，通過SDS-PAGE分析凈且制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖5中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例18通過還原促紅細胞生成素形成巰基-EPO241.5jug促紅細胞生成素(EP0-GT-1，見實施例20)在500(il0.1M硼酸鈉緩沖液，5mMEDTA，10mMDTT(Lancaster,Morcambe,UK),pH8.3中37溫育1小時。使用VIVASPIN0,5ml濃縮器，10KDMWC0(VIVASCIENCE,Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾除去DTT,隨后用硼酸鹽緩沖液洗滌3次，用磷酸鹽緩沖液(O.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)洗滌2次。實施例19:用交聯(lián)化合物偶聯(lián)羥乙基淀粉衍生物與巰基促紅細胞生成素在下列每個實施例中，都使用N-(a-馬來酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯(AMAS)作為交聯(lián)化合物。實施例19.1巰基促紅細胞生成素與實施例14.1的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例14.1產(chǎn)生并且溶解于200pi0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)的50nmolHES書亍生物中加入IOjil2.5iumolAMAS(SigmaAldrich,Taufkirchen,D)在畫SO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13，000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。向剩余溶液中加入15根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1jig/Vl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGe1s/MOPS緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用RoU-考馬斯藍染色試劑(Roth,Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖6中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成91功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.2巰基促紅細胞生成素與實施例14.2的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例14.2產(chǎn)生并且溶解于200pl0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)的50nmolHES書f生物中力口入IO|ul2.5)LimolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen,D)在DMS0中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。<吏用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13，000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。向剩余溶液中加入15pg根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1jag1，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),如Invitrogeni兌明書所述，通過SDS—PAGE分沖斤并且制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES書f生物的數(shù)量。實施例19.3巰基促紅細胞生成素與實施例14.3的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例14.3產(chǎn)生并且溶解于200|al0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M,9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)的50nmolHES書亍生物中力口入10jil2.5]umolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在畫SO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE,Hannover,德國)，以13，000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。向剩余溶液中加入15pg根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EP0(1lig/pl,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/M0PS緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth,Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.4巰基促紅細胞生成素與實施例14.4的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例14.4產(chǎn)生并且溶解于200pi0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M,9.15MNaCl,50mMEDTA，pH7.2)的50nmolHES書亍生物中加入IOpi2.5jimolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在畫SO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13，000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。向剩佘溶液中加入15|iig根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1)ig/|al,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGe1s/MOPS緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA),如InvitrogerH兌明書所述，通過SDS-PAGE分析^L制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖6中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19,5巰基促紅細胞生成素與實施例13.1的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向在80溫育17小時以及25溫育3天的才艮據(jù)實施例13.1產(chǎn)生并且溶解于200(il0.1M磷酸鈉緩沖液(O.1M，9.15MNaCl,50mMEDTA,pH7.2)的50nmolHES書亍生#勿中力口入102.5|imolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在腿SO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWC0(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。向剩余溶液中加入15pg根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1jug/jal,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA),如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.6巰基促紅細胞生成素與實施例13.3的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向在80溫育17小時以及25溫育3天的根據(jù)實施例13.3產(chǎn)生并且溶解于200)ul0.1M磷酸鈉緩沖液(O.lM，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)中的50nmolHES書亍生物中力口入10|ul2.5|amolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen,D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWC0(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13，000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。向剩余溶液中加入15網(wǎng)根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1jug/pi,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,94CA，USA)，如Invitrogeni兌明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用RoU-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.7巰基促紅細胞生成素與實施例15.1的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例15.1產(chǎn)生并且溶解于200pl磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)6勺50nmolHES書亍生凈勿中力口入10jul2.5(amolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在DMS0中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。向剩余溶液中加入15jug根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1pg/Vi,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.8巰基促紅細胞生成素與實施例15.2的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例15.2產(chǎn)生并且溶解于200iul磷酸鹽緩沖液(O.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA,pH7.2)的50nmolHES書亍生物中力口入10ial2.5pmolAMAS(SigmaAldrich,Taufkirchen,D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。<吏用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWC0(VIVASCIENCE,Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。向剩余溶液中加入15|ag才艮據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1jug/Vl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA),如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth,Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.9巰基促紅細胞生成素與實施例15.3的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例15.3產(chǎn)生并且溶解于200ial磷酸鹽緩沖液(O.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7,2)的50nmolHES書亍生物中力口入10pi2.5|LimolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。向剩余溶液中加入15ng根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1lig/]utl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍千后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGe1s/M0PS緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA),如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth,Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用的HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.10巰基促紅細胞生成素與實施例15.4的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例15.4產(chǎn)生并且溶解于200pi磷酸鹽緩沖液(O.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)中的50簡olHES衍生物中力口入10pi2.5|umolAMAS(SigmaAldrich,Taufkirchen，D)在DMS0中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。向剩余溶液中加入15pg根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1pg/jul,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/M0PS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例19.11巰基促紅細胞生成素與實施例15.5的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例15.5產(chǎn)生并且溶解于200jul磷酸鹽緩沖液(O.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)中的50nmolHES衍生物中力口入10iul2.5|umolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen,D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE,Hannover,德國)，以13，000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。97向剩余溶液中加入15根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EP0(1pg/Vl,在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/M0PS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA),如Invitrogeni兌明書所述，通過SDS—PAGE分析斗且制品。凝膠用Roti-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES^f汙生物的數(shù)量。實施例19.12巰基促紅細胞生成素與實施例15.6的反應產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應向根據(jù)實施例15.6產(chǎn)生并且溶解于200pl磷酸鹽緩沖液(O.1M，9.15MNaCl，50mMEDTA,pH7.2)中的50nmolHES書亍生物中力口入10jlU2.5(imolAMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25下溫育80分鐘，在40下溫育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE,Hannover,德國)，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。向剩余溶液中加入15pg根據(jù)實施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1jLig/jil，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25下溫育16小時。凍干后，使用NuPAGE10%Bis-TrisGels/M0PS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA),如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用RoU-考馬斯藍染色試劑(Roth，Karlsruhe,D)染色過夜。實驗結果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質連接的HES衍生物的數(shù)量。實施例20HES-EPO偶聯(lián)物的制備性生產(chǎn)概述98HES-EP0偶聯(lián)物如下合成將HES衍生物(平均分子量為18，000道爾頓；羥乙基取代程度為0.4)與重組人EP0的寡糖鏈上部分(溫和的高碘酸鹽)氧化的唾液酸殘基偶聯(lián)。根據(jù)碳水化合物結構分析，引入的修飾不影響核心寡糖鏈的結構完整性，因為經(jīng)弱酸處理的HES-修飾聚糖的MALDI/T0F-MS顯示完整的中性N-乙?；樘前沸玩?，它與未修飾EPO產(chǎn)物中所見的鏈沒有差別。獲得的結果表明，對于預先沒有部分去除唾液酸而進行修飾的EP0制品，每個EP0分子至少連接3個修飾的HES殘基。缺少前述蛋白質中約50%唾液酸殘基的EPO變體在SDS-PAGE中顯示類似的高表觀分子量遷移率(60-110KDa比BRPEPO標準的40KDa)。在室溫和pH3-10下的標準離子交換層析條件下，HES修飾的EP0穩(wěn)定。在紅細胞正常的小鼠系中進行EPO生物檢測，根據(jù)歐洲藥典用紫外線吸收值測定蛋白質，RP-HPLC測定EPO蛋白質并經(jīng)BRPEPO標準制品校準，在該檢測中，HES修飾的EPO具有比國際BRPEPO參照標準高2.5-3.0倍的比活性(IU/mg)。實施例20.1材料與方法(a)通過N-糖苷酶消化釋放N-連接的寡糖樣品與25單位(根據(jù)德國RocheDiagnostics的廠商說明書)重組PNGaseF在37下溫育過夜。根據(jù)蛋白質在SDS-PAGE中的比遷移率位移來監(jiān)測完全消化。通過加入3倍體積的冷100°/。乙醇，并在-20下放置至少2小時，從多肽中分離釋放的N-聚糖(SchroeterS等人，1999)。在4下以13000rpm離心10分鐘除去沉淀的蛋白質。然后用500pi冰冷的75%乙醇再洗滌沉淀兩次。合并上清液中的寡糖在真空離心機(SpeedVac濃縮器，SavantInstrumentsInc.,USA)中干燥。聚糖樣品在使用前用Hypercarb柱(25mg或100mgHyperCarb)如下脫鹽柱用500Jul溶于0.1%TFA中的80。/。乙腈(v/v)洗滌3次，隨后用500(^1水洗滌3次。樣品用水稀釋至終體積300|al-60Qpl，之后上柱，然后用水充分洗滌柱子。寡糖用1.2ml(25mg柱；對于99100mg柱為1.8ml)含有0.1%三氟乙酸(v/v)的25%乙腈水溶液洗脫。洗脫的寡糖用2MNH40H中和，在SpeedVac濃縮器中干燥。在某些情況下，通過將總(糖)蛋白樣品〈100^tg的消化混合物吸附到100mgHypercarb柱上，對N-糖苷酶釋》文的寡糖進行脫鹽。(b)通過基質輔助激光解吸/電離飛行時間質語法(MALDI/TOF/TOF-MS)對寡糖的分析使用BrukerULTRAFLEX飛行時間(TOF/TOF)儀器在陽離子及陰離子模式中使用2，5-二羥基苯甲酸作為紫外線吸收材料，在兩種模式中均使用反射器(reflectron),分析天然去唾液酸化的寡糖。對于MS-MS分析，選擇母離子進行激光誘導的解離(LID)，獲得的碎片離子用儀器的第二TOF階段(LIFT)分離。濃度約為1-10pmol卞l—的1pl樣品溶液與等量的各自的基質混合。將該混合物點樣到不銹鋼靶上，分析前在室溫下干燥。實施例20.2重組人EPO(EPO-GT-1)的制備和鑒定如(MuellerPP等人，1999，DornerAJ等人，1984)所述由重組CHO細胞表達EPO,根據(jù)歐洲藥典所述的方法鑒定這些制品(Ph.Eur,4，Monography01/2002:1316:Erythropoietinconcentratedsolution)。終產(chǎn)物的唾液酸含量為每nMol蛋白質12nMol(+/-1.5nMol)。N-連接寡糖的結構如(Nimtz等人，1999，Grabenhorst，1999)所述通過HPAEC-PAD和MALDI/T0F-MS測定。獲得的EPO制品含有二、三、四唾液酸化的寡糖(分別為2-12%、15-28%和60-80%，少量存在硫酸化和五唾液酸化鏈)。EPO制品的總糖基化特征類似于國際BRPEPO標準制品。重組EPO的等電聚焦模型與國際BRP參照EPO標準制品相當，表明是相應的同種型。25°/。的EPO蛋白在多肽鏈的Ser^處缺乏0-糖基化。實施例20.3部分去唾液酸化的EPO形式的制備EPOGT-1蛋白(2.84mg/ml)在20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0中加熱到80，然后每1mlEPO溶液加入100|ul1NH2S04;分別繼續(xù)溫育5分鐘、10分鐘、60分鐘，產(chǎn)生不同唾液酸化程度的EPO制品。用多肽N-糖苷酶釋放寡糖后對含有0-4個唾液酸的寡糖進行定量，通過用Hypercarb柱(25mgHyperSepHypercarb;Thermo-Hypersil-Keystone,UK)脫鹽進行N-連接4連的分離。加入1NNaOH中和EPO制品，在液氮中冷凍，貯存于-20，直到下一步使用。實施例20.4唾液酸化EPO形式的高硤酸鹽氧化向溶解于3.5ml20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0中的10mg未處理或弱酸處理的EPO中加入1.5ml0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5，將混合物在冰浴中冷卻到0;加入500jul10mM高石典酸鈉，反應混合物在0下避光保持60分鐘。加入10nl甘油，繼續(xù)避光溫育10分鐘。4吏用VIVASPIN濃縮器(10，000MWCO，PESVivascienceAG，Hannover，德國)，根據(jù)廠商推薦，在配備固定角轉子的實驗室離心機中以3000rpm脫鹽，從試劑中分離部分氧化的EPO形式。在液氮中冷凍后，EPO制品以4ml的終體積貯存于-20。對100網(wǎng)等份的部分氧化EPO制品進行N-糖苷酶處理，寡糖如上所述用Hypercarb柱分離。寡糖通過弱酸處理去唾液酸化，用HPAEC-PAD分析，它們的保留時間與如(Nimtz等人，1990和1993)所述的可信標準寡糖相當。實施例20.5用二硫赤蘚糖醇還原EPO二硫醚在30mM二硫赤蘚糖醇(DTT)存在下，將5mgEPO-GT-l在5ml0.1MTris/HCl緩沖液pH8.1中，37溫育60分鐘；使用Vivaspin濃縮器在4下除去DTT,更換緩沖液4個循環(huán)。最終的還原EPO制品冷凍于液氮中，在50mM乙酸鈉緩沖液pH5.5中貯存于-20。實施例20.6EPO蛋白測定EP0蛋白的定量測定如下進行根據(jù)歐洲藥典(歐洲藥典4，專題01/2002:1316:促紅細胞生成素濃縮溶液)，在lcm徑長的比色杯中測定280nm處的紫外線吸光度。另外，也可以使用RP-C4柱(VydacProteinC4，目錄號214TP5410,GraceVydac，Ca，US),通過RP-HPLC方法對EPO定量；HPLC方法用促紅細胞生成素BRPl參照標準校準(歐洲藥典，ConseildePEuropeB.P.907-F67029,StrasbourgCedex1)。實施例20.7用半乳糖氧化酶氧化去唾液酸化的EPO在16pi過氧化氫酶(6214單位/2QQml)和80|ul半乳糖氧化酶(2250單位/ml,來自《e/7fi^ro/fl^(Sigma-Aldrich,Steinheim，德國)存在下，將4.485mg完全去唾液酸化的EPO在20mM磷酸鈉緩沖液pH6.8中，37溫育過夜；在溫育開始4小時和8小時后分兩次加入20pl半乳糖氧化酶。實施例20.8用于生物檢測的EPO樣品的制備從高碘酸鹽或半乳糖氧化酶氧化的EPO蛋白制品與活化的HES溫育反應中純化EPOEPO樣品的純化(除去未反應的HES衍生物)在室溫下進行。EP0溫育混合物(約5mgEPO蛋白)用緩沖液A(20mMN-嗎啉丙磺酸[MOPS/NaOH]，在雙蒸水中，pH8.0)1:10稀釋，以0.5ml/min的流速上樣到用10倍柱體積(CV)緩沖液A平衡的含有3mlQ-SepharoseHP(Pharmacia編號17-1014-03，批號220211)的柱上。用6-8倍柱體積的緩沖液A洗柱(流速^.8ml/min)，使用緩沖液B(20mM嗎啉乙磺酸[MES/NaOH]，0.5MNaCl，在雙蒸水中，pH6.5)以0.5ml/min的流速進行洗脫。根據(jù)280nm處的紫外線吸光度檢測EPO，洗脫到約6ml中。柱用3倍柱體積的緩沖液C(20mMMES，1.5MNaCl,在&0中，調節(jié)為pH6.5)再生，用10倍柱體積的緩沖液A再平衡(流速=0.7ml/min)。用Vivaspin濃縮器和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對Q-Sepharose步驟獲得的EP0洗脫物進行緩沖液更換，每個樣品進行3個離心循環(huán)；樣品用PBS調節(jié)為2ml，貯存于-20°C。因為在所采用條件下基礎EP0型不結合Q-Sepharose并發(fā)現(xiàn)與未反應的HES衍生物一起出現(xiàn)在穿流液中，因此從Q-Sepharose洗脫物中只獲得<25%的部分唾液酸化、隨后溫和高碘酸鹽氧化的經(jīng)HES修飾的EPO型。實施例20.9脈沖安培檢測的高pH陰離子交換層析(HPAEC-PAD)使用配有CarboPacPAl柱(0.4x25cm)的DionexBioLC系統(tǒng)(Dionex，USA),通過高pH陰離子交換(HPAE)層析以及脈沖安培檢測器(PAD)，分析純化的天然及去唾液酸化的寡糖(Schroter等人，1999;Nimtz等人，1999)。檢測器電勢(E)和脈沖持續(xù)時間(T)為El:+50mV，Tl:480ms;E2:+500mV，T2:120ms;E3:-500mV，T3:60ms,輸出范圍為500-1500nA。然后將寡糖注射到用100%溶劑A平衡的CarboPacPAl柱上。對于去唾液酸化的寡糖，在40分鐘內(nèi)4吏用溶劑B的線性梯度(0-20°/。)，隨后在5分鐘內(nèi)將溶劑B從20%線性提高到100%,進行洗脫(流速lml.min—"。溶劑A是溶于雙蒸水的0.2MNaOH，溶劑B由溶于溶劑A的0.6MNaOAc組成。對于天然寡沖唐，柱子用100°/。溶劑C(0.1MNaOH,溶于雙蒸水)平ff,在48分鐘內(nèi)4吏用線性梯度(0-35%)溶劑D,隨后在10分鐘內(nèi)將溶劑D從35%線性提高到100%，進行洗脫(流速:lml.min—)。溶劑D由溶于溶劑C的0.6MNaAc組成。實施例20.10通過GC-MS進行N-聚糖、HES-修飾的N-聚糖和EPO蛋白的單糖組成分析在曱醇分解、N-再乙?；腿谆柰榛?，通過GC/MS分析相應的曱基糖苷[Chaplin,M.F.(1982)—種快速、靈敏的碳水化合物分析方法.Anal.Biochem.123,336-341]來分析單糖。這些分析用Fi皿iganGCQ離子阱質譜儀(FinniganMATcorp.,SanJose,CA)進行，其以配備一個30mDB5毛細管柱的陽離子EI模式運行。溫度程序80。C恒溫2min,然后每分鐘升高10度，至300。C。根據(jù)保留時間和特有的斷裂模式鑒定單糖。未校正的電子峰積分的結果用于定量。由于正位異構化和/或存在呋喃型和吡喃型而產(chǎn)生一個以上峰的單糖，通過加和所有主峰來定量。0.5pg肌醇用作內(nèi)部標準化合物。實施例20.11結果實施例20.11(a)弱酸處理的(部分去唾液酸化的)EPO-GT-1的N-聚糖的鑒定如圖9所示，在與N-糖苷酶溫育釋放N-連接寡糖之前及之后，通過SDS-PAGE分析經(jīng)弱酸處理5、10或60分鐘的EPO-GT-1制品。對N-連接寡糖進行HPAEC-PAD寡糖作圖(圖10)。未處理的EP0-GT-1含有〉90%的具有3或4個唾液酸殘基的N-連接寡糖，而在弱酸存在下溫育5分鐘后，<40%的碳水化合物鏈含有3或4個唾液酸殘基。去唾液酸化N-聚糖的HPAEC-PAD顯示，檢測的未處理EPO-GT-1的中性寡糖比例在酸處理5、10或60分鐘的制品中保持穩(wěn)定。去唾液酸化聚糖的MALDI/TOF-MS顯示，在弱酸處理蛋白質后存在<90%的近端巖藻糖。實施例20.11(b)高碘酸鹽處理的EPO-GT-1的鑒定對于預先酸處理5分鐘和10分鐘或者不予處理的溫和高碘酸鹽處理的EP0型，在圖12中比較它們的SDS-PAGE遷移率。用于高碘酸鹽氧化唾液酸的條件不改變EPO制品的SDS-PAGE圖(比較圖9)。唾液酸的氧化在HPAEC-PAD分析中導致寡糖向較早洗脫時間遷移(比較圖10和13)。實施例20.11(c)HES-修飾的EPO衍生物的鑒定(aa)用根據(jù)實施例14.4產(chǎn)生的羥胺修飾的HES衍生物X對EPO-GT-1-A進行HES修飾的時程(timecourse)將400jug羥胺修飾的HES衍生物X加入溶于20juL0.5MNaOAc緩沖液pH5.5中的20|ugEPO-GT-1-A(溫和高碘酸鹽氧化的EPO,在溫和高硤酸鹽氧化之前未經(jīng)酸水解)中，分別在30分鐘、2、4、17小時后，通過將樣品冷凍于液氮中，終止反應。隨后將樣品貯存于-20，直到進一步分析。加入SDS-PAGE樣品緩沖液，將樣品加熱到90,加樣到SDS-凝膠上。如圖14所示，溫育時間延長導致向較高分子量蛋白質的遷移增加。在羥胺修飾的服S衍生物X存在下溫育17小時后，檢測到一條彌散的考馬斯藍染色的蛋白帶，根據(jù)分子量標準的位置，它在60-11KDa之間的區(qū)域遷移(見圖14的左部分)。用N-糖苷酶處理后，大多數(shù)蛋白質向去-N-糖基化EPO的位置遷移(見圖14,右側凝膠；箭頭A表示N-糖苷酶的遷移位置；箭頭B表示去-N-糖基化EPO的位置；推定在28KDa與36KDa分子量標準之間區(qū)域內(nèi)所見的彌散蛋白帶代表HES在分子的0-糖基化位點修飾的EPO型。關于N-糖苷酶的特異性，我們由該結果得出結論，實際上HES-修飾發(fā)生在EPO蛋白的聚糖之高碘酸鹽氧化的唾液酸殘基處。(bb)HES-EPO偶聯(lián)物的鑒定HES-EPO偶聯(lián)物I(來源于溫和高碘酸鹽氧化后的EPO-GT-1，即來源于EPO-GT-1-A)、II(來源于酸水解5分鐘且溫和高碘酸鹽氧化的EPO-GT-1)、III(來源于酸水解10分鐘且溫和高碘酸鹽氧化的EPO-GT-l)如前所述合成。包括在相同緩沖液條件下的對照溫育(K),其中包括未修飾的EPO-GT-1并加入等量的未修飾HES。為了隨后進行的HES-EPO衍生物的生物化學分析，進一步純化這些溫育混合物。HES-EPO偶聯(lián)物I、n和in以及對照溫育K的溫育物如"材料與方法，，(實施例20.8)所述進行Q-Sepharose純化步驟，以除去過量未反應HES試劑，后者預計出現(xiàn)在離子交換柱的穿流液中。由于在預先酸處理的樣品II和III中含有大量的基礎EPO型，我們預計在穿流液中會含有來自這些溫育物的相當量的修飾的EPO產(chǎn)物。如圖15所示，幾乎所有來源于樣品I的EPO都被Q-Sepharose柱保留，而樣品III和II中只有約20-30°/。被回收到用高鹽濃度洗脫的級分中。在SDS-PAGE中，與對照EPO相比，在穿流液和用高鹽洗脫的級分中，與HES衍生物X溫育產(chǎn)生的所有蛋白質物質都具有更高的表觀分子量。為了更詳細地鑒定HES-修飾的EPO樣品A和K(見圖13)，我們與高碘酸鹽氧化形式EPO-GT-1-A進行比較。樣品進行N-糖苷酶處理，如圖16a和16b所示，N-聚糖的釋放在標準EPO制品的0-糖基化和非糖基化EPO型位置處產(chǎn)生兩條低分子量帶。對于樣品A，檢測到另一條在28KDa分子量標準位置處遷移的帶，提示在該EPO變體的0-聚糖處發(fā)生HES-修飾(參見實施例20.11(c)(aa))。在溫和水解樣品后，這條帶(以及高度HES-修飾的高分子量形式的N-糖基化EPO,見圖16a和16b)消失，這與在促紅細胞生成素的高捵酸鹽氧化的唾液酸殘基處發(fā)生HES修飾的看法一致。使用能夠從寡糖上完全除去唾液酸殘基(以及唾液酸連接的HES衍生物)的條件，水解N-糖苷酶溫育的混合物等份；中和后，將混合物吸附到小Hypercarb柱上進行脫鹽。用水充分洗滌該柱，隨后用含有0.1%三氟乙酸的40%乙腈水溶液洗脫結合的中性寡糖。對產(chǎn)生的寡糖進行MALDI/TOF-MS。來自樣品A、EPO-GT-1-A和樣品K的去唾液酸化寡糖級分的波譜顯示復雜型寡糖的相同質量數(shù)m/z=1810Da(二分支)、2175=三分支、2540=四分支、2906=四分支+1個N-乙酰基乳糖胺重復、3271=四分支+2個N-乙?；樘前分貜?；檢測到對應于缺乏巖藻糖(-146)和半乳糖(-162)的弱信號，這可歸因于去除唾液酸所使用的酸水解條件(見MALDI-圖19、20、21)。在一個平行實驗中，將N-糖苷酶消化混合物吸附到1mlRP-C18柱上(寡糖預先沒有用酸水解)，用含有0.1%TFA的5%乙腈水溶液進行洗脫；在這些條件下，EPO蛋白完全保留在RP-材料上，用含有0.1%TFA的5%乙腈水溶液從柱上洗下寡糖。用含有0.1%TFA的70%乙腈水溶液洗脫去-N-糖基化的EPO蛋白。中和N-糖苷酶處理的樣品A、EPOGT-l-A和樣品K經(jīng)過RP-C18步驟后獲得的寡糖級分，如前所述用Hypercarb柱脫鹽。在能夠從聚糖上定量除去唾液酸的條件下進行弱酸處理之前(見圖17)及之后(見圖18)，對分離的寡糖進行HPAEC-PAD作圖。從HES修飾的樣品A中所得天然物質的HPAEC-PAD圖只顯示可以忽略的寡糖信號，而EPOGT-1-A-衍生的寡糖顯示與圖13所示樣品(稱為溫和高f典酸鹽處理后的EPO-GT-1樣品)相同的聚糖HPAEC-PAD圖。由對照EPO樣品(K)獲得的寡糖洗脫圖產(chǎn)生預期的圖案(圖10中的比較圖)。為了比較，包括了用于比較和參照標準的國際BRP-EPO標準的天然寡糖譜。在弱酸水解后，所有寡糖制品都顯示相同的中性寡糖結構的洗脫圖(見圖18)，該結構具有二、三、四分支復雜型碳水化合物鏈的定性和定量組成，如在作為本研究初始材料的EPO制品的方法部分所述。該結果證實，EPO樣品的HES-修飾導致HES衍生物的共價連接，該衍生物可以用N-糖苷酶從EPO-蛋白質上分離下來，使用碳水化合物去唾液酸化的弱酸處理條件可以將其從N-聚糖上去除(見圖16a+b)，因此該衍生物是酸不穩(wěn)定的。(cc)通過GC-MS對HES-EPO和HES-EPON-聚糖的單糖組成分析為了進一步證實EPO在分子N-聚糖處的HES-修飾，用N-糖苷酶消化EPO樣品，EPO蛋白被吸附到RP-C18柱上，而寡糖物質如上所述洗掉。如表3所示，只在半胱氨酸殘基處進行了HES修飾的EPO蛋白中和EPO樣品A2之寡糖級分中檢測到了葡萄糖和羥乙基化葡萄糖衍生物。實施例20.11(d)HES-修飾的EPO的體內(nèi)生物活性檢測按照歐洲藥典所述方法在紅細胞正常的小鼠系中進行EPO生物檢測；進行EPO檢測的實驗室使用國際BRPEPO參照標準制品。對于HES-修飾的EPOA2制品，測得比活性平均值為每mgEPO蛋白294600單位，表明與同樣進行活性測定的國際BRPEPO參照標準制品相比，比活性約高3倍。研究結果總結于表4中。實施例13-20的參考文獻NimtzM，NollG,PaquesEP,ConradtHS.CarbohydratestructuresofahumantissueplasminogenactivatorexpressedinrecombinantChinesehamsterovarycells.FEBSLett.1990Oct.1;271(卜2):14-8DornerAJ,WasleyLC，KaufmanRJ.Increasedsynthesisofsecretedproteinsinducesexpressionofglucose—regulatedproteinsinbutyrate—treatedChinesehamsterovarycells.JBiolChem.1989Dec5;264(34):20602-7MuellerPP，SchlenkeP,NimtzM，ConradtHS，HauserHRecombinantglycoproteinqualityinproliferation-controlledBHK-21cells.BiotechnolBioeng.1999Dec5;65(5):529-36NimtzM，MartinW,WrayV，KloppelKD，AugusUnJ,ConradtHS.StructuresofsialylatedoligosaccharidesofhumanerythropoietinexpressedinrecobminantBHK-21cells.EurJBiochem.1993Apr.1;213(1):39-56HermentinP，WitzelR，VIiegenthartJF，KamerlingJP,NimtzM，ConradtHS.AstrategyforthemappingofN—glycansbyhigh-phanion—exchangechromatographywithpulsedamperometricdetection.AnalBiochem.1992Jun;203(2):281-9SchroterS，DerrP,Co眼dtHS，NimtzM,HaleG，KirchhoffC.MalespecificmodificationofhumanCD52.JBiolChem.1999Oct.15;274(42):29862-73表1<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>表3來自HES修飾的EP0和對照樣品之聚糖的單糖組成分析<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>權利要求1.一種羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)，其含有一個或多個HAS分子，其中每個HAS都與多肽通過碳水化合物部分偶聯(lián)。2.權利要求1的HAS-多肽，其中所述多肽是人源性的。3.權利要求1或2的HAS-多肽，其中所述多肽選自促紅細胞生成素、白介素特別是白介素-2、IFN-p、IFN-oc、CSF、白介素6和治療性抗體。4.權利要求3的HAS-多肽，其中所述促紅細胞生成素具有人促紅細胞生成素的氨基酸序列。5.權利要求1的HAS-多肽，其中所述多肽含有通過N-和/或0-連接糖基化作用與該多肽連接的一個或多個碳水化合物側鏈。6.權利要求5的HAS-多肽，其中在哺乳動物、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側鏈已與所述多肽連接。7.權利要求6的HAS-多肽，其中所述哺乳動物細胞是人細胞。8.權利要求5的HAS-多肽，其中所述HAS與所述多肽通過碳水化合物部分偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。9.權利要求8的HAS-多肽，其中所述碳水化合物部分是被氧化的。10.權利要求8的HAS-多肽，其中所述HAS與碳水化合物側鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)。11.權利要求8的HAS-多肽，其中所述多肽是EPO,并且HAS與碳水化合物伯H連的唾液酸殘基偶聯(lián)。12.權利要求1的HAS-多肽，其中所迷HAS與所述多肽通過接頭分子偶聯(lián)。13.權利要求1的HAS-多肽，其中每個多肽分子具有1-12個HAS分子。14.權利要求1的HAS-多肽，其中所述HAS是羥乙基淀粉(HES)。15.權利要求14的HAS-多肽，其中HES的分子量為1-300kDa。16.權利要求14的HAS-多肽，其中HES顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2:"取代比。17.—種生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)的方法，包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應的多肽，b)提供能夠與步驟a)的多肽反應的修飾的HAS,和c)使步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應，由此產(chǎn)生含有一個或多個HAS分子的HAS-多肽，其中每個HAS都與多肽通過碳水化合物部分偶聯(lián)。18.權利要求17的方法，其中所述多肽是人源性的。19.權利要求17的方法，其中所述多肽選自促紅細胞生成素、白介素特別是白介素-2、IFN-p、IFN-a、CSF、白介素6和治療性抗體。20.權利要求19的方法，其中所述促紅細胞生成素具有人促紅細胞生成素的氨基酸序列。21.權利要求17的方法，其中所述多肽是重組產(chǎn)生的。22.權利要求17的方法，其中所述多肽含有通過N-和/或0-連接糖基化作用與該多肽連接的一個或多個碳水化合物側鏈。23.權利要求22的方法，其中在哺乳動物特別是人、昆蟲或酵母細胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側鏈已與所述多肽連接。24.權利要求23的方法，其中所述哺乳動物細胞是人細胞。25.權利要求22的方法，其中所述HAS與所述多肽通過碳水化合物部分偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側鏈的一部分。26.權利要求25的方法，其中在步驟a)中，通過氧化所述多肽的一個或多個碳水化合物側鏈的至少一個碳水化合物部分來修飾該多肽。27.權利要求26的方法，其中所述至少一個碳水化合物部分是至少一個末端糖單元。28.權利要求27的方法，其中在通過酶法或化學法或通過酶和化學法部分或完全地除去末端唾液酸后氧化所述末端糖單元。29.權利要求26的方法，其中所述至少一個碳水化合物部分是半乳纟唐或唾液酸殘基。30.權利要求27的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與氧化的末端糖單元偶聯(lián)。31.權利要求17的方法，其中修飾所述HAS，使其含有游離的酰肼、羥胺、硫醇或氨基脲官能團。32.權利要求17的方法，其中步驟c)在至少含有10%重量的H20的反應介質中進行。33.權利要求17的方法，其中所述HAS與所述多肽通過接頭分子偶聯(lián)。34.權利要求17的方法，其中所述HAS是羥乙基淀粉(HES)。35.權利要求34的方法，其中HES的分子量為1-300kDa。36.權利要求34的方法，其中HES顯示相對于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2:G取代比。37.可通過權利要求17的方法獲得的HAS-多肽。38.—種藥物組合物，其含有根據(jù)權利要求1的HAS-多肽。39.權利要求38的藥物組合物，進一步含有至少一種藥學可接受的載體。40.權利要求1的HAS-多肽在制備治療貧血性疾病或造血功能障礙性疾病的藥物中的用途，其中所述多肽是EPO。全文摘要本發(fā)明涉及含有一個或多個HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)，其中每個HAS通過碳水化合物部分或硫醚與多肽偶聯(lián)，本發(fā)明還涉及該偶聯(lián)物的生產(chǎn)方法。在一個優(yōu)選實施方案中，該多肽是促紅細胞生成素(EPO)。文檔編號C07K14/54GK101580547SQ20091013323公開日2009年11月18日申請日期2003年8月8日優(yōu)先權日2002年9月11日發(fā)明者?？柼亍じ窭竞账固?曼弗雷德·尼姆茲,沃爾夫拉姆·艾希納,羅納德·弗蘭克,諾貝特·扎恩特爾,阿拉爾德·S·康拉德特申請人:弗雷澤紐斯卡比德國有限公司