專利名稱：以il-6拮抗劑作為有效成分治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的制作方法
本申請(qǐng)是1995年06月07日提交的95196077.6號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)“以IL-6拮抗劑作為有效成分治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，或含有白介素-6拮抗劑作為有效成分的滑膜細(xì)胞生長抑制劑。

背景技術(shù)：
慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為一系統(tǒng)性的慢性炎性疾病，該疾病主要是由于結(jié)締組織包括滑膜組織在關(guān)節(jié)內(nèi)異常生長所致(Melnyk et al.，Arthritis Rheum.33493-500，1990)。在慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)可以看到明顯的滑膜細(xì)胞增殖，如由于滑膜細(xì)胞異常生長所致的多層結(jié)構(gòu)形成(血管翳形成)，滑膜細(xì)胞浸入軟骨及骨組織，滑膜內(nèi)血管形成，炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的浸潤。已有報(bào)道認(rèn)為慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理與遺傳，細(xì)菌感染及各種細(xì)胞因子和生長因子有關(guān)，但其確切的發(fā)病機(jī)理仍未闡明。
近年來，在慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑膜及滑膜液中已檢測出若干細(xì)胞因子及生長因子，其中包括有白介素-1(IL-1)，白介素-8(IL-8)，腫瘤壞死因子α(TNFα)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)及血小板衍化生長因子(PDGF)、(Nouri et al.，Clin.Exp.Immunol.55295-302，1984；Thornton et al.，Clin.Exp.Immunol.8679-86，1991；Saxne，et al.，Arthritis Rheum，311041-1045，1988；Seitz et al.，J.Clin.Invest.87463-469，1991；Lafyatis et al.，J.Immunol.1431142-1148，1989；Melnyk et al.，ArthritisRheum.33493-500，1990)。
現(xiàn)認(rèn)為IL-1，TNFα及PDGF為非常強(qiáng)的滑膜細(xì)胞生長因子(Thornton et al.，Clin.Exp.Immunol.8679-86，1991；Lafyatis et al.，JImmunol.1431142-1148，1989；Gitter et al.，Immunology 66196-200，1989)。另外認(rèn)為通過IL-1及TNF刺激可導(dǎo)致滑膜細(xì)胞白介素-6(IL-6)的生成(Ito el al.，Arthmitis Rheum.351197-1201，1992)。
IL-6為一細(xì)胞因子，又被稱為B細(xì)胞刺激因子2或干擾素β2。起初由于IL-6激活B淋巴細(xì)胞所以認(rèn)為其是一種分化因子(Hirano，T.et al.，Nature 324，73-76；1986)，以后發(fā)現(xiàn)IL-6為一多功能細(xì)胞因子，其可以影響多種細(xì)胞的功能(Akira，S.et al，Adv，in Immunology 54，1-78，1993)。IL-6活性的發(fā)揮需要有兩種功能不同的細(xì)胞膜分子。其中之一為IL-6受體(IL-6R)，分了子量約為80KD，其可特異性地與IL-6結(jié)合。
IL-6R主要是以與細(xì)胞膜結(jié)合的形式存在，其在細(xì)胞膜上表達(dá)并且滲透到細(xì)胞膜，但也能以溶解的IL-6R形式存在(SIL-6R)，其主要是由細(xì)胞外的部分組成。另一個(gè)蛋白質(zhì)是gp 130，分子量約為130KD，該蛋白質(zhì)不與配體結(jié)合，其功能主要是介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)。IL-6與IL-6R形成復(fù)合物IL-6/IL-6R，該復(fù)合物再與另一個(gè)膜蛋白gp 130結(jié)合從而引發(fā)IL-6對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)活性(Tega et al.，J.Exp.Med.196967，1987)。
已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的血清及滑膜液中含有過量的白介素-6(IL-6)及可溶性的IL-6受體(SIL-6R)(Houssiau et al.，Arthritis Rheum.31784-788，1988；Hirano et al.，Eur.J.Immunol，181797-1801，1988；Yoshioka et al.，Japn.J.Rheumatol.inpress)，而且在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中也得到類似結(jié)果(Takai et al.，Arthritis Rheum.32594-600，1989；Leisten et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.56108-115，1990)，這些結(jié)果表明IL-6與慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。
然而，日本未審查的專利公開號(hào)為4-89433披露了可強(qiáng)烈促進(jìn)IL-6生成的肽類可以有效的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
Higaki等則認(rèn)為IL-6可減慢慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞的生長，所以IL-6有抑制滑膜細(xì)胞生長的功能(Clinical Immunology，22880-887，1990)。這樣，有關(guān)IL-6與慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系上存在相互矛盾的報(bào)道，并且該關(guān)系目前還不清楚。
最近，Wendling等人報(bào)道對(duì)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人服用抗-IL-6抗體可暫時(shí)緩解臨床及生物學(xué)癥狀，同時(shí)血清中IL-6的水平也升高(J.Rheumatol.20259-262，1993)。
這些報(bào)告對(duì)于IL-6對(duì)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的生長是有促進(jìn)作用還是有抑制作用，有關(guān)這方面沒有任何數(shù)據(jù)，所以現(xiàn)在還不清楚IL-6對(duì)慢性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人的滑膜細(xì)胞是否有直接作用。
本發(fā)明披露 抗炎癥的甾體類制劑如皮質(zhì)類固醇已被用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但由于持續(xù)使用該類藥物可引發(fā)如皮膚損害及抑制腎上腺皮質(zhì)功能等所不希望的副作用，所以一直在尋找副作用較小的藥物。
本發(fā)明的目的是提供一種沒有上述缺點(diǎn)的新的治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。更進(jìn)一步地講本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物可以抑制慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的異常增殖，其有效成分為白介素-6的拮抗劑。
本發(fā)明者就IL-6對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的作用進(jìn)行了細(xì)致的研究，研究中發(fā)現(xiàn)IL-6本身對(duì)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的生長并無促進(jìn)作用，而對(duì)IL-6以外的另一個(gè)因子的研究表明雖然IL-6本身對(duì)滑膜細(xì)胞生長無促進(jìn)作用，但在IL-6與可溶性的IL-6R同時(shí)存在時(shí)可見到其強(qiáng)烈的促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖作用，而且該滑膜細(xì)胞的增殖作用可被加入抑制IL-6活性的拮抗劑如IL-6抗體或IL-6R抗體所抑制。本發(fā)明正是基于上述的發(fā)現(xiàn)而完成的。
換句話講，本發(fā)明涉及一種治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，該組合物包括以一種IL-6拮抗劑作為有效成分。更具體地講本發(fā)明涉及治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，該組合物的有效成分為IL-6拮抗劑并可抑制滑膜細(xì)胞的異常增殖。本發(fā)明還涉及其有效成分為IL-6拮抗劑的滑膜細(xì)胞生長抑制劑。
附圖的簡要說明

圖1所示的為在IL-6或SIL-6R單獨(dú)及IL-6與SIL-6R同時(shí)存在的條件下滑膜細(xì)胞攝入胸腺嘧啶3H的情況。
圖2所示為在IL-1β和SIL-6R同時(shí)存在的條件下IL-6抗體或IL-6R抗體對(duì)滑膜細(xì)胞攝入胸腺嘧啶3H的影響。
圖3所示為在IL-6及IL-6R同時(shí)存在的情況下IL-6抗體或IL-6R抗體對(duì)滑膜細(xì)胞攝入胸腺嘧啶3H的影響。
圖4所示為IL-6R抗體對(duì)小鼠膠原所致關(guān)節(jié)炎模型發(fā)生的抑制作用。
圖5所示為關(guān)節(jié)炎小鼠血清中抗膠原抗體的水平。
圖6所示為一膠原所致關(guān)節(jié)炎小鼠后爪關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)檢查的照片。(a)為服用IL-6受體抗體組小鼠的照片，(b)為服用對(duì)照抗體組小鼠的照片。在服用IL-6受體抗體組中，肉芽組織對(duì)軟骨及骨的浸潤(慢性增殖性滑膜炎)受到明顯的抑制。
本發(fā)明的詳細(xì)說明 根據(jù)本發(fā)明，治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物是當(dāng)將治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物給病人服用后，可抑制關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜細(xì)胞的生長，并且對(duì)癥狀有緩解及治療作用的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，所使用的IL-6拮抗劑可為任何一種物質(zhì)，只要其能阻斷IL-6的信號(hào)傳導(dǎo)并抑制IL-6的生物學(xué)活性。IL-6拮抗劑包括IL-6抗體，IL-6R抗體，gp 130抗體，修飾過的IL-6，反義IL-6R及IL-6或IL-6R的部分肽類。
根據(jù)本發(fā)明，用作拮抗劑的抗體，如IL-6抗體，IL-6R抗體或gp 130抗體可以是任何一種衍生物或類型(單克隆，多克隆)，但是以由哺乳類動(dòng)物所制得的單克隆抗體為最佳。這些抗體可與IL-6，IL-6R或gp 130結(jié)合從而抑制IL-6與IL-6R或IL-6R與gp 130之間的結(jié)合，并阻斷IL-6的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制IL-6的生物學(xué)活性。
對(duì)于產(chǎn)生單克隆抗體細(xì)胞的動(dòng)物種類并無特殊的限制，只要是哺乳類動(dòng)物，人類抗體或者人類以外其它哺乳類動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體都可以使用。對(duì)于除了人類以外的哺乳類動(dòng)物所產(chǎn)生的單克隆抗體最好是用家兔或鼠來制備，因?yàn)樯鲜龅膯慰寺】贵w容易制備。對(duì)于鼠類沒有特殊的限制，但最好是小鼠，大鼠及豚鼠。
IL-6抗體的實(shí)例包括有MH 166(Matsuda et al.，Eur.J.Immunol.18951-956，1988)及SK2抗體(Sato et al.，Journal for the21ST General Meeting of the Japan Immunology Association，21116，1991)。IL-6R抗體的實(shí)例有PM-1抗體(Hirata et al.，J.Immunol.1432900-2906，1989)，AUK12-20抗體，AUK 64-7抗體及AUK146-15抗體(Intl.Unexamined Patent Application No.WO 92-19759)。gp 130抗體的實(shí)例有AM64抗體(Japanese UnexaminedPatent Publication No.3-219894)。
在上述抗體中，以PM-1抗體為最佳。
單克隆抗體可通過已知技術(shù)的方法來制備。即按常規(guī)免疫方法以IL-6，IL-6R或gp 130作為免疫的致敏抗原，然后將所得的免疫細(xì)胞用常規(guī)的細(xì)胞融合方法與已知的父輩細(xì)胞融合，并通過常規(guī)的篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞用來制備抗體。
更具體地講，可用下述方法制備單克隆抗體。例如，如果致敏抗原為人IL-6，可使用由Hirano等人Nature 32473，1986，披露的人類IL-6基因序列來得到抗體。將人類IL-6基因序列插入到一個(gè)可以公開表達(dá)的載體系統(tǒng)內(nèi)，并且用其轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，之后從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清液純化所需的IL-6蛋白質(zhì)，然后用純化的IL-6蛋白質(zhì)作為致敏抗原。
有關(guān)人類IL-6R，也可通過上述的人類IL-6的同樣方法得到IL-6R蛋白質(zhì)，即使用歐洲專利申請(qǐng)?zhí)枮镋P 325474所介紹的基因序列來制備。有兩種類型的IL-6R，一種在細(xì)胞膜上表達(dá)，而另一種為可溶形式(SIL-6R)，其與細(xì)胞膜分離。SIL-6R主要是由結(jié)合在細(xì)胞膜上的IL-6R的細(xì)胞外域組成，它與結(jié)合在細(xì)胞膜上的IL-6R不同在于其沒有跨膜域，或跨膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)域。
有關(guān)人類gp 130，可通過上述的制備人類IL-6同樣的方法得到gp 130蛋白質(zhì)，即使用歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 411946所介紹的基團(tuán)序列來制備。
以致敏抗原免疫的哺乳類動(dòng)物并無特殊的限制，但是在選擇時(shí)最好考慮到這些細(xì)胞與用來融合的母細(xì)胞兼容性，通常使用小鼠，大鼠，豚鼠及家兔。
以致敏抗原免疫動(dòng)物可采用發(fā)表的已知方法來完成。例如，常規(guī)的方法包括經(jīng)腹腔或皮下給哺乳類動(dòng)物注射致敏抗原。具體地講，最好用等量的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)或生理鹽水稀釋并混懸致敏抗原，并且如需要與一定量的常規(guī)佐劑如弗氏完全佐劑一起使用，然后每4-21天給哺乳類動(dòng)物注射幾次。在致敏抗原免疫時(shí)也可使用適當(dāng)?shù)妮d體。
經(jīng)上述免疫后，確定血清中所要的抗體升高濃度，然后取出哺乳類動(dòng)物的兔疫細(xì)胞，最好為脾細(xì)胞做細(xì)胞融合。
用于與上述免疫細(xì)胞融合的母細(xì)胞可以是哺乳類動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞，可以選用已知的若干種細(xì)胞株，包括有P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunology 1231548，1978)，P3-U1(Current Topics inMicrobiology and Immunology 811-7，1978)，NS-1(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，MPC-11(Cell，8405-415，1976)，SP2/o(Nature，276269-270，1978)，Of(J.ImmunolMeth.351-21，1980)，S194(J.Exp.Med.148313-323，1978)，R210(Nature，277131-133，1979)?？刹捎靡阎姆椒▽⒚庖呒?xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，例如采用Milstein等人的方法(Milstein et al.，Methods Enzymol.733-46，1981)。
更具體地講，上述的細(xì)胞融合可采用加有細(xì)胞融合促進(jìn)劑的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)液來進(jìn)行。融合促進(jìn)劑可以是如聚乙二醇(PEG)或Sendai病毒(HVJ)，如需要加強(qiáng)融合作用也可加入如二甲基亞砜以提高融合效率。
免疫細(xì)胞與骨髓細(xì)胞之間的比例最好是免疫細(xì)胞的數(shù)量為骨髓瘤細(xì)胞的1-10倍。用于細(xì)胞融合的培養(yǎng)介質(zhì)可以是如RPMI 1640培養(yǎng)介質(zhì)或MEM培養(yǎng)介質(zhì)，這些培養(yǎng)介質(zhì)都適合骨髓瘤細(xì)胞的生長，也可使用其它常用的培養(yǎng)介質(zhì)，也可在培養(yǎng)介質(zhì)中補(bǔ)充血清溶液如小牛血清(FCS)。
細(xì)胞融合是以下述的方法來進(jìn)行的，即在上述的培養(yǎng)介質(zhì)中加入預(yù)先熱至37℃的PEG溶液，然后將一定數(shù)量的免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞充分混勻。如用平均分子量約1000至6000的PEG加入到培養(yǎng)介質(zhì)中，通常濃度為30到60％(w/v)，然后將細(xì)胞混合以形成所需要的融合細(xì)胞(雜交瘤)。下一步驟是通過重復(fù)地逐漸加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)介質(zhì)并離心以去除上清液，通過這一步驟去除細(xì)胞融合劑等，這些制劑對(duì)雜交瘤的生長不利。
通過一正常的選擇培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)雜交瘤以選出適當(dāng)?shù)碾s交瘤細(xì)胞，選擇培養(yǎng)介質(zhì)如HAT培養(yǎng)介質(zhì)(含有次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶)。將雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)一定的時(shí)間，通常為幾天到幾周，以使雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡。下一步是對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行有限的稀釋，使得產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞易于進(jìn)行標(biāo)記并單克隆。
通過上述方法制備出的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以在普通的培養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)傳代培養(yǎng)，也可將其置于液氮內(nèi)長期保存。
為了得到雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體，可以按照常規(guī)的方法培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，然后回收培養(yǎng)上清液，或者也可采用另一種方法即將雜交瘤細(xì)胞注入一適當(dāng)哺乳類動(dòng)物內(nèi)，讓其生長，然后再回收腹水。前者用來得到高純度的抗體，后者則用來制備大量的抗體。
采用上述方法所得的單克隆抗體然后可以通過常規(guī)的純化方法加以純化。這些方法包括有如鹽折，凝膠過濾，親和層析等。
通過上述方法制備的單克隆抗體可以采用通常的免疫方法如放射免疫分析(RIA)，酶連免疫分析(EIA，ELISA)，熒光抗體技術(shù)(免疫熒光分析)等來檢測其高度的敏感性及高純度的抗原識(shí)別能力。
本發(fā)明中使用的單克隆抗體并不局限于雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體，也有經(jīng)過人工修飾后的單克隆抗體，如為了降低單克隆抗體抗人的異種抗原性，而對(duì)單克隆抗體進(jìn)行人工修飾。例如所使用的嵌合抗體，它的可變區(qū)是由除人類以外的哺乳類動(dòng)物如小鼠的可變區(qū)組成，而其恒定區(qū)則為人類抗體，這種嵌合抗體可通過一種已知的產(chǎn)生嵌合抗體的方法來制備，具體地講是采用一種基團(tuán)重組技術(shù)。
依照本發(fā)明也可使用重構(gòu)人類抗體。這些抗體可通過使用小鼠或非人類哺乳類動(dòng)物的互補(bǔ)決定簇區(qū)域替換人類抗體的互補(bǔ)決定簇區(qū)域來制備，而所用的技術(shù)為已知的常規(guī)基因重組方法。依據(jù)本發(fā)明，可采用已知的一種方法得到有用的重構(gòu)人類抗體。較好的這種重構(gòu)人類抗體為hPM-1(見Intl.Unexamined Parent Aplication No.WO 92-19759)。
需要時(shí)可改換抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)區(qū)域(FR)的氮基酸，這樣重構(gòu)人類抗體互補(bǔ)決定簇區(qū)域可形成一個(gè)適當(dāng)?shù)目贵w結(jié)合位點(diǎn)(Sato et al.，Cancer Res.53851-856，1993)。另外，為了達(dá)到上述目的也可構(gòu)建用于結(jié)合抗原的抗體片段的基因密碼，以抑制IL-6的活性，例如抗體的Fab或Fv片段，或者單鏈Fv(scFv)，其中Fv的L和H鏈可通過一個(gè)適當(dāng)?shù)倪B結(jié)物連結(jié)起來，并使其在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)表達(dá)(見例如，Bird etal.，TIBTECH，9132-137，1991；Huston et al.，Proc.Natl.Sci.USA，855879-5883，1988)。
依照本發(fā)明，可使用已有報(bào)道過的修飾IL-6，見Brakenhoff et al.J.Biol.chem.26986-93，1994或Savino et al.，EMBO J.131357-1367，1994。
可通過對(duì)IL-6氨基酸序列引入突變，如替換，去除或插入氨基酸，使所用的修飾過的IL-6保持有與IL-6R結(jié)合的活性而又去除了IL-6信號(hào)傳遞的功能。只要具備上述的特性，可通過任何一種動(dòng)物種類制備IL-6，但從抗原性方面考慮，最好采用從人類細(xì)胞制備出的IL-6。
另外，IL-6氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)可通過已知的分子模型設(shè)計(jì)方法來預(yù)測，如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics.852-56，1990)，這樣可以估計(jì)突變化的氨基酸序列對(duì)整個(gè)結(jié)構(gòu)帶來的影響。在決定了要進(jìn)行適當(dāng)突變的氨基酸后，可使用一含有編碼人類IL-6基因的核苷酸序列的載體做為模板，并用常規(guī)的PCR方法(多聚酶鏈反應(yīng))對(duì)其進(jìn)行突變，以得到修飾的IL-6基因編碼。如需要可將該模板插入到一個(gè)合適的表達(dá)載體內(nèi)，并在大腸桿菌或哺乳類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，然后使用任何一種培養(yǎng)介質(zhì)的上清，以常規(guī)的方法經(jīng)過分離及純化后，估價(jià)其與IL-6R結(jié)合的活性及中和IL-6信號(hào)傳遞的活性。
本發(fā)明使用的IL-6防肽或IL-6R部分肽只要可分別與IL-6R或IL-6結(jié)合，并無IL-6信號(hào)傳導(dǎo)活性，就可以為任何序列。在U.S.Patent Pubication No.US 5210075中記載了IL-6部分肽及IL-6R部分肽。在Japanese Patent Publication No.5-300338中記載了IL-6反義寡核苷酸。
由于IL-6與慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)，所以如果藥物組合物能阻斷IL-6所致的IL-6信號(hào)傳導(dǎo)并抑制滑膜細(xì)胞的異常生長，依照本發(fā)明，其有效成分為IL-6拮抗劑的該藥物組合物可治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。例1證實(shí)了在體外對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞生長的抑制作用。在例2中，給用二型膠原免疫的小鼠關(guān)節(jié)炎模型服用IL-6受體抗體，有關(guān)結(jié)果表明(1)以一關(guān)節(jié)炎的指標(biāo)為基礎(chǔ)來判定對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有抑制作用(圖4)，(2)抑制了在膠原免疫的小鼠血液中抗二型膠原抗體的產(chǎn)生(圖5)，(3)檢查服用IL-6R抗體的小鼠關(guān)節(jié)炎模型的后爪關(guān)節(jié)，表明對(duì)肉芽組織對(duì)軟骨及骨的浸潤有抑制作用(慢性增殖性滑膜炎)(圖6)。
在上述的(1)和(2)中，結(jié)果證實(shí)IL-6受體抗體對(duì)關(guān)節(jié)炎有抑制作用，尤其在小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病的起始階段，該抑制作用更明顯。(3)的結(jié)果證明對(duì)肉芽組織對(duì)軟骨及骨的浸潤有抑制作用，由例1中所得的結(jié)果也支持這一點(diǎn)(體外對(duì)滑膜細(xì)胞生長的抑制)。
(1)及(2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有很好的初始階段治療效果。
本發(fā)明用于治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物最好經(jīng)非胃腸途徑給藥，例如經(jīng)靜脈，肌肉，腹腔或皮下注射給藥，可全身也可局部給藥。該組合物也可以醫(yī)用制劑試劑盒的形式與至少一種醫(yī)用載體或稀釋劑一起給藥。
本發(fā)明用于治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物在給人服用時(shí)，其劑量可依據(jù)病理情況，病人的年齡及給藥方式有所不同，并依照上述的情況選擇不同的劑量。例如在1到1000mg/病人這樣一個(gè)范圍內(nèi)，有4個(gè)不同的最大劑量可以選擇。當(dāng)然，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的本發(fā)明藥物組合物并不局限于這些藥物劑量。
本發(fā)明用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物可按照常規(guī)的方法配制而成。例如，注射制劑可通過溶劑如生理鹽水或一種緩沖鹽溶液溶解提純的IL-6拮抗劑，然后再加入吸附抑制劑如吐溫80，凝膠或人血清白蛋白(HSA)等配制而成，該混合物在溶液重組使用前可以凍干保存。用于凍干保存的賦形劑可以為一種糖醇，如甘露糖醇，葡葡糖或者庶糖。
實(shí)例 本發(fā)明將通過下面的實(shí)例，文獻(xiàn)實(shí)例及實(shí)驗(yàn)實(shí)例做進(jìn)一步更詳細(xì)的說明，但應(yīng)知道本發(fā)明并不局限于這些實(shí)例。
參考實(shí)例1.人類可溶性IL-6受體的制備 可溶性IL-6R可通過PCR(多聚酶鏈反應(yīng))的方法使用含有碥碼人IL-6受體CDNA的質(zhì)粒pBSF2R，236制備而成(Yasukawa et al.，J.

108673-676，1990)，該質(zhì)?？梢罁?jù)Yamasaki等人提供的方法來得到(Science，241825-828，1988)。
上述的質(zhì)粒BSF2R.236可以使用限制性內(nèi)切酶SphI來消化以得到IL-6R的CDNA片段，然后將該片段插入到mp18中(AmershamCo.，)。通過采用一體外致突變系統(tǒng)(Amersham Co.，)以PCR方法以一設(shè)計(jì)好的合成的寡核苷酸ATATTCTCTAGAGAGATTCT對(duì)IL-6R cDNA引入一個(gè)終止密碼，從而導(dǎo)致IL-6R cDNA突變。上述實(shí)驗(yàn)步驟其結(jié)果是在氨基酸345的位置上引入一個(gè)終止密碼，這樣就可以得到可溶性IL-6R(SIL-6R)的cDNA編碼。
為了使S IL-6R cDNA在CHO細(xì)胞中表達(dá)，將上述經(jīng)HindIII-SalI內(nèi)切酶切下的SIL-6R cDNA插入到質(zhì)粒pECEdhfr中去(Clauser et al.，Cell，45721-735，1986)，該質(zhì)粒中有一編碼二氫葉酸還原酶(dhfr)的cDNA，該dhfr插入在限制性內(nèi)切酶PvaI的酶切位點(diǎn)上，這樣即得到了CHO細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒pECEdhfr 344。
通過使用磷酸鈣沉淀的方法(Chen et al.，Mol.Cell，Biol，72745-2751，1987)，使用10μg的質(zhì)粒pECEdhfr344轉(zhuǎn)染dhfr-CHO細(xì)胞系DXB-11(Urland et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220，1980)。
將轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在含有1mM谷氨酸，10％透射過的小牛血清(FCS)，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的不含核苷酸的αMEM選擇培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)3周。通過限制稀釋的方法篩選已轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，并得到一個(gè)單克隆的CHO細(xì)胞株。將CHO細(xì)胞克隆在濃度為20nM至200nM氨甲喋呤溶液中擴(kuò)增，以得到產(chǎn)生人類SIL-6R的CHO細(xì)胞系5E27。
使用含5％FCS的Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)介質(zhì)(IMDM，Gibco Co.的產(chǎn)品)，培養(yǎng)CHO細(xì)胞系5E27，回收培養(yǎng)液上清，并按照通常的ELISA方法(酶連免疫吸附分析法)測定培養(yǎng)液上清中的SIL-6R濃度。
參考實(shí)例2.人類IL-6抗體的制備 可以按照Matsuda等人的方法來制備人類IL-6抗體(Eur.J.Immunol.18951-956，1988)。
以10μg重組的IL-6(Hisano et al.，Immunol.Lett，1741，1988)與弗氏完全佐劑一起免疫BALB/C小鼠，每周進(jìn)行一次直到血清中可以檢測到抗IL-6抗體。
取出局部淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞，使用聚乙二醇使之與骨髓瘤細(xì)胞系P3U1融合。按照D等人的方法(Selective Methods in CellularImmunology，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，351，1980)使用HAT培養(yǎng)液選出雜交瘤，通過上述步驟建立起一個(gè)產(chǎn)生人類IL-6抗體的雜交瘤細(xì)胞系。產(chǎn)生人類IL-6抗體的雜交瘤可通過下面的方法進(jìn)行IL-6結(jié)合情況的分析。
具體地講，在4℃的溫度下，在0.1M的碳酸氫鹽緩沖溶液(pH9.6)100μl中用山羊抗小鼠Ig抗體(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc.的產(chǎn)品，Malvern，PA)涂覆一柔軟的聚乙烯96孔微板(DynatechLaboratories，Inc.的產(chǎn)品，Alexandria，VA)并且過夜。然后在室溫下用100μl含有1％牛血清白蛋白的PBS處理該板2小時(shí)。經(jīng)過PBS沖洗后，向每個(gè)孔中加入100μl的雜交瘤培養(yǎng)上清液，并在4℃的溫度下過夜孵育。
沖洗該板并向每個(gè)小孔內(nèi)加入125I標(biāo)記的重組IL-6直至2000cpm/0.5ng/孔，再經(jīng)沖洗后以伽馬計(jì)數(shù)器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測定每個(gè)孔的放射活性。在216個(gè)雜交瘤克隆中，有32個(gè)雜交瘤克隆經(jīng)過IL-6結(jié)合分析測定為陽性。從這些克隆中最后得到穩(wěn)定的克隆MH166.BSF2。由該雜交瘤產(chǎn)生的IL-6抗體MH166為IgG1K亞型。
然后采用依賴IL-6生長的小鼠雜交瘤細(xì)胞系MH60.BSF2(Matsudaet al.，Eur.J.Immunol.18951-956，1988)，通過對(duì)該雜交瘤生長的影響來測定MH 166抗體的中和活性。將數(shù)量為1×104/200μl/孔的MH60.BSF2細(xì)胞懸浮，然再向孔內(nèi)加入含MH 166抗體的樣品，培養(yǎng)48小時(shí)后再加入15.1Ci/mmol的3H胸腺嘧啶(New England Nuclear，Boston，MA)，之后再繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。
將細(xì)胞置玻璃濾紙上并用自動(dòng)收集器處理(Labo Mash ScienceCo.，Tokyo，Japan)。使用家兔的抗IL-6抗體做為對(duì)照。結(jié)果顯示，MH 166抗體對(duì)MH60.BSF2細(xì)胞攝取3H胸腺嘧啶的抑制呈劑量-依賴方式。這證明MH166抗體有中和IL-6的活性。
參考實(shí)例3.人類IL-6受體抗體的制備 按照其說明，通過Hirata等人方法(J.Immunol.，1432900-2906，1989)構(gòu)建的抗IL-6R抗體與用CNBr激活的Sepharose 4B結(jié)合(Pharmacia Fine Chemicals的產(chǎn)品，Piscataway，NJ)，結(jié)合的復(fù)合物用來純化IL-6R。(Yamasaki et al.，Science，241825-828，1988)。
以含有1％毛地黃皂苷(Wako Chemicals的產(chǎn)品)，10mM三乙醇胺(pH 7.8)及0.15M NaCl的1mM p-對(duì)氨基苯基甲烷磺酰氟鹽酸鹽(Wako Chemicals的產(chǎn)品)(毛地黃皂苷緩沖液)溶解人類骨髓瘤細(xì)胞系U266，并與結(jié)合在Sepharose 4B株上的MT18抗體混合。用毛地黃皂苷緩沖液沖洗珠子6次，這樣即得到用來免疫的部分純化的IL-6R。
以從3×109U 266細(xì)胞得到的部分純化的IL-6R免疫BALB/C小鼠，每10天4次，然后采用常規(guī)的方法制備雜交瘤，使用下面的方法測定陽性生長孔內(nèi)雜交瘤培養(yǎng)液上清對(duì)IL-6結(jié)合的活性。在用35S蛋氨酸(2.5mCi)標(biāo)記5×107U 266細(xì)胞后，以上述的毛地黃皂苷緩沖液溶解這些細(xì)胞。將溶解的U 266細(xì)胞與結(jié)合在瓊脂糖凝膠4B珠上的0.04ml MT18抗體混合，之后用毛地黃皂苷緩沖液沖洗6次，用0.25ml的毛地黃皂苷緩沖液(pH 3.4)沖掉35S蛋氨酸標(biāo)記的IL-6R，并用0.025ml的1MTris(pH 7.4)中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)液上清與0.01ml的蛋白G瓊脂糖凝膠混合(Pharmacia的產(chǎn)品)。沖洗后，將瓊脂糖凝膠與預(yù)先制備的35S標(biāo)記的IL-6R溶液培養(yǎng)。使用SDS-PAGE的方法測定免疫沉淀物，并檢測雜交瘤培養(yǎng)上清液與IL-6R的反應(yīng)情況。通過上述方法，建立了反應(yīng)陽性的雜交瘤克隆PM-1。由雜交瘤PM-1產(chǎn)生的IL-6R抗體PM-1為Ig1K亞型。
使用人類骨髓瘤細(xì)胞系U 266來檢測由雜交瘤PM-1生產(chǎn)的抗體對(duì)IL-6與人類IL-6R結(jié)合的抑制活性。人類重組IL-6是采用大腸桿菌(Hirano et al.，Immunol.Lett.，1741，1988)和125I標(biāo)記的Bolton-Hunter試劑(New England Nudeer，Boston，MA)制備而成的(Taga et al.，J.Exp.Med.166967，1987)。
在過量100倍的非標(biāo)記的IL-6存在的條件下，將4×105U266的細(xì)胞與70％(v/v)的雜交瘤PM-1培養(yǎng)上清及14000cpm的125I標(biāo)記的，IL-6一起在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。將70μl樣本加入裝有300μlFCS的400μl微量聚乙烯離心管內(nèi)，離心后測定細(xì)胞的放射活性。
結(jié)果證明雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體可抑制IL-6與IL-6R的結(jié)合。
參考實(shí)例4.小鼠IL-6受體抗體的制備 在日本專利申請(qǐng)?zhí)?-134617中記載了抗小鼠IL-6受體的單克隆抗體的制備方法。
按照Saito等人的方法(J.Immunol.，147168-173，1993)，產(chǎn)生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細(xì)胞在含有10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過采用小鼠可溶性IL-6受體抗體RS12(see ibid.saito etal.，)及一個(gè)固定親和凝膠10(Biorad)的親和柱從培養(yǎng)液上清中純化小鼠可溶性IL-6受體。
將所得的50μg小鼠可溶性IL-6受體與弗氏完全佐劑混合，并經(jīng)腹腔注入Wistan大鼠(Nihon Charles River Co.)。2周后以弗氏不完全佐劑強(qiáng)化免疫。第45天處死大鼠，取大約2×108個(gè)脾細(xì)胞按常規(guī)的方法使用50％的PEG 1500(Berlinger Mannheim)與1×107個(gè)小鼠P3U1骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，之后使用HAT培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞。
在將雜交瘤培養(yǎng)上清加在表面涂有兔抗大鼠IgG抗體(cappelCo.)的免疫板上之后，小鼠可溶性的IL-6受體與之反應(yīng)，并以ELISA方法使用兔抗小鼠IL-6受體抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記的綿羊抗兔IgG，篩選雜交瘤產(chǎn)生的抗小鼠可溶性IL-6受體的抗體。還要進(jìn)行兩次更進(jìn)一步的篩選以確定產(chǎn)生抗體的雜交瘤克隆，從而最后得到單一的雜交瘤克隆。該克隆命名為MR16-1。
通過檢測MH60.BSF2細(xì)胞攝入3H胸腺嘧啶的情況可了解該雜交瘤產(chǎn)生的抗體拮抗小鼠IL-6信號(hào)傳導(dǎo)的中和活性(Matsuda et al.，J.Immunol，18，951-956，1988)，向96孔板內(nèi)加入MH 60.BSF2細(xì)胞，最后濃度為1×104個(gè)細(xì)胞/200μl/孔，然后加入小鼠IL-6(10pg/ml)及MR 16-1抗體或RS 12抗體，濃度為12.3-1000ng/ml，在37℃，CO2濃度為5％的條件下培養(yǎng)44小時(shí)，之后加入3H胸腺嘧啶(1μCi/孔)，4小時(shí)后測定其攝入情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MR 16-1抗體可抑制MH60.BSF2細(xì)胞攝取3H胸腺嘧啶。
實(shí)驗(yàn)1.建立慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞系 (1)滑膜細(xì)胞的制備 通過對(duì)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)手術(shù)取得滑膜組織。所得滑膜組織先以剪刀切碎，然后用5mg/ml的I型膠原酶(Sigma ChemicalCo.的產(chǎn)品)及溶于IMDM(Igcove修改過的Dulbecco培養(yǎng)液)的濃度為培養(yǎng)酶消化0.15mg/ml的牛胰腺DNA酶在溫度為37℃的條件下1小時(shí)進(jìn)行酶解離，然后通過濾網(wǎng)過濾得到單一的細(xì)胞。然后將所得的細(xì)胞使用含5％FCS的IMDM在培養(yǎng)瓶內(nèi)過夜培養(yǎng)。之后通過去除非粘附細(xì)胞得到滑膜細(xì)胞。將滑膜細(xì)胞傳代培養(yǎng)3至6次后使用這些細(xì)胞進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。
(2)由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6 將上述所得的滑膜細(xì)胞混懸于含有5％FCS(HycloneLaboratories Inc.的產(chǎn)品)，10U/ml的青霉素G及100μg/ml的鏈霉素IMDM培養(yǎng)液內(nèi)，并以3×103細(xì)胞/孔的數(shù)量加入到96孔微滴板上(Falcon Co.的產(chǎn)品)并培養(yǎng)，另外還向小孔內(nèi)加入人類白介素-1β(IL-1β)，人類腫瘤壞死因子α(TNFα)，人類血小板衍化生長因子(PDGF)AB及人類堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，濃度分別為0.01或0.1，0.1或1，1或10及1或10ng/ml，在37℃的條件下培養(yǎng)72小時(shí)后收集培養(yǎng)液上清。
將100μl抗人IL-6抗體MH 166(1μg/ml)加到96孔ELISA板上(免疫板Nunc Co.的產(chǎn)品)。在4℃的條件下孵育24小時(shí)。隨后用含有0.05％吐溫20的PBS沖洗每個(gè)孔，并用含有1％BSA的PBS在4℃的條件下過夜封閉。用含有1％BSA的PBS稀釋前面得到的培養(yǎng)液上清，并將其加到每個(gè)孔內(nèi)，然后在室溫下孵育2小時(shí)。用含有0.05％吐溫20的PBS沖洗后，再加入2.5μg/ml的經(jīng)100μl蛋白A柱(Pharmacia的產(chǎn)品)純化過的兔多克隆抗人IL-6抗體。
室溫下孵育2小時(shí)，在培養(yǎng)液上清中與IL-6結(jié)合的兔多克隆抗IL-6抗體與堿性磷酸酶結(jié)合的抗兔IgG抗體反應(yīng)(Tago Co.的產(chǎn)品)。然后按照附帶的說明加入1mg/ml Sigma 104堿性磷酸酶底物(Sigma Co.的產(chǎn)品)并在405～600nm的范圍內(nèi)用MPR A4微板讀數(shù)器(Tosoh Co.的產(chǎn)品)測量吸光度。
每次測試都制做重組IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以將吸光度OD值轉(zhuǎn)化成人IL-6的濃度。其結(jié)果見表1。
表1 滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6增高 注用IL-1β，TNFα，PDGF-AB或bFGF將滑膜細(xì)胞培養(yǎng)3天。培養(yǎng)之后，采用ELISA方法測定上清的IL-6濃度。
結(jié)果證明IL-1β可強(qiáng)烈的增加滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。
實(shí)施例1 (1)實(shí)驗(yàn)1中所得的滑膜細(xì)胞(3×103/孔)混懸于含5％FCS(Hyclone Laboratories，Inc.的產(chǎn)品)，10U/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素的

IMDM培養(yǎng)液中，然后將其加入96孔微滴板的孔內(nèi)(#3072，F(xiàn)alcon Co.的產(chǎn)品)，在各種濃度的IL-6或SIL-6單獨(dú)存在的情況下，或IL-6與SIL-6R同時(shí)存在的情況下培養(yǎng)5天。培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)，向每個(gè)孔內(nèi)加入濃度為1μCi/孔3H胸腺嘧啶(Amersham Iuternational plc的產(chǎn)品)，培養(yǎng)結(jié)束后，以閃爍計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞的放射活性。結(jié)果見圖1所示。
其結(jié)果單獨(dú)與IL-6或SIL-6R培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)3H胸腺嘧啶的攝取很少，并且沒有觀察到滑膜細(xì)胞的生長。相反在至少濃度為10ng/ml的IL-6及100ng/ml的SIL-R存在的情況下，與對(duì)照組比較可觀察到有明顯的3H胸腺嘧啶攝取。這樣，實(shí)際上在IL-6單獨(dú)存在情況下沒有刺激滑膜細(xì)胞生長的作用，而在IL-6與SIL-6R同時(shí)存在的情況下可見到其對(duì)滑膜細(xì)胞強(qiáng)烈的刺激生長作用。
(2)在產(chǎn)生IL-6(0.1mg/ml)，100ng/mlS IL-6R及25μg/mlIL-6抗體或25μg/ml IL-6R抗體的足量IL-β存在條件下培養(yǎng)滑膜細(xì)胞(3×103/孔)。培養(yǎng)72小時(shí)后向每個(gè)孔內(nèi)加入濃度為1μCi/孔的3H胸腺嘧啶，培養(yǎng)結(jié)束后，采用閃爍計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞的放射活性。結(jié)果見圖2。加入IL-6抗體或IL-6R抗體可完全抑制由SIL-6R所引起的滑膜細(xì)胞生長。
(3)在100ng/ml IL-6(Genzyme Co.產(chǎn)品)，100ng/mlS IL-6R及25μg/ml IL-6抗體或IL-6R抗體(皆由上述參考實(shí)例得到)存在的條件下培養(yǎng)滑膜細(xì)胞(3×103/孔)。培養(yǎng)72小時(shí)后，將濃度為1μCi/孔3H胸腺嘧啶加到每個(gè)孔內(nèi)，培養(yǎng)結(jié)束后，用閃爍計(jì)數(shù)儀測量細(xì)胞的放射活性。其結(jié)果可見圖3。加入IL-6抗體或IL-6R抗體可完全抑制由SIL-6R所致的滑膜細(xì)胞生長。
實(shí)施例2 用小鼠關(guān)節(jié)炎模型來研究IL-6受體抗體對(duì)關(guān)節(jié)炎發(fā)生的抑制作用。
通過將溶解于0.1N，乙酸水溶液的牛II型膠原溶液(CollagenTechnology Group)(4mg/ml)和完全佐劑H37Ra(DIFCO)等量混合來制備佐劑。給8至9周齡的雌性DBA/1J小鼠(Charles River Japan)尾的根部皮下注射100μl的佐劑。20天后在小鼠背部皮下再注射100μl的佐劑以引發(fā)關(guān)節(jié)炎。
在第1次膠原致敏后按每只小鼠2mg的劑量靜脈注射小鼠IL-6受體抗體MR 16-1，此后的7周里每周再給小鼠皮下注射0.5mg(n＝5)的抗體。對(duì)于對(duì)照組使用同型的抗DNP抗體KH-5(Chugai Seiyaku)(n＝5). 以關(guān)節(jié)炎指數(shù)來評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。以每個(gè)肢體4分，每個(gè)個(gè)體共16分來進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)如下。
0.5在關(guān)節(jié)的一側(cè)可見紅斑。
1在關(guān)節(jié)兩側(cè)觀察到紅斑或充血但大腫脹隆起。
2觀察到中等程序腫脹隆起。
3.足背部有嚴(yán)重的腫脹隆起，但未及整個(gè)足趾。
4足背及足趾嚴(yán)重的腫脹隆起。
其結(jié)果見圖4。
與對(duì)照抗體給藥組比較，IL-6受體抗體給藥組可觀察到其對(duì)早期階段關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有明顯的抑制作用。
另一方面與對(duì)照抗體給藥組比較，在IL-6受體抗體給藥組通過測定早期階段關(guān)節(jié)炎小鼠血中的抗II型膠原抗體的滴度發(fā)現(xiàn)其抗體顯著減少(圖5)。
在以膠原免疫后第35天處死小鼠，其后腿以20％的福爾馬林固定。然后標(biāo)本以EDTA溶液(pH 7.6)脫礦質(zhì)并用酒精脫水。隨后用石蠟包埋標(biāo)本并切成2μm厚的切片。用蘇木精及伊紅對(duì)切片進(jìn)行染色并放大125倍在鏡下觀察(圖6)。其結(jié)果，與對(duì)照抗體給藥組比較，在IL-6受體抗體給藥組其對(duì)肉芽組織對(duì)軟骨及骨的浸潤，即慢性增殖性滑膜炎有抑制作用。
IL-6為一細(xì)胞因子，它可使B細(xì)胞分化成產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。在IL-6受體存在的情況下，IL-6也可促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖。在小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型的實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照抗體給藥組比較，在膠原致敏后的第21天及35天由于抗IL-6受體抗體可顯著地抑制抗II型膠原抗體的滴度，所以認(rèn)為抗IL-6受體抗體對(duì)抗體產(chǎn)生的抑制也是其對(duì)關(guān)節(jié)炎有抑制作用的一個(gè)原因。另外，在膠原致敏后的第49天，雖然此時(shí)未見到對(duì)抗體產(chǎn)生的抑制作用，但在這期間仍可觀察到其對(duì)關(guān)節(jié)炎發(fā)生有一定的抑制作用，對(duì)跗骨周圍組織進(jìn)行HE染色可觀察到與對(duì)照組比較，在抗IL-6受體抗體給藥組其對(duì)肉芽組織對(duì)軟骨及骨的浸潤有抑制作用，基于上述事實(shí)說明抑制滑膜細(xì)胞生長也是其抑制關(guān)節(jié)炎作用的一個(gè)原因。
工業(yè)方面的應(yīng)用性 來自慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑膜細(xì)胞在IL-6及S IL-6R同時(shí)存在的情況下可以促進(jìn)其增長?；诼灶愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜液體中含有大量的IL-6及S IL-6R引起滑膜細(xì)胞增殖這樣一個(gè)事實(shí)，現(xiàn)認(rèn)為IL-6引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)與慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的異常增殖有關(guān)。
依照本發(fā)明，現(xiàn)已證實(shí)有效成分為IL-6拮抗劑的藥物組合物可治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其可在IL-6及S IL-6R存在的情況下抑制慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞的生長，所以對(duì)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有治療作用。總之，本發(fā)明所述的IL-6拮抗劑對(duì)有滑膜細(xì)胞異常增殖的慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種有益的治療制劑。
本說明書還包括以下內(nèi)容 1.治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其含有作為有效成分的白介素-6拮抗劑。
2.項(xiàng)目1的治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特點(diǎn)在于所述白介素-6拮抗劑可抑制慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的異常增殖。
3.項(xiàng)目1的治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于上述的白介素-6拮抗劑為一種抗白介素-6的抗體。
4.項(xiàng)目2的治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于上述的白介素-6為人類白介素-6。
5.項(xiàng)目1的治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于上述的白介素-6拮抗劑為抗白介素-6受體的抗體。
6.項(xiàng)目2的治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于所述的白介素-6受體為人類白介素-6受體。
7.一種滑膜細(xì)胞生長抑制劑，其含有作為有效成分的一種白介素-6拮抗劑。
8.項(xiàng)目7的滑膜細(xì)胞生長抑制劑，其特征在于上述的白介素-6拮抗劑為白介素-6抗體或白介素-6受體的抗體。
權(quán)利要求
1.白介素-6拮抗劑作為有效成分在制備治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物中的用途，其特征在于所述白介素-6結(jié)抗劑抑制慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的異常增殖。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述白介素-6結(jié)抗劑為抗白介素-6的抗體。
3.權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述白介素-6是人白介素-6。
4.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述白介素-6結(jié)抗劑為抗白介素-6受體的抗體。
5.權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的抗體。
6.權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述抗人白介素-6受體的抗體是PM-1抗體。
7.權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述PM-1抗體是人源化的PM-1抗體。
8.白介素-6結(jié)抗劑作為有效成分在制備抑制滑膜細(xì)胞生長的藥物組合物中的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述白介素-6結(jié)抗劑為抗白介素-6的抗體。
10.權(quán)利要求9的用途，其特征在于所述白介素-6是人白介素-6。
11.權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述白介素-6結(jié)抗劑為抗白介素-6受體的抗體。
12.權(quán)利要求11的用途，其特征在于所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的抗體。
13.權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述抗人白介素-6受體的抗體是PM-1抗體。
14.權(quán)利要求13的用途，其特征在于所述PM-1抗體是人源化的PM-1抗體。
全文摘要
基于抑制滑膜細(xì)胞生長，本發(fā)明提供了一種治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞生長抑制劑或藥物組合物。治療慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物或滑膜細(xì)胞生長抑制劑含有作為有效成分的IL-6拮抗劑，如IL-6抗體或IL-6R抗體。
文檔編號(hào)C07K16/24GK101601861SQ20091013227
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期1995年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月7日
發(fā)明者岸本忠三, 三原昌彥, 守屋陽一郎, 大杉義征 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社, 岸本忠三