專利名稱:重組人紅細(xì)胞生成素的分離純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法,具體涉及一種重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的分離純化工藝。
背景技術(shù):
1997年Miyake等人(Miyake.et al.,J.Bid,Chem,252,P5558(1997))從人尿中首次分離純化出人的紅細(xì)胞生成素(EPO),從而證實(shí)了它在人體內(nèi)存在。1984年發(fā)現(xiàn)了EPO是紅系祖細(xì)胞的分化、增殖、成熟的主要控制因子。1985年Jacobs等人(Jacobs et al.,Nature,313,p806(1985))首先從人的胚胎肝細(xì)胞中成功的分離了人EPO基因的cDNA,同年Lin等人(Lin et al.,Proc Natl Acad Sci USA,82,P7580(1985))將人EPO基因克隆并在CHO細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)。1986年Law等人(Law ML,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,83,P6920(1986))測(cè)定人EPO基因的核酸序列,位于第7對(duì)染色體長(zhǎng)臂中段的q11-q22區(qū),為單拷貝基因,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成,1986年Lai等人(Lai et al.,J Biol Chem,261,p3116(1986))發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了人EPO的結(jié)構(gòu)特征,它為編碼193個(gè)氨基酸,N端由27個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽在分泌過程中被切除,翻譯后修飾包括去除C端的第166位精氨酸,最終在體內(nèi)發(fā)揮生理作用的是由165個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。它有三個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)和一個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn),糖基化程度和種類與它的體內(nèi)活性密切相關(guān)。1989年美國(guó)AMGEN公司生產(chǎn)的rhEPO獲得FDA的批準(zhǔn),并在不同國(guó)家申請(qǐng)了不同專利保護(hù)(專利號(hào)US5,547,933,EUROPEAN0 178665A2和CN85 101181 A)。
rhEPO是采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆了人EPO-cDNA,并將其插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中,篩選出高效穩(wěn)定表達(dá)人EPO的工程細(xì)胞株。對(duì)其細(xì)胞培養(yǎng)收獲上清進(jìn)行EPO蛋白分離純化。人EPO是紅系祖細(xì)胞的分化、增殖、成熟的主要控制因子。rhEPO注射液是臨床上腎性貧血的特效治療藥物。也可治療非腎性貧血。rhEPO是目前可用于臨床治療的基因工程藥物中技術(shù)最成熟,臨床療效最確切,銷售額最多的一種產(chǎn)品。
目前中國(guó)國(guó)內(nèi)有多家EPO生產(chǎn)企業(yè),要想產(chǎn)品出口參與國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng),條件之一必須建立一種適合大規(guī)模生產(chǎn)和低成本的EPO重組蛋白的分離純化工藝。
目前有報(bào)道的工藝方法,大多在工藝中使用反相層析和有機(jī)溶劑,引起蛋白質(zhì)在層析過程中發(fā)生變性和要考慮排除有機(jī)溶劑在產(chǎn)品中的殘留,以致對(duì)人體的毒性作用。本發(fā)明一種重組紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)的分離純化工藝,其特征避免使用反相層析和有機(jī)溶劑。
發(fā)明內(nèi)容
為了滿足大規(guī)模生產(chǎn)EPO重組蛋白的需要,本發(fā)明的目的將提供一種低成本的重組人紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的將提供一種產(chǎn)品回收率高,工藝穩(wěn)定,容易放大的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的生產(chǎn)方法還可高效去除熱源,核酸和各種雜蛋白。
完成上述任務(wù)的生產(chǎn)工藝包括以下步驟1、Blue sepharose.F.F層析用PB緩沖液平衡Blue sepharose.F.F層析柱,用經(jīng)過微米膜過濾后細(xì)胞培養(yǎng)上清上樣,用PB緩沖液沖洗層析柱至基線,用20mM PB+0.75M NaCL緩沖液洗脫;2、金屬螯合親和柱層析用0.1M EDTA-Na2+1M NaCl平衡4.0C.V,用50%異丙醇+1%TFA平衡3.0C.V,
用0.1M NaAc.HAC+0.2M CuSO4.5H2O平衡3.0C.V,用20mM PB+0.5M NaCl平衡3.9C.V,用Blue-Sepharose.F.F層析柱收集的洗脫蛋白峰上樣用20mM PB+0.5M NaCl沖洗,收集穿透液;3、Sephadex G-25(Medium)柱層析(7.5×70cm)用注射用水沖洗3.0C.V,用20mMTris-HCl(PH7.0)緩沖液平衡層析柱3.0C.V,用金屬螯合親和層析柱收集的穿透液上樣,用20mMTris-HCl(PH7.0)緩沖液洗脫,收集洗脫蛋白峰;4.Source Q柱層析(2.6×10cm)用20mMTris-HCl緩沖液平衡4.0C.V,用Sephadex G-25柱層析收集的洗脫蛋白峰上樣,用50mM NaCl/20mMTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫雜蛋白,用150mM NaCl/20mMTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫目的蛋白峰,收集目的蛋白峰經(jīng)過0.22微米膜過濾。
以上工藝中第一步層析為藍(lán)膠填料,例如Blue Sepharose.Fast Flow和CM-AFFI-Blue Gel。第二步層析為金屬螯和親和填料,例如M.C 20和ChaletingSepharose.Fast Flow。第三步層析為脫鹽填料,例如Sephadex G-25(Medium),Sephadex G-25(Fine)。第四步層析為離子交換層析填料,例如Source Q,DEAESepharose,Resource Q,Poros D50,Q Sepharose XL和Q Sepharose Highperformance,Q sepharose Fast Flow和Q Sepharose Big Beads。
其中藍(lán)膠層析,其平衡緩沖液為20-50mM PB,Tris-HCL,硼砂-硼酸,咪唑鹽酸和巴比妥鹽酸緩沖液,pH范圍在6.8-9.0。洗脫液為上述相應(yīng)的流動(dòng)相中加0.25-1.25M NaCL梯度洗脫。
其中金屬螯和親和層析流動(dòng)相I為0.1-0.2M EDTA-Na2+0.75--1.25MNaCL。流動(dòng)相II為50%-70%異丙醇+1%-5%TFA。流動(dòng)相III為0.1-0.5M NaAc。HAC+0.1-0.3M CuSO4.5H2O。流動(dòng)相IV為20-50mM PB+0.5-1.0M NaCL。
其中Source Q離子交換層析流動(dòng)相I為20-50mM Tris-HCL,咪唑鹽酸,巴比妥鹽酸,硼砂-硼酸和磷酸緩沖液,pH范圍在6.8-9.0流動(dòng)相III為20-50mMTris-HCl緩沖液和40-50mM NaCL,流動(dòng)相IV為100-200mM NaCL和20-50mMTris-HCL。
本發(fā)明的分離純化工藝中不使用反相層析和有機(jī)溶劑,避免蛋白質(zhì)在層析過程中發(fā)生變性和要考慮排除有機(jī)溶劑在產(chǎn)品中的殘留,以致對(duì)人體的毒性作用。反相層析柱往往使用壽命短,價(jià)格高,增加了生產(chǎn)成本。本工藝采用BlueSepharose.Fast Flow金屬螯和親和層析,Sephadex G-25層析和Source Q層析順序組合純化工藝路線,可以大規(guī)模制備藥用級(jí)的rHuEPO蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.重組人紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)工程細(xì)胞株,經(jīng)10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)生長(zhǎng)后,轉(zhuǎn)為無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)培養(yǎng)。對(duì)其細(xì)胞培養(yǎng)收獲上清35L經(jīng)過0.65微米膜過濾,去除上清中的細(xì)胞碎片。用20mM PB緩沖液平衡的Blue-Sepharose.F.F層析柱(7.5×20cm)3.0柱體積(C.V),以30ml/min流速上樣后,用20mM PB緩沖液沖洗層析柱至基線,再用20mM PB+0.75M NaCL緩沖液洗脫,收集洗脫蛋白峰。
2.金屬螯合親和層析柱(5×15cm)用0.1M EDTA-Na2+1M NaCl平衡4.0C.V,用注射用水沖洗層析柱3.0C.V,50%異丙醇+1%TFA平衡3.0C.V,用注射用水沖洗3.0C.V,0.1M NaAc.HAC+0.2M CuSO4.5H2O平衡3.0C.V,注射用水沖洗3.0C.V,20mM PB+0.5M NaCl平衡3.0C.V后,直接用Blue-Sepharose.F.F層析柱收集的洗脫蛋白峰上樣,用20mM PB+0.5M NaCl沖洗,收集穿透液做下一步層析。
3.Sephadex G-25(Medium5×80cm)層析柱用注射用水沖洗3.0C.V,再用20mMTris-HCl(PH7.0)緩沖液平衡層析柱3.0C.V,將收集的金屬螯合親和層析柱的穿透液上樣,上完樣品后用20mMTris-HCl(PH7.0)緩沖液洗脫,收集洗脫蛋白峰。
4.Source Q層析柱(5×10cm)用20mMTris-HCl緩沖液平衡4.0C.V,將SephadexG-25(Medium)柱收集的洗脫蛋白峰上樣,上完樣品后采用20mMTris-HCl緩沖液沖洗3C.V,用50mM NaCl/20mMTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫雜蛋白,150mMNaCl/20mMTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫目的蛋白峰,收集目的蛋白峰經(jīng)過0.22微米膜過濾。
分離純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)分析,純度大于98%,等電聚焦電泳顯示pI3.3-4.3范圍。EPO體內(nèi)和體外生物比活性均大于14萬單位/mg,EPO唾液酸含量大于9.0、小牛血清殘留量小于0.01%、外源性DNA殘留量小于100pg/萬IU和CHO細(xì)胞蛋白殘留量小于0.10%。內(nèi)毒素試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果小于2.0/萬IU。N-末端氨基酸序列分析與天然EPO一致,所有檢測(cè)項(xiàng)目均符合≤中國(guó)生物制品規(guī)程2000版≥中重組人紅細(xì)胞生成素制造及檢定規(guī)程的規(guī)定。
與其他工藝相比,該工藝產(chǎn)品回收率高,工藝穩(wěn)定,容易放大生產(chǎn),生產(chǎn)成本低,適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種重組人紅細(xì)胞生成素的分離純化工藝,包括以下步驟Blue sepharose.F.F層析用PB緩沖液平衡Blue sepharose.F.F層析柱,用經(jīng)過微米膜過濾后細(xì)胞培養(yǎng)上清上樣,用PB緩沖液沖洗層析柱至基線,用20mM PB+0.75M NaCL緩沖液洗脫;金屬螯合親和柱層析用0.1M EDTA-Na2+1M NaCl平衡4.0C.V,用50%異丙醇+1%TFA平衡3.0C.V,用0.1M NaAc.HAC+0.2M CuSO4.5H2O平衡3.0C.V,用20mM PB+0.5M NaCl平衡3.0C.V,用Blue-Sepharose.F.F層析柱收集的洗脫蛋白峰上樣用20mM PB+0.5M NaCl沖洗,收集穿透液;Sephadex G-25(Medium)柱層析(7.5×70cm)用注射用水沖洗3.0C.V,用20mMTris-HCl(PH7.0)緩沖液平衡層析柱3.0C.V,用金屬螯合親和層析柱收集的穿透液上樣,用20mMTris-HCl(PH7.0)緩沖液洗脫,收集洗脫蛋白峰;Source Q柱層析(2.6×10cm)用20mMTris-HCl緩沖液平衡4.0C.V,用Sephadex G-25柱層析收集的洗脫蛋白峰上樣,用50mM NaCl/20mMTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫雜蛋白,用150mM NaCl/20mMTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫目的蛋白峰,收集目的蛋白峰經(jīng)過0.22微米膜過濾。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組人紅細(xì)胞生成素的分離純化工藝,其特征在于以上工藝中第一步層析為藍(lán)膠填料,第二步層析為金屬螯和親和填料,第三步層析為脫鹽填料,第四步層析為離子交換層析填料,其中藍(lán)膠層析,其平衡緩沖液為20-50m M PB,Tris-HCL,硼砂-硼酸,咪唑鹽酸和巴比妥鹽酸緩沖液,pH范圍在6.8-9.0,洗脫液為上述相應(yīng)的流動(dòng)相中加0.25-1.25M NaCL梯度洗脫,其中金屬螯和親和層析流動(dòng)相I為0.1-0.2M EDTA-Na2+0.75--1.25MNaCL,流動(dòng)相II為50%-70%異丙醇+1%-5%TFA,流動(dòng)相III為0.1-0.5M NaAc,HAC+0.1-0.3M CuSO4.5H2O,流動(dòng)相IV為20-50m M PB+0.5-1.0M NaCL,其中Source Q離子交換層析流動(dòng)相I為20-50m M Tris-HCL,咪唑鹽酸,巴比妥鹽酸,硼砂-硼酸和磷酸緩沖液,pH范圍在6.8-9.0流動(dòng)相III為20-50m MTris-HCl緩沖液和40-50m M NaCL,流動(dòng)相IV為100-200m M NaCL和20-50m MTris-HCL。
全文摘要
重組人紅細(xì)胞生成素的分離純化工藝,包括以下步驟1.Blue sepharose.F.F層析;2.金屬螯合親和柱層析;3.Sephadex G-25柱層析;4.Source Q柱層析,收集目的蛋白峰經(jīng)過0.22微米膜過濾。本發(fā)明是一種低成本的重組人紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)方法。本工藝中不使用反相層析和有機(jī)溶劑,避免蛋白質(zhì)在層析過程中發(fā)生變性和有機(jī)溶劑的殘留。本工藝采用Blue Sepharose.Fast Flow金屬螯和親和層析,Sephadex G-25層析和Source Q層析順序組合純化工藝路線,可以大規(guī)模制備藥用級(jí)的rHuEPO蛋白。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1526731SQ03158278
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者胡云龍, 張雙全 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)