專利名稱：重組非糖基化人促紅細胞生成素及其聚乙二醇修飾化產(chǎn)物的生產(chǎn)方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及非糖基化人促紅細胞生成素的高效表達與純化方法，以及非糖基化人促紅細胞生成素的聚乙二醇修飾化的方法。
背景技術(shù)：
人促紅細胞生成素(hEPO)是人調(diào)節(jié)紅細胞生成的主要調(diào)控因子。主要通過促進骨髓中紅系祖細胞的存活、增殖和分化，抑制凋亡以調(diào)控紅細胞的生成。臨床上主要用于增加紅血球的數(shù)目，用于慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、艾滋病患者貧血、再生障礙性貧血、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者貧血、骨髓增生異常綜合癥患者貧血、鐮刀型紅細胞性貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血、組織斷離、早產(chǎn)兒等多個方面。在基因重組技術(shù)誕生之前，EPO主要從貧血患者的尿和綿羊血中提取，得率非常低，且極不穩(wěn)定(ΕΡ0單體半衰期僅I個多小時)，理化和生物性質(zhì)難以測定，無法大規(guī)模應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)手段生產(chǎn)的重組人紅細胞生成素，可克服這一弊端。rhEPO已經(jīng)在真核表達系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細胞CHO系統(tǒng)中獲得表達，但生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低。在大腸桿菌中表達的促紅細胞生成素為非糖基化蛋白(rh-ngEPO)，常形成不可溶、無生物活性的包涵體， 即使復(fù)性在體內(nèi)也沒有活性。此外，缺乏特異性純化方法，也限制了 rhEPO的規(guī)?；苽?。SUMO (small ubi quit in-re lated modifier,小泛素相關(guān)修飾因子)融合蛋白表達系統(tǒng)是近年發(fā)展的一種新型蛋白表達系統(tǒng)，與其它蛋白表達系統(tǒng)相比，具有以下幾點優(yōu)勢: DSUMO不僅可以提高蛋白質(zhì)在宿主菌中的表達量，而且能夠大大增加蛋白的可溶性；2)準確無誤地切除融合標簽。由于融合標簽會影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，所以融合蛋白必須切除融合標簽，通常采用化學(xué)或酶學(xué)方法，如Xa因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多問題，產(chǎn)率低、蛋白沉淀、酶切條件復(fù)雜、蛋白酶昂貴等，此外還經(jīng)常產(chǎn)生非預(yù)期的N-端。和其他蛋白酶不同，SUMO酶識別SUMO標簽的三級結(jié)構(gòu)，因而能準確地切除，不會產(chǎn)生延伸的 N-端，而且酶切條件(pH、溫度和離子強度)很寬松。但SUMO表達系統(tǒng)是否能用于EPO的表達尚未見報道。聚乙二醇(PEG)修飾，或稱PEG化(PEGylation)，是二十世紀70年代后期逐漸發(fā)展起來的一項熱門技術(shù)，是目前對蛋白質(zhì)進行化學(xué)修飾最重要的技術(shù)之一，是用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效途徑。用PEG修飾蛋白質(zhì)和多肽藥物可大大增加蛋白質(zhì)和多肽藥物的抗蛋白水解酶的降解作用。對蛋白質(zhì)類藥物，由于PEG修飾后，其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期顯著增長，PEG修飾后，蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的藥效是增大的。但是，與PEG偶合后的蛋白質(zhì)和多肽，其空間構(gòu)象，空間位阻，靜電結(jié)合性，疏水性等理化性質(zhì)都會發(fā)生變化，與受體連接的親和力經(jīng)常因這些理化性質(zhì)的變化而降低，從而導(dǎo)致聚乙二醇修飾后蛋白質(zhì)和多肽藥物的體外藥效降低。由此可見，蛋白質(zhì)藥物在生物體內(nèi)易被蛋白酶降解，而經(jīng)過PEG修飾化的蛋白質(zhì)藥物可以延長其半衰期，但其體外藥效一般會降低。因此，如何延長rhEPO蛋白在血漿中的半衰期，同時提高rhEPO蛋白的藥物活性，需要系統(tǒng)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種人促紅細胞生成素的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種聚乙二醇修飾化人促紅細胞生成素的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
I、一種融合基因，其編碼SUM0-rh-ngEP0融合蛋白。優(yōu)選的，所述的融合基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。2、含有上述融合基因的表達載體。3、重組非糖基化人促紅細胞生成素(ngEPO)的生產(chǎn)方法，包括如下步驟
1)將權(quán)利要求3所述的表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌中，誘導(dǎo)表達SUM0-rh-ngEP0融合蛋白；
2)分離純化SUM0-rh-ngEP0蛋白，切除SUMO部分,純化rh-ngEPO蛋白。4、由3的方法所得到的重組rh-ngEPO蛋白。5、一種聚乙二醇修飾化非糖基化人促紅細胞生成素的制備方法，包括如下步驟
1)將4所述的rh-ngEPO蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)在3 5V反應(yīng)20 28 小時，加甘氨酸終止反應(yīng)；
2)分離純化得到聚乙二醇修飾的人促紅細胞生成素(PEG-rh-ngEP0)。優(yōu)選的,步驟I)是在pH 6.0,50 mmol/ L的磷酸鹽緩沖液中進行,所述rh-ngEPO 蛋白的濃度為4. 5^5. 5mg/mL。優(yōu)選的，所述rh-ngEPO蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛的摩爾比為擴11 :1。優(yōu)選的，所述單甲氧基聚乙二醇丙醛為20kDa單甲氧基聚乙二醇丙醛 (mPEG-ALD-20kDa)。以上所述的聚乙二醇修飾化非糖基化人促紅細胞生成素在制備促紅細胞生成類藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于
I)本發(fā)明將rh-ngEPO基因與小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)基因進行融合表達，并對誘導(dǎo)表達條件進行了優(yōu)化，實現(xiàn)rh-ngEPO蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)的可溶性高表達，所得目的蛋白占可溶性總蛋白的27. 8 ±4. 36wt%。2)本發(fā)明設(shè)計合成的SUM0-rh-ngEP0融合蛋白帶有His標簽,經(jīng)鎳離子親和層析和SUMO蛋白酶解去除SUMO蛋白和His標簽后，可以實現(xiàn)rh-ngEPO蛋白的大規(guī)模純化，所得的rh-ngEPO蛋白活性高。3)本發(fā)明將人促紅細胞生成素進行聚乙二醇修飾化，采用單甲氧基聚乙二醇丙醛 (mPEG-ALD)修飾劑，修飾條件溫和，交聯(lián)時未引進其它活性基團，對蛋白質(zhì)活性影響較小， 同時便于產(chǎn)物的純化和鑒定。通過該修飾方法所得到的聚乙二醇修飾化人促紅細胞生成素的半衰期明顯延長，且其促紅細胞增殖活性也得到顯著的提高。


圖I是rh-ngEPO PCR產(chǎn)物電泳圖2是SUM0-rh-ngEP0 PCR產(chǎn)物電泳圖；圖3是質(zhì)粒pET_3c ( + )電泳圖4是pET-SUMO-rh-ngEPO重組質(zhì)粒圖譜；
圖5是重組PET- SUM0-rh-ngEP0鑒定電泳圖(第一泳道是重組PET- SUMO-rh-ngEPO 的Nde I、BamH I雙酶切鑒定；第二泳道是菌落PCR鑒定)；
圖6是SUM0-rh-ngEP0的可溶性表達分析圖(M marker ；1 :未誘導(dǎo)的菌體總蛋白；2 誘導(dǎo)后的菌體總蛋白；3 :誘導(dǎo)后的菌體總蛋白上清；4 :誘導(dǎo)后的菌體總蛋白沉淀)；
圖7是O. 5mM/ ImM IPTG不同溫度誘導(dǎo)4h后，SUM0-rh-ngEP0蛋白表達情況分析圖； 圖8是O. 5mM/ ImM IPTG不同溫度誘導(dǎo)24h后，SUM0-rh_ngEP0蛋白表達情況分析圖； 圖9是SDS-PAGE電泳分析純化的SUMO-rh-ngEPO (I是菌體總蛋白；2是純化后的 SUM0-rh-ngEP0 蛋白)；
圖10是純化目的蛋白rh-ngEPO的電泳圖(M是maker ；1是純化后的SUMO-rh-ngEPO 蛋白；2是SUMO酶切后的SUMO-rh-ngEPO蛋白；3是純化后的SUMO-rh-ngEPO蛋白；4是純化后的目的蛋白rh-ngEPO)；
圖11是rh-ngEPO蛋白的反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測圖12是rh-ngEPO或PEG-rh-ngEPO蛋白在37°C的穩(wěn)定性檢測圖13是rh-ngEPO或PEG-rh_ngEP0蛋白體外活性檢測圖14是rh-ngEPO或PEG-rh_ngEP0蛋白在SD大鼠中半衰期檢測圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例I
人促紅細胞生成素(rh-ngEPO)的高效表達與純化 I、SUM0-rh-ngEP0基因的制備
從人胎肝細胞中用常規(guī)方法提取mRNA，采用RT-PCR方法擴增獲得EPO的cDNA(579bp); 然后分別以PET-3C-SUM0和EPO的cDNA為模板，設(shè)計引物分別擴增SUMO和EPO基因及中間15肽linker基因，膠回收后作為共同模板進行重組PCR擴增出SUM0-rh-ngEP0基因片段，并在上下游分別引入Nde I和BamH I酶切位點。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 膠回收和純化PCR產(chǎn)物SUM0-rh-ngEP0。膠回收步驟按OMEGA膠回收試劑盒說明書進行。I. I引物設(shè)計
根據(jù) SUMO 基因序列(Genebank no: NC_011677. I)及 rhEPO 基因序列(GenBank: NM_000799. 2)分別設(shè)計引物(見表I)。
權(quán)利要求
1.一種融合基因，其編碼SUM0-rh-ngEP0融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合基因，其具有SEQID NO. I所示的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求I或2所述融合基因的表達載體。
4.重組非糖基化人促紅細胞生成素(rh-ngEPO)的生產(chǎn)方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求3所述的表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌中，誘導(dǎo)表達SUM0-rh-ngEP0融合蛋白；2)分離純化SUM0-rh-ngEP0蛋白，切除SUMO部分,純化rh-ngEPO蛋白。
5.按照權(quán)利要求4的方法所得到的重組rh-ngEPO蛋白。
6.一種聚乙二醇修飾化促紅細胞生成素的制備方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求5所述的rh-ngEPO蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG_ALD)在T5°C 反應(yīng)2(Γ28小時，加甘氨酸終止反應(yīng)；2)分離純化得到聚乙二醇修飾的人促紅細胞生成素(PEG-rh-ngEPO)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟I)是在pH6.0,50 mmol/ L的磷酸鹽緩沖液中進行，所述rh-ngEPO蛋白的濃度為4. 5^5. 5mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述rh-ngEPO蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛的摩爾比為擴11 :1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述單甲氧基聚乙二醇丙醛為20kDa 單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD-20kDa)。
10.權(quán)利要求6、任一項所述的聚乙二醇修飾化促紅細胞生成素在制備促紅細胞生成類藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非糖基化人促紅細胞生成素的高效重組表達與純化方法，本發(fā)明方法將h-ngEPO基因與分子伴侶SUMO序列融合，構(gòu)建了一種新型的SUMO-rh-ngEPO融合基因表達載體，將該載體轉(zhuǎn)讓宿主菌中，從而建立了一種工程菌，通過培養(yǎng)該工程菌并誘導(dǎo)表達SUMO-rh-ngEPO融合蛋白，切除SUMO部分，即可得到rh-ngEPO蛋白。該方法實現(xiàn)了rh-ngEPO蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)的可溶性表達及大規(guī)模純化，所得rh-ngEPO蛋白活性高。本發(fā)明還提供了非糖基化人促紅細胞生成素的聚乙二醇修飾化方法，通過該修飾方法得到的聚乙二醇修飾化非糖基化人促紅細胞生成素的半衰期明顯延長，且其促紅細胞增殖活性也得到顯著的提高，可廣泛應(yīng)用于制備促紅細胞生成類藥物。
文檔編號A61K38/18GK102586299SQ20121001393
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者任哲, 利奕成, 王一飛, 趙振嶺 申請人:廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司