專利名稱：含有epo衍生物的血液相關(guān)疾病的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于以EPO衍生物為有效成分的血流增加劑、血管促進(jìn)劑或者缺血性疾患治療劑的藥物發(fā)明。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素(以下有時記載為ΕΡ0)是促進(jìn)紅血球前驅(qū)細(xì)胞分化、增殖的酸性糖蛋白質(zhì)激素，主要由腎臟產(chǎn)生。血液中含有非常豐富的紅血球，它們在一定的期間內(nèi)發(fā)揮作用后，在脾臟等處被破壞(人體紅血球的平均壽命約為120天)，在正常狀態(tài)下，通過骨髓不間斷地供應(yīng)，使末稍的全血紅細(xì)胞數(shù)量經(jīng)常保持穩(wěn)定。EPO在這種維持生體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定性方面起著核心性的作用。臨床上利用EPO治療貧血以及進(jìn)行術(shù)前術(shù)后的管理。有報導(dǎo)EPO具有促進(jìn)血管新生的作用，作為缺血性疾患的治療劑有效(Anatole B et al. , The New England Journal of Medicine,339(9),584-590, (1998) > Christopher H et al.，Blood, 102(4)，1340-1346，(2003)、Ferdinand H B et al. , Blood, 103(3), 921-926, (2004) > Kyle J S et al. , Cardiovascular Research, (59), 538-548, (2003)、 Ferdinand H B et al. , Kidney International,64,1648-1652, (2003))。但是，在以促進(jìn)血管新生作用為目的的EPO給藥時，有可能引起非本來治療目的的紅血球數(shù)量增加。為此，臨床上需要能盡量抑制紅血球增加作用的，并且能作為缺血性的血液相關(guān)疾患治療劑使用的新型治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供治療缺血性疾患等的治療藥物。諸位發(fā)明者發(fā)現(xiàn)EPO衍生物、特別是去唾液酸EPO具有增加血流、促進(jìn)血管以及治療疾患的作用，完成了此項(xiàng)發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供以下內(nèi)容(I)以EPO衍生物作為有效成分的缺血性疾患治療劑。(2)EPO衍生物是去唾液酸EPO(I)的治療劑。(3)與含有干細(xì)胞物質(zhì)同時給藥的(I)或者(2)的治療劑。(4)含有干細(xì)胞物質(zhì)為骨髓細(xì)胞的(3)的治療劑。(5)以EPO衍生物為有效成分的血管促進(jìn)劑。(6)EPO衍生物是去唾液酸EPO的(4)的促進(jìn)劑。(7)以含有干細(xì)胞物質(zhì)同時給藥的(5)或者(6)的促進(jìn)劑。(8)含有干細(xì)胞物質(zhì)為骨髓細(xì)胞的(7)促進(jìn)劑。(9)以EPO衍生物為有效成分的血流增加劑。(10)促EPO為去唾液酸EPO的(9)的促進(jìn)劑。(11)與含有干細(xì)胞物質(zhì)同時給藥的(9)或者(10)的增加劑。(12)含干細(xì)胞物質(zhì)為骨髓細(xì)胞的(11)的增加劑。


圖I是使用ICR小鼠下肢缺血標(biāo)本的EPO衍生物的治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果(左圖生存效果、右圖血管再生效果)表示圖。圖2是使用ICR小鼠下肢缺血標(biāo)本，與骨髓細(xì)胞一同給藥的EPO衍生物的治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果(左圖生存效果、右圖血管再生效果)表不圖。圖3是使用ICR小鼠下肢缺血標(biāo)本的治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果(血流恢復(fù)效果)表示圖。圖4是使用ICR小鼠下肢缺血標(biāo)本的治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果(血管新生效果)表示圖。圖5是使用無處置ICR小鼠，進(jìn)行的EPO以及去唾液酸EPO的紅細(xì)胞增多癥誘發(fā)效果表示圖。
具體實(shí)施例方式EPO本發(fā)明所使用的ΕΡ0，雖然可以使用任何ΕΡ0，但理想的是使用高純度ΕΡ0。更具體的說，是具有與哺乳動物的ΕΡ0、特別是與人類的EPO實(shí)質(zhì)性相同的生物學(xué)活性物質(zhì)的高純度 ΕΡ0。本發(fā)明所使用的ΕΡ0，可以使用各種方法制造。例如，可以使用從人類抽取物精制而成的天然的人體EPO(特公平1-38800號公報，等)，或者使用通過遺傳工程的方法，由大腸桿菌、酵母菌、中國田鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)、C127細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、BHK細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等生成的，用各種方法提取、分離、精制出的人體EPO等。本發(fā)明所使用的ΕΡ0， 理想的是使用通過遺傳工程的方法，用哺乳動物細(xì)胞(特別是CHO細(xì)胞)制造的EPO(例如 特公平 1_44317 號公報，Kenneth Jacobs et al. , Nature, 313 806-810 (1985)等)。通過遺傳基因置換法所得到的ΕΡ0，可以是與天然形成EPO的氨基酸排列相同的 ΕΡ0，也可以是該氨基酸排列中的存在I個或多個氨基酸缺失、置換、附加等的，具有與天然形成的EPO相同的生物學(xué)活性的ΕΡ0。氨基酸的缺失、置換、附加等，可以通過對該同業(yè)者公布的方法進(jìn)行。例如，如果是該同業(yè)者，使用部位特異的變異誘發(fā)法等(Gotoh，T. et al. (1995)Gene 152, 271-275 ；ZoIler, M. J. and Smith, M. (1983)Methods EnzymoI. 100， 468-500 ；Kramer, ff. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 ；Kramer, ff. and Fritz, H. J. (1987)Methods EnzymoI. 154, 350-367 ；Kunkel, T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,488-492 ；Kunkel (1988)Methods EnzymoI. 85，2763-2766)，通過向 EPO 的氨基酸導(dǎo)入適宜的變異，就可以調(diào)制與EPO同等功能的多肽。而且，氨基酸的變異在自然界也會發(fā)生。一般情況下，被置換氨基酸的殘基，理想的是被保存氨基酸支鏈性質(zhì)的別的氨基酸置換。例如作為氨基酸支鏈的性質(zhì)，可以列舉出有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、 親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、有脂肪族支鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、有含氫氧基支鏈的氨基酸(S、T、Y)、有含硫原子支鏈的氨基酸(C、M)、有含羧酸以及含酰胺酸支鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、有含堿基支鏈的氨基酸(R、K、H)、有含芳香族支鏈的氨基酸(H、 F、Y、W)(括弧內(nèi)字母均為氨基酸的直列標(biāo)記)。已經(jīng)知道，相對某氨基酸排列的I個或者多個氨基酸殘基的缺失、附加以及/或者有通過其他氨基酸的置換修飾的具有氨基酸排列的多肽，可以維持其生物學(xué)的活性(Mark,D. F. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81,5662-5666 ;Zoller，M. J. & Smith,M. Nucleic Acids Research(1982) 10，6487-6500 ;Wang， A. et al.，Science 224，1431-1433 ；Dalbadie-McFarland, G. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79，6409-6413)。還可以使用EPO與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合蛋白質(zhì)。在制作結(jié)合多肽時，例如，使 EPO編碼的DNA與其他蛋白質(zhì)編碼的DNA結(jié)構(gòu)一致地相結(jié)合，導(dǎo)入發(fā)現(xiàn)媒介物，由宿主發(fā)現(xiàn)即可。本發(fā)明中，與EPO結(jié)合的其他蛋白質(zhì)無特別地限定。還可以使用經(jīng)過化學(xué)修飾的ΕΡ0。作為化學(xué)修飾EPO的事例，可以列舉結(jié)合了聚乙二醇·維生素B12等無機(jī)化合物或者有機(jī)化合物的EPO等。EPO的衍牛物本發(fā)明中所指的EPO衍生物，是指修飾了 EPO分子中的氨基酸，或者是修飾了 EPO 分子中糖鏈的EPO。作為EPO糖鏈的修飾，包括糖鏈的附加、置換、缺換等內(nèi)容。作為本發(fā)明中理想的糖鏈修飾，可以列舉為EPO分子中的唾液酸缺失。通常，無論是通過轉(zhuǎn)換動物細(xì)胞所生產(chǎn)的ΕΡ0，還是尿中提取的ΕΡ0，都可得到含有多種不同糖鏈構(gòu)造EPO的EPO組成物。在每個EPO分子中的EPO組成物中，EPO分子附加的唾液酸的數(shù)量是不同的，通常，I個EPO分子附加有11 15個唾液酸。通過除去這些唾液酸可以制作去唾液酸化的EPO (去唾液酸ΕΡ0)。在去唾液酸化時，除去唾液酸的數(shù)量無特別限定，既可以除去所有的唾液酸，也可以除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或者14個唾液酸。本發(fā)明中理想的去唾液酸EPO的EPO分子附加唾液酸數(shù)量為10個以下， 更理想的是在5個以下，最理想的是在2個以下。本發(fā)明所使用的唾液酸的數(shù)量是包含在 EPO組成物中的EPO分子的平均數(shù)。I個分子的唾液酸平均數(shù)量，可以使用向該同業(yè)者公布的方法進(jìn)行測定(EP0428267公報，等)。除去唾液酸的EPO(去唾液酸ΕΡ0)可以使用向該同業(yè)者公布的方法進(jìn)行制作。例如，可以通過使用唾液酸酶等的酶對EPO進(jìn)行處理的方法制作?？梢允褂檬惺鄣耐僖好?特表 2005-507426 號，Nobuo Inai et al. ·，Eur. J. Biochem, · 194，457-462 (1990)，等)。作為EPO分子中的氨基酸的修飾，雖然可以列舉出氨基甲?；?、生物素化、脒化、 乙酰化、胍化等方法，但本發(fā)明理想的氨基酸修飾是氨基甲酰化法。修飾的氨基酸殘基無特別的限定，例如，雖然可以列舉出賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、 色氨酸等，但本發(fā)明的理想修飾氨基酸為賴氨酸。因此，作為本發(fā)明的氨基酸修飾EPO的理想狀態(tài)，可以列舉出氨基甲?；?的 EPO(Marcel L et al.Derivatives of eryt hropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 2004 ；305 239> Fiordaliso E et al. A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium trom ischemia-reperfusion injury. PNAS, 2005 ； 102 :2046、等)。在 EPO 氨基甲酸化中，包括通過與氰酸鹽離子等反應(yīng)的氨基甲酰化，通過與異氰酸烷基脂等反應(yīng)的烷基氨基甲酰化，通過與烯丙異丙氰酸鹽等反應(yīng)的芳基氨基甲酰化等。疾患本發(fā)明的治療劑，作為血流增加劑、血管促進(jìn)劑、缺血性疾患治療劑有治療作用。本發(fā)明的血流量增加是指，局部投給EPO衍生物的部位，或者從該部位到末梢部位的血流量比投藥前增加。而且，還意味著到達(dá)缺血組織的血流量增加。關(guān)于是否具有增加血流量的作用，可以使用對該同業(yè)者公布的方法進(jìn)行測定。例如，可以通過流體技術(shù)，使用微量放射性元素的方法進(jìn)行定量測定(An. J. Physiol. 243 H378, (1982)。進(jìn)一步還可以通過皮膚溫度、熱描記法、激光血流計、下肢/上肢血壓比、組織氧分壓等方法測定和確認(rèn)。本發(fā)明的血管促進(jìn)是指，促進(jìn)血管的新生、促進(jìn)血管的再生、以及促進(jìn)血管的生長、發(fā)達(dá)。雖然通過EPO衍生物促進(jìn)新生、再生、成長、發(fā)達(dá)等的血管無特別限定，但是在動脈，特別是末梢動脈表現(xiàn)理想。關(guān)于是否具有血管促進(jìn)作用，可以使用對該同業(yè)者公布的方法進(jìn)行測定。例如，可以通過使用堿性磷酸酯酶染色等方法測定毛細(xì)血管密度。進(jìn)一步還可以使用血管造影等方法進(jìn)行測定、確認(rèn)。本發(fā)明的治療劑對缺血性疾患的有治療效果。缺血性疾患是由于血管內(nèi)腔狹窄、 血栓形成、血管閉塞、血管炎、血管收縮、血液粘性增加等各種原因,所造成的血管血流量減少，組織陷入缺血狀態(tài)的病癥。作為缺血性疾患，有末梢循環(huán)障害、缺血性心臟疾患(心肌缺血癥、心肌梗塞癥、缺血性心功能不全等)、缺血性腎臟疾患、缺血性肺疾患、感染癥相關(guān)的缺血性疾患等)。本發(fā)明的缺血性疾患治療劑對缺血性疾患的對象無特別限定，雖然任何缺血性疾患都可作為治療對象，但以末梢循環(huán)障害作為治療對象較為理想。末梢循環(huán)障害是由于血管內(nèi)腔狹窄、血栓形成、血管閉塞、血管炎、血管收縮、血液粘性增加等原因，造成末梢動脈血流量減少，使組織陷入缺血的病癥。伴有末梢循環(huán)障害的疾患可以列舉出閉塞性動脈硬化癥、血栓閉塞性脈管炎等慢性動脈閉塞癥、進(jìn)行性全身硬化癥、全身性紅斑、雷諾病、振動病、動脈瘤、血管炎等。治療用制劑本發(fā)明的治療劑，可以根據(jù)需要，隨意地添加混懸劑、溶解輔助劑、穩(wěn)定劑、等滲化劑、保存劑、吸附防止劑、表面活性劑、稀釋劑、賦形劑、PH調(diào)整劑、無痛化劑、緩沖劑、含硫還原劑、氧化防止劑等。作為混懸劑的事例，可以列舉出纖維素、聚山梨醇酯80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、 黃蓍膠末、羧甲基纖維素納、縮聚山梨醇單十二酸酯等。作為溶液輔助劑，可以列舉聚氧化乙烯硬化蓖麻油、聚山梨醇酯80、煙酰胺、縮聚
山梨醇單十二酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。作為穩(wěn)定劑，可以列舉出葡聚糖40、纖維素、明膠、亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，還可以添加某種氨基酸(例如，特開平10-182481號公報等)。作為可以添加的氨基酸中，包含游離氨基酸、氨基酸的鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽等鹽類?？梢蕴砑覫種或者2種以上組合的氨基酸。雖然作為穩(wěn)定劑添加的氨基酸無特別限定，但理想的氨基酸可以列舉出白氨酸、色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸。作為等滲化劑的事例，可以列舉出D-甘露醇、山梨醇等。作為保存劑的事例，可以列舉出對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、 苯酚、甲酚、氯化甲酚等。作為吸附防止劑的事例，可以列舉出人血清白蛋白、卵磷脂、右旋糖酐、環(huán)氧乙烷、 甲基氧丙環(huán)共聚合體、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧化乙烯硬化蓖麻油、聚乙二醇等。作為表面活性劑的非離子表面活性劑可以列舉出單辛基山梨聚糖單、單月桂基山梨聚糖單、單棕櫚基山梨聚糖、等山梨脂肪酸酯；單辛基丙三醇、單肉豆蘧基丙三醇、單硬脂酸丙三醇等的丙三醇脂肪酸酯；單硬脂甘油基癸酸酯、甘油基半胱氨癸酸酯、單甘油基亞麻酸癸酸酯等的聚甘油脂肪酸酯；聚氧化乙烯單月桂酸山梨聚糖、聚氧化乙烯油酸山梨聚糖、聚氧化乙烯單硬脂酸山梨聚糖、聚氧化乙烯單棕櫚酸山梨聚糖、聚氧化乙烯三油酸酯山梨聚糖、聚氧化乙烯單三硬脂酸山梨聚糖等的聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯；聚氧化乙烯四硬脂酸山梨糖醇、聚氧化乙烯四油酸山梨糖醇等的聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯聚氧乙烯單硬脂酸甘油等的聚氧化乙烯甘油脂肪酸酸；聚乙烯硬脂酸乙二醇等的聚乙烯乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等的聚氧化乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯棕櫚醚等的聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等的聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯硬化蓖麻子油(聚氧乙烯氫蓖麻子油)等的聚氧乙烯硬化蓖麻子油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟等的聚氧乙烯蜂蠟衍生物聚氧乙烯羊毛脂等的聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯氨基硬脂酸等的含有聚氧乙烯脂肪酸氣基等的HLB 6 18的物質(zhì)；陰尚子表面活性劑，例如掠桐基硫酸納、月桂基硫酸鈉、硫酸油醇鈉等的含有碳原子數(shù)10 18的烷基的烷基硫酸鹽；聚氧乙烯月桂基硫酸鈉等的環(huán)氧乙烷的平均附加摩爾數(shù)為2 4，烷基的碳原子數(shù)為10 18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基硫代玻拍酸酷納等的燒基碳原子數(shù)為8 18的燒基硫代玻拍酸酷鹽；天然系列的表面活性劑，可以列舉如卵磷指、甘油磷酸脂、鞘磷脂等的鞘磷脂脂類；碳原子數(shù)12 18 的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等典型事例。本發(fā)明的制劑中，可以添加這些表面活性劑的I種或者2種以上的組合。希望的表面活性劑是，聚山梨醇酯20，40，60或者80等的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，特別希望的是聚山梨醇酯20以及80。而且，也希望泊洛沙姆(Pluronic F-68 (登陸商標(biāo))等)代表的
聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇。作為含硫還元劑，可以列舉出N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸以及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、含有碳原子數(shù)I 7的硫醇酸等氧硫基物質(zhì)等。作為防氧化劑，可以列舉出異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、叔丁對甲氧酚制劑、 α -生育酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸以及基鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸、L-抗壞血酸硬脂酸、 亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊基、沒食子酸丙基、或者乙二胺四醋酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等的螯合劑。甚至，還可以含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鈉等無機(jī)鹽，以及枸櫞酸鈉、枸櫞酸鉀、醋酸鈉等有機(jī)鹽等通常的添加成分。將本發(fā)明作為緩釋制劑時，緩釋性制劑可以通過使用聚合體作為基劑等的眾所周知的方法進(jìn)行調(diào)制。作為基劑的聚合體，希望使用能夠在生體內(nèi)分解的聚合體。本發(fā)明治療劑的EPO衍生物投藥量，通常為O. 001 μ g/kg/day ΙΟΟΟμ g/kg/day， 但希望投藥量為O. 01 μ g/kg/day 100 μ g/kg/day,最佳希望投藥量為O. I μ g/kg/day 30μ g/kg/day。對于使用本發(fā)明治療劑的患者，由醫(yī)師綜合考慮各個患者的年齡、體重、癥狀、給藥途徑等因素，決定投藥量。本發(fā)明的治療劑EPO衍生物希望局部投藥。局部投藥的部位無特別限定，可以對欲促進(jìn)血管新生、增加血流量的部位(組織、器官等)以及發(fā)生缺血狀態(tài)的部位等投藥。作為具體的局部投藥部位的事例，可以列舉出，下肢骨格肌、上肢骨格肌、心臟(心肌)等。只要不會對全身造成大影響，而對患部局部有效，EPO衍生物的局部投藥方法無特別的限定。使用一般的注射器、注射針頭、局部針等，都可以進(jìn)行局部給藥。本發(fā)明中所謂的局部給藥，一般是指直接向欲促進(jìn)血管新生、增加血流量的部位和陷入缺血狀態(tài)的部位以及其近旁等處，投與EPO衍生物。但是，也可以通過直接連接這些部位的血管進(jìn)行給藥。(例如，在肝臟為缺血部位時，從肝動脈投與EPO衍生物等。)本發(fā)明的治療劑也包括以預(yù)防為目的的預(yù)防劑。干細(xì)胞含有物質(zhì)干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和分化能力的細(xì)胞，本發(fā)明所采用的干細(xì)胞即可以是造血干細(xì)胞，也可以是除此之外的其他干細(xì)胞。本發(fā)明中所謂的干細(xì)胞物質(zhì)，如果是含有干細(xì)胞的組成物，則無特別限定。既可以僅含有干細(xì)胞，也可以包含有干細(xì)胞之外的其他成分。作為干細(xì)胞含有物質(zhì)，可以列舉出骨髓、臍帶血、末稍血等。希望的干細(xì)胞含有物質(zhì)是骨髓細(xì)胞。骨髓細(xì)胞即可以是自體骨髓，也可以是異體骨髓。而且，投與的骨髓組織匹配抗原 (HLA或者M(jìn)HC)的類型不一定必須與患者一致，但是，希望與患者一致。骨髓細(xì)胞可以通過向同業(yè)者公開的方法調(diào)制，例如，可以將哺乳動物全身麻醉，從骨盆的部位(髂骨、大腿骨等)采集。采集的骨髓可以通過比重離心法等眾所周知的方法，分離有核細(xì)胞成分或者低比重細(xì)胞成分。骨髓細(xì)胞的投與量一般為I X IO6 I X IO12個/body，希望投與量為I X IO8 IXlO10個/body，最希望的投與量為3X IO9 6X IO9個/body。給藥的方法無特別限定，盡管可以使用任何的方法給藥，但是，希望的是使用局部給藥，特別希望對缺血部位進(jìn)行肌肉內(nèi)注射。骨髓細(xì)胞的給藥可以向復(fù)數(shù)的部位或者分為復(fù)數(shù)的次數(shù)進(jìn)行投藥。例如，作為對四肢缺血的治療給藥的事例，可以列舉出將濃縮為50ml的骨髓細(xì)胞含有溶液，分別向50個部位進(jìn)行肌肉內(nèi)給藥的方法(每個部位lml)。作為心肌缺血治療劑的事例，可以列舉出將濃縮為IOml的骨髓含有溶液，分別向50個部位進(jìn)行肌肉內(nèi)給藥的方法(每個部位O. 2ml)。本發(fā)明提供，以EPO衍生物和干細(xì)胞含有物質(zhì)組合為特征的血流增加劑、血管促進(jìn)劑或者缺血性疾患治療劑。EPO衍生物和干細(xì)胞含有物質(zhì)即可以同時給藥，也可以依次給藥。本發(fā)明的效果如后述的實(shí)施事例所示，本發(fā)明項(xiàng)目的發(fā)明者們在使用下肢缺血的標(biāo)本進(jìn)行治療效果實(shí)驗(yàn)時，觀察到與EPO單獨(dú)給藥相比，去唾液酸EPO單獨(dú)給藥對下肢壞死具有更強(qiáng)的抑制作用(生存效果)。在EPO單獨(dú)給藥的實(shí)驗(yàn)中，未見從發(fā)紺狀態(tài)的恢復(fù)，但是，通過去唾液酸EPO單獨(dú)給藥，觀察到了從發(fā)紺狀態(tài)恢復(fù)的情況(實(shí)效性血管再生效果)。通過骨髓細(xì)胞移植和去唾液酸EPO給藥的合并給藥，進(jìn)一步顯著地增加了生存效果以及實(shí)效性血管再生效果。使用未進(jìn)行人工造成下肢缺血的無處置ICR小鼠，進(jìn)行紅細(xì)胞增多癥的發(fā)誘效果實(shí)驗(yàn)時，在投與EPO的實(shí)驗(yàn)中，觀察到了成紅細(xì)胞的亢進(jìn)(Ret)、脾臟的髓外造血的亢進(jìn) (Sp)以及紅細(xì)胞增多癥(Hb、Hct)。但在投與去唾液酸EPO的實(shí)驗(yàn)中，未觀察到這些副作用。本發(fā)明者雖然不受以下理論束縛，但是推測因?yàn)槿ネ僖核酔PO比EPO在血液中的分解速度快，不在血液中滯留，所以不引起紅細(xì)胞增多癥那樣的副作用。根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明，通過投與EPO衍生物，不會誘發(fā)紅細(xì)胞增多癥等不希望發(fā)生的作用，可以使用于增加血流、促進(jìn)血管新生以及治療缺血性疾患。通過本項(xiàng)發(fā)明的實(shí)施事例，可作出進(jìn)一步的說明，但是，本項(xiàng)發(fā)明不受這些限定。 當(dāng)業(yè)者可以進(jìn)行各種變更、修飾，這些變更、修飾也包含在本項(xiàng)發(fā)明之內(nèi)。以下實(shí)施事例的統(tǒng)計學(xué)解析，全部數(shù)據(jù)使用平均值土SD表示。通過使用ANOVA進(jìn)行群間的比較，然后，通過BON = FERR0NI進(jìn)行確率的檢定。P < O. 0024定義為無顯著差
巳升。實(shí)施例I :去唾液酸EPO的調(diào)制從使用CHO細(xì)胞通過遺傳子組換法制作的EPO(中外制藥株式會社制)中，根據(jù)文獻(xiàn)(Im ai N. Higuchi M. Kawamura A. Tomonoh K. Oh-Eda M. Fujiware M. Shimonaka Y. Ochi N. Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoietin. Supp ressive effects of sialic acid in the expression of biological activity of human erythropoietin in vitro. European Journal of Biochemistry. 194(2) :457-62. 1990 Dec 12.)記載的方法，調(diào)制了去唾液酸ΕΡ0。通過SDS凝膠電泳分子量的降低，以及等電點(diǎn)電泳Pl的變化，確認(rèn)除去了唾液酸。而且，通過以EPO依存性細(xì)胞株的增殖作為指標(biāo)的生物測定，確認(rèn)去唾液酸EPO保持著生物活性。去唾液酸EPO的制作將EPO凍干粉末以及神經(jīng)氨(糖)酸甘酶(生化學(xué)工業(yè))，用IOmM枸櫞酸-磷酸緩沖液(pH 6. 5)溶解，各自混合成lmg/ml以用250mU。以37°C孵化I小時后，通過C 4逆相HPLC縱列(VYDAC)的乙腈濃度梯度溶出，精制出去唾液酸EPO。所得到的去唾液酸EPO中的唾液酸已經(jīng)除去，可以通過SDS凝膠電泳確認(rèn)分子量降低，以及通過等電點(diǎn)電泳確認(rèn)Pl的變化得以證實(shí)。也就是說，將去唾液酸EPO 5. O yg, 在SDS-PAGE樣品緩沖劑(TEFCO)中，進(jìn)行100°C，10分鐘的轉(zhuǎn)換處理，用其全量14%的丙烯酰胺(TEFCO)進(jìn)行了電泳。將凝膠進(jìn)行CBB染色，確認(rèn)分子量約降低了 5KDa。使用 PhastGel IEF 3_9 (Amersham)進(jìn)行等電點(diǎn)電泳后,用20%三氯醋酸溶液進(jìn)行固定化處理， 使用PhastGel蛋白銀染試劑盒進(jìn)行銀染色。確認(rèn)了由于唾液酸的解離，pi變化至8. O的附近。去唾液酸EPO的牛物活件通過以EPO依存性細(xì)胞株的增殖作為指標(biāo)，確認(rèn)了去唾液酸EPO具有生物活性。即，將EPO依存性增殖細(xì)胞AS-E2細(xì)胞株(文獻(xiàn)Miyazaki Y. Kuriyama K. Higuchi M. Tsushima H. Sohda H. Imai N. Saito M.Kondo Τ. Tomonaga Μ. Establishment and characterization of a new erythropoietin-dependent acute myeloid leukemia cell line, AS-E2. Leukemia. 11(11) :1941-9,1977Nov.)在 0. 04 lOng/ml 的去唾液酸 EPO 或者含有EPO的20% FCS/IM DM培養(yǎng)基中(Hyclone)，在37°C 5. 0% C02條件下，培養(yǎng)3 4 天，使用WST-I試劑(寶酒造)測定活細(xì)胞數(shù)。確診了去唾液酸EPO也具有與EPO同樣的增殖刺激。
實(shí)施例2 從日本橫濱的Charles Riner購入雄性8周齡的ICR小鼠用于實(shí)驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)順序按照 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH 出版號86-23 ; National Institute of Health, Bethesda, MD),在無菌條件下進(jìn)行。通過向小鼠的腹腔內(nèi)投與氯胺酮(60mg/kg Bff)以及甲苯噻嗪6mg/kg BW)麻醉小鼠。按照Isner的方法切開左下肢中間部位的皮膚，暴露血管(Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichler B，Isner JM Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol 152 1667-1679，1998)。結(jié)扎大腿動脈起始部后，結(jié)扎該潛在動脈，剝離其他的側(cè)枝，與主動脈一同切除。所有的小鼠都給以通常的飲食和飲水。實(shí)施例3 :使用下肢缺血標(biāo)本的治療效果實(shí)施(生存效果和血管再生效果)(實(shí)施方法)使用實(shí)施例2的方法制作的ICR小鼠下肢缺血標(biāo)本進(jìn)行了治療實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中， 將下肢的壞死定義為死(survival)。并將下肢發(fā)甜的恢復(fù)定義為恢復(fù)(recovery)。實(shí)驗(yàn)中使用了以下各群(各群13匹)。C群無治療E群EP0(400U/kg體重，缺血部位肌肉內(nèi)注射)連續(xù)6天給藥的治療。A E群同劑量同給藥方法的去唾液酸EPO治療。B群將1X107個骨髓細(xì)胞，在缺血部位進(jìn)行肌肉內(nèi)注射的治療(在第I天，分4 個部位給藥)B+E群合并使用B (骨髓細(xì)胞)和E (EPO)。B+AE群合并使用B和AE (去唾液酸ΕΡ0)(結(jié)果)各治療的生存效果、恢復(fù)效果以及結(jié)果如圖I、圖2所示。將結(jié)果總結(jié)如下(I) EPO單獨(dú)給藥對下肢壞死有抑制作用，但去唾液酸EPO單獨(dú)給藥對下肢壞死有更強(qiáng)的抑制作用(生存效果)。(2) EPO單獨(dú)給藥時未觀察到從發(fā)紺狀態(tài)的恢復(fù)，但去唾液酸EPO單獨(dú)給藥時，觀察到了從發(fā)紺狀態(tài)的恢復(fù)(實(shí)效性血管再生效果)。(3)雖然觀察到骨髓細(xì)胞移植具有生存效果以及實(shí)效性血管再生效果，但是，合并使用EPO給藥可以增強(qiáng)這些效果，如果將去唾液酸EPO代替EPO合并使用，則能更有效地顯著增強(qiáng)這些效果。實(shí)施例4 :使用下肢缺血標(biāo)本的治療效果實(shí)施(血流恢復(fù)效果)使用與實(shí)施例3中下肢生存·恢復(fù)標(biāo)本相同的小鼠、相同的方法制作的小鼠下肢缺血標(biāo)本測定血流。(實(shí)施方法)從制作好下肢缺血標(biāo)本的當(dāng)天開始治療(day I)。移植在day I內(nèi)進(jìn)行。EPO等的給藥在day 1-6的連續(xù)6天內(nèi)進(jìn)行。在Day 7內(nèi)使用激光·多普勒測定下肢血流的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)中使用了以下各群。C群連續(xù)6天肌肉內(nèi)注射生理鹽水(η = 12)
E群連續(xù)6天肌肉內(nèi)注射EPO 400U/kg體重(η = 5)。A群連續(xù)6天肌肉內(nèi)注射去唾液酸EPO 400U/kg體重(η = 5)。B群移植同種同系骨髓細(xì)胞(I X IO7骨髓細(xì)胞)(η = 7)B E群合并使用B和Ε(η = 5)B A群合并使用B和Α(η = 6)測定時，使用Moor Instruments 公司(Wilmington, Delaware, USA)的 moorLDI Laser Doppler system測定兩下肢血流，缺血肢測定值除以健康肢測定值得到flux ratio。(結(jié)果)得到的結(jié)果如圖3所示。與EPO相比，去唾液酸EPO與單獨(dú)治療以及與骨髓細(xì)胞移植合并使用的兩種方法對下肢血流恢復(fù)的效果更好。實(shí)施例5 :使用下肢缺血標(biāo)本的治療效果實(shí)施(血管新生)(實(shí)施方法)在實(shí)施例4中使用Laser Doppler測定血流之后，取出缺血下肢作為標(biāo)本，使用抗 CD31抗體和過氧化物酶法對血管進(jìn)行染色。計數(shù)血管數(shù)和肌肉纖維數(shù)，前者除以后者的值作為相當(dāng)于肌肉纖維的血管數(shù)。(結(jié)果)得到的結(jié)果如圖4所示。與EPO相比，去唾液酸EPO與單獨(dú)治療以及與骨髓細(xì)胞移植合并使用的兩種方法對下肢血流恢復(fù)的效果更好。實(shí)施例6 :導(dǎo)致紅細(xì)胞增多癥發(fā)病的效果(實(shí)驗(yàn)方法)以觀察EPO的副作用紅細(xì)胞增多癥的發(fā)病為目的，對不進(jìn)行人工制作下肢缺血的未經(jīng)處置的ICR小鼠，連續(xù)6天的EPO給藥或者去唾液酸EPO給藥(下肢肌肉內(nèi)注射)，在給藥第I天起算的10天后，采血后實(shí)施安樂死，測定脾臟的重量(Sp)。并測定血紅蛋白濃度(Hb)、紅細(xì)胞壓積值(Hct)以及網(wǎng)狀紅細(xì)胞比率(Ret)。實(shí)驗(yàn)中使用了以下各群(各群8匹)。C群對照E群ΕΡ0的每次給藥量為40，400或者4000U/kg。AE群同等劑量的去唾液酸EPO(結(jié)果)各給藥劑量的Sp :脾臟重量，Hb :血紅蛋白濃度，Hct :紅細(xì)胞壓積值，Ret :網(wǎng)狀紅細(xì)胞的效果如圖5所不。結(jié)果總結(jié)如下(I)觀察到通過EPO給藥，造成的成紅細(xì)胞造血亢進(jìn)(Ret)，脾臟的髓外造血亢進(jìn) (Sp)以及紅細(xì)胞增多癥(Hb、Hct)。(2)未觀察到通過去唾液酸EPO給藥造成的這些副作用。
權(quán)利要求
1.去唾液酸EPO在制備血流增加劑中的用途。
2.一種血流增加劑，其包含去唾液酸EPO和骨髓細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以紅細(xì)胞生成素(EPO)衍生物作為有效成分的血流增加劑、血管促進(jìn)劑以及缺血性疾患治療劑。
文檔編號A61K38/19GK102580058SQ20121001381
公開日2012年7月18日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日
發(fā)明者加藤公則, 樋口正人, 鳥羽健 申請人:新潟Tlo株式會社