專利名稱：腫節(jié)風(fēng)多糖及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫節(jié)風(fēng)多糖的制備方法及其抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性，用于治療與炎癥相關(guān)的疾病或作為免疫調(diào)節(jié)劑。屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，國際專利號分類為C08B 37/60。
背景技術(shù)：
腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai的干燥全草。金粟蘭科植物全世界有5屬，約70余種，分布于熱帶或亞熱帶；我國有3屬，約18種，分別為 絲穗金粟蘭屬、及己屬和草珊瑚屬。草珊瑚屬植物我國有兩種，分別為草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai和海南草珊瑚Sarcandra hainanensis。主要分布在四川、云南、貴州、安徽、福建、江西等地，分布廣泛且資源豐富，入藥歷史悠久，味苦、辛、性平，歸心、肝經(jīng)， 具有清熱涼血，活血消斑，祛風(fēng)通絡(luò)的功效，用于血熱紫斑、紫癜、風(fēng)濕痹痛，跌打損傷的治療。現(xiàn)代研究表明腫節(jié)風(fēng)具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗血小板減少等作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，為2010年版《中華人民共和國藥典》一部收載。腫節(jié)風(fēng)分布廣泛，資源的蘊藏量較大， 并且易于栽培，有廣闊的開發(fā)前景，目前被廣泛應(yīng)用于藥品、保健品、食品、化妝品和煙葉等領(lǐng)域中，腫節(jié)風(fēng)制劑的銷售總產(chǎn)值已超過100億人民幣以上。全國有多家藥廠以腫節(jié)風(fēng)為原料生產(chǎn)相關(guān)制劑，包括腫節(jié)風(fēng)浸膏片、清熱消炎寧膠囊、血康口服液、腫節(jié)風(fēng)注射液及復(fù)方草珊瑚含片；已開發(fā)的保健產(chǎn)品有草珊瑚牙膏、草珊瑚口香糖、草珊瑚保健茶、九節(jié)茶香口膠等。腫節(jié)風(fēng)所含化學(xué)成分眾多，如倍半萜、香豆素、黃酮、皂苷類化合物，具有多種藥理作用及臨床用途。但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的小分子化學(xué)成分很難解釋腫節(jié)風(fēng)的所有臨床功效，并且其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還不是非常明確。近些年，雖然一些學(xué)者也開始關(guān)注其中的大分子類物質(zhì)，如多糖類成分的相關(guān)研究，但是，也僅限于提取分離腫節(jié)風(fēng)水溶性粗多糖。在相關(guān)報道中，經(jīng)提取分離得到的水溶性粗多糖中糖含量偏低，即使用于藥理活性研究，也難以闡明腫節(jié)風(fēng)多糖的藥理作用。本發(fā)明通過解決腫節(jié)風(fēng)多糖制備的技術(shù)性難題，獲得了含量較高的腫節(jié)風(fēng)多糖，在此基礎(chǔ)上，又進一步研究了腫節(jié)風(fēng)多糖的抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)活性，證明腫節(jié)風(fēng)多糖可以應(yīng)用于炎癥和免疫相關(guān)疾病的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種從腫節(jié)風(fēng)水提物中獲得腫節(jié)風(fēng)多糖粗品的方法以及從腫節(jié)風(fēng)多糖粗品中分離純化得到腫節(jié)風(fēng)多糖精品的方法。所述的獲得腫節(jié)風(fēng)多糖粗品的方法，其特征是，將腫節(jié)風(fēng)全草干燥品粉碎后加入乙醇，回流脫脂，將脫脂后的原料加入去離子水，加熱提取，將提取液濃縮，加入乙醇沉淀， 真空干燥后得到本發(fā)明所述的腫節(jié)風(fēng)水提物。將腫節(jié)風(fēng)水提物溶解于去離子水，加入大孔樹脂，去除溶液中的色素和蛋白質(zhì)，保留脫色液，將脫色液過濾，然后濃縮，加入乙醇沉淀出腫節(jié)風(fēng)多糖，真空干燥后得到本發(fā)明的腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)，其多糖含量占總固體重量的 60%以上。所述的分離純化得到腫節(jié)風(fēng)多糖精品的方法，其特征是，是將上述方法獲得的腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)溶解于去離子水，用離子交換柱進行分離純化，以去離子水洗脫，用硫酸苯酚比色法跟蹤檢測，收集均一組分，再采用分子篩柱層析，以去離子水洗脫，用硫酸苯酚比色法跟蹤檢測，收集腫節(jié)風(fēng)多糖均一組分，冷凍干燥，即得到本發(fā)明所述的腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)，其多糖含量占總固體的90%以上。所述方法中，加熱提取是在熱水浴中加熱，水浴溫度在70_90°C。所述方法中，加熱提取時間為2-6小時。所述方法中，提取所用的液料比為10-30。所述方法中，大孔樹脂為陰離子交換樹脂。所述方法中，大孔樹脂脫色時間為1-3小時。所述方法中，離子交換樹脂為二乙胺基乙基纖維素(DEAE-52)。所述方法中，分子篩凝膠填料為Sephacryl S-400。本發(fā)明目的之二是提供一種結(jié)構(gòu)明確，質(zhì)量可控的腫節(jié)風(fēng)多糖在制備抗炎藥物或免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。所述的本發(fā)明的多糖在制備抗炎藥物或免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征是，將上述方法獲得的腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)和上述方法制備的腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)應(yīng)用于二甲苯造模的小鼠急性炎癥耳腫脹模型和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的倉鼠口腔黏膜炎模型均具有一定的治療效果，因此可應(yīng)用于制備抗炎藥物。并且腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)具有雙向調(diào)節(jié)免疫因子NO分泌的作用，因此可用于制備免疫調(diào)節(jié)劑。所述方法中，腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)多糖含量在60%以上。所述方法中，腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)多糖含量在90%以上，分子量為IOKDa左右。所述方法中，腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖。主要糖苷鍵鍵型有β (I — 2)甘露糖、α (I — 3)半乳糖和α (I — 4)葡萄糖。


圖I為腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)紅外光譜。圖2為腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)紫外-可見掃描光譜。圖3為腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)和腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)抑制5_氟尿嘧啶誘導(dǎo)的倉鼠口腔黏膜炎的作用。圖4為腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)抑制脂多糖LPS刺激巨噬細胞分泌炎癥因子NO 的作用。圖5為腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)刺激巨噬細胞分泌NO的作用。在圖I中SGP_1在3397CHT1附近的峰歸屬于糖環(huán)上0H_的伸縮振動，2928CHT1附近的峰歸屬于糖環(huán)上C-H伸縮振動。1648CHT1處的峰是由于結(jié)合水產(chǎn)生的。1155、1079和 1026處的峰歸屬于糖環(huán)上C-O的振動。1350-1450處的峰歸屬于糖環(huán)上CH2和COH的信號。 892cm-1處有吸收峰證明SGP-I含有β -糖苷鍵。在圖2中通過對SGP-I進行紫外-可見(200-700nm)全波長掃描，證明SGP-I純度較高，基本無蛋白質(zhì)、核酸和其它雜質(zhì)。在圖3中腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)在5g/Kg和lg/Kg、腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)在5g/Kg和lg/Kg濃度下均具有緩解5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的倉鼠口腔黏膜炎的作用。在圖4中SGP-1在400(μ g/ml)濃度下，對脂多糖LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌炎癥因子NO有顯著抑制作用，證明SGP-I具有一定程度的抗炎活性。在圖5中SGP_1在100、200、400和800(μ g/ml)濃度下與空白對照相比能顯著
誘導(dǎo)巨噬細胞分泌NO，證明SGP-I具有免疫調(diào)節(jié)作用。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細的說明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。說明書及實施例中采用的藥材、填料、化學(xué)試劑等，如未特殊說明均按常規(guī)實驗條件進行操作，或按供應(yīng)商提供的說明進行操作。實施例I :腫節(jié)風(fēng)多糖粗品的制備方法一稱取粉碎后過80目篩的腫節(jié)風(fēng)全草藥材IOOg于提取容器中，加入5倍體積乙醇， 回流脫脂3小時，4層紗布除去上清，殘渣補足去離子水至1000ml，70°C水浴提取I小時，間歇攪拌。收集提取液后，殘渣再補足去離子水至1000ml，70°C水浴提取I小時，間歇攪拌。 紗布濾去殘渣，合并提取液濃縮至20ml，4000r. p. m離心去沉淀，加入I倍乙醇沉淀，4°C放置24小時，離心除去上清液，以無水乙醇洗滌3次，真空干燥得本發(fā)明產(chǎn)物腫節(jié)風(fēng)水提物。 取腫節(jié)風(fēng)水提物2g于容器中，充分溶解于40ml去離子水，加入D301-G大孔樹脂脫色和除蛋白質(zhì)，間或攪拌I小時，溶液過濾后濃縮至10ml，加入IOml無水乙醇沉淀，4°C放置24小時。離心除去上清。以無水乙醇洗滌3次，真空干燥得到腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(代號SGP)。實施例2 :腫節(jié)風(fēng)多糖粗品的制備方法二稱取粉碎后過120目篩的腫節(jié)風(fēng)全草藥材IOOg于提取容器中，加入20倍體積乙醇，回流脫脂3小時，4層紗布除去上清，殘渣補足去離子水至3000ml，90°C水浴提取3小時。間歇攪拌，收集提取液后,殘渣再補足去離子水至3000ml，90°C水浴提取3小時，間歇攪拌。紗布濾去殘洛，合并提取液濃縮至20ml, 4000r. p. m離心去沉淀,加入6倍乙醇沉淀， 4°C放置24小時，離心除去上清液，以無水乙醇洗滌3次，真空干燥得本發(fā)明產(chǎn)物腫節(jié)風(fēng)水提物。取腫節(jié)風(fēng)水提物2g于容器中，充分溶解于IOOml去離子水，加入D301-G大孔樹脂脫色和除蛋白質(zhì)，間或攪拌3小時,溶液過濾后濃縮至IOml,加入60ml無水乙醇沉淀，4°C放置24小時。離心除去上清。以無水乙醇洗滌3次，真空干燥得到腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(代號 SGP)。實施例3 :均一腫節(jié)風(fēng)多糖的制備取腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP) 200mg,充分溶解于去離子水，上已平衡好的DEAE-52離子交換柱，規(guī)格為(2. 6X 30cm),平衡液為去尚子水,上樣體積為IOml,先以300ml去尚子水洗脫，再以0-2mol/L的NaCl溶液洗脫，分部收集，硫酸苯酚法跟蹤檢測，合并相同組分。離子交換柱分離所得腫節(jié)風(fēng)多糖水洗組分上Sephacryl S-400分子篩柱層析，以去離子水洗脫。柱規(guī)格為(l.OXlOOcm)，分部收集，硫酸苯酚法跟蹤檢測，合并相同組分。冷凍干燥，得到腫節(jié)風(fēng)多糖精品(代號=SGP-I)。
實施例4 :理化性質(zhì)測定I.多糖含量測定采用硫酸苯酚法，在490nm處，分光光度法測定總多糖含量，以葡萄糖(C6H12O6)計腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)多糖含量為64%，腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)多糖含量為96%。2.單糖組成分析薄層色譜稱取樣品10mg，以2mol/L三氟乙酸水解，甲醇洗滌后蒸干，以去離子水溶解后點樣，以正丁醇-丙酮-水(4 3 I)為展開劑，以標(biāo)準(zhǔn)單糖為對照，苯胺-鄰苯二鉀酸為顯色劑，結(jié)果證明其含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖。氣相色譜法多糖水解物及標(biāo)準(zhǔn)單糖用硼氫化鈉還原，加入甲醇反復(fù)洗滌，蒸干， 加入乙酸酐-吡啶(I I)于100°c水浴乙?；疘小時，使各種單糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴；苌?，再溶于氯仿進行氣相色譜分析。氣相色譜柱溫220°c，檢測器溫度300°C，載氣為N2，流速25mL/min ;進樣量1 μ L。結(jié)果見表I :SGP_1顯示為葡萄糖、半乳糖和甘露糖，比例約為
8.38 3. 31 I。表I腫節(jié)風(fēng)多糖SGP-I單糖組成氣相色譜分析
權(quán)利要求
1.腫節(jié)風(fēng)多糖粗品的制備方法，其特征在于所述腫節(jié)風(fēng)多糖粗品是由植物腫節(jié)風(fēng)粉碎后，過篩，經(jīng)乙醇回流脫脂處理，再經(jīng)水提醇沉獲得的水提物經(jīng)大孔樹脂脫色、除蛋白得到腫節(jié)風(fēng)多糖粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫節(jié)風(fēng)多糖粗品的制備方法，其特征是由下列步驟組成，步驟一取腫節(jié)風(fēng)全草，粉碎后過80-120目篩得原料，5-20倍乙醇回流脫脂，殘渣加入10-30倍重量的水，70-90°C提取1-3小時，間歇攪拌，4000r. p. m離心去沉淀，得提取液，離心后殘渣再加10-30倍腫節(jié)風(fēng)原料重量的水，70-90°C再提取1-3小時，離心除去殘渣，合并兩次提取的上清液，濃縮后離心，向離心上清液加入1-6倍體積的乙醇，4°C放置24小時，離心去上清液，以乙醇洗滌沉淀三次，干燥；步驟二 取干燥后的腫節(jié)風(fēng)水提物溶于20-50倍重量的水，加入D301-G大孔樹脂，室溫下間歇攪拌1-3小時，濃縮后4000r. p. m離心去沉淀，向上清液中加入1_6倍體積的無水乙醇，4°C放置24小時，離心除去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀三次，干燥后得本發(fā)明的腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)。
3.一種腫節(jié)風(fēng)多糖精品的分離純化方法，其特征是由以下步驟組成，步驟一它是由權(quán)利要求1、2所述的腫節(jié)風(fēng)多糖溶解于水，上DEAE-52陰離子交換柱， 去離子水洗脫，以硫酸苯酚法檢測，收集第一洗脫峰，濃縮后經(jīng)4倍乙醇沉淀，4°C放置，離心去上清，以無水乙醇洗滌三次，真空干燥，步驟二 將真空干燥后的樣品溶于去離子水，上已平衡好的S^hacryl S-400分子篩凝膠柱，用去離子水洗脫，分部收集，以硫酸苯酚法檢測，收集第二洗脫峰，濃縮后經(jīng)凍干制得本發(fā)明的腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3所述的腫節(jié)風(fēng)多糖粗品及腫節(jié)風(fēng)多糖精品，其特征在于，腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)多糖含量在60%以上。腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)多糖含量在90%以上， 分子量為IOKDa左右。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4所述的腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖。主要糖苷鍵鍵型有β (I — 2)甘露糖、α (I — 3)半乳糖和α (I — 4)葡萄糖。
6.腫節(jié)風(fēng)多糖粗品(SGP)和腫節(jié)風(fēng)多糖精品(SGP-I)具有抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)活性， 可以用作制備抗炎藥物和免疫調(diào)節(jié)劑的原料藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫節(jié)風(fēng)多糖的制備方法及其抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，國際專利號分類為C08B 37/60。一種腫節(jié)風(fēng)多糖粗品和腫節(jié)風(fēng)多糖精品，它是由植物腫節(jié)風(fēng)全草粉碎后過篩，加入乙醇回流脫脂，再經(jīng)熱水提取，乙醇沉淀，4℃放置，離心去上清，沉淀用乙醇洗滌三次，干燥后得腫節(jié)風(fēng)水提物。腫節(jié)風(fēng)水提物溶解于水，加入D301-G大孔樹脂脫色，除蛋白。脫色液經(jīng)濃縮，乙醇沉淀，離心去上清，沉淀用乙醇洗滌3次，干燥后得腫節(jié)風(fēng)多糖粗品。腫節(jié)風(fēng)多糖粗品經(jīng)離子交換柱層析和分子篩凝膠柱層析純化后獲得腫節(jié)風(fēng)多糖精品。它們具有抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)活性。
文檔編號A61P37/02GK102603907SQ201210013550
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者關(guān)欣, 劉瑋, 姚文兵, 金磊, 高向東 申請人:中國藥科大學(xué)