專利名稱：牛膝多糖衍生物、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多糖免疫調(diào)節(jié)劑及其制備方法和用途，特別是牛膝多糖衍生物類免疫調(diào)節(jié)劑。
牛膝多糖的分子末端為一個α-D-批喃葡萄糖，后面接2→6連接或2→1連接的β-D-呋喃果糖，牛膝多糖的ESI質(zhì)譜顯示其包括四糖～二十一糖，以六糖～十五糖為主。牛膝多糖具有抗腫瘤和增強免疫功能的作用。
近年來，多糖衍生物的抗病毒作用已引起國內(nèi)外藥物學(xué)家和病毒學(xué)家的極大興趣。例如，不少含有硫酸酯、磷酸酯的多糖具有獨特的生物活性。如β-(1→3)-D-葡聚糖磷酸化后，活性大大提高；羥乙基化的茯苓聚糖顯示了較好的抗腫瘤活性，但高取代的羥乙基化茯苓聚糖卻無抗腫瘤活性[Chem.Pharm.Bull.，1989，37，1838]。
目前，國內(nèi)外對多糖磷酸化和羥烷基化的研究不多，且取代度不高，這極不利于對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)于功能關(guān)系的研究。本發(fā)明對牛膝多糖進(jìn)行了磷酸化及羥炕基化。
本發(fā)明對牛膝多糖進(jìn)行了衍生化，包括磷酸酯化或羥烷基化，制得了牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖。 寡糖和多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性給寡糖和多糖的結(jié)構(gòu)分析帶來了極大的困難。本發(fā)明的牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖據(jù)分析其取代度、糖數(shù)具有如右所示結(jié)構(gòu)右式中R＝H、PO3Na2或(CH2)kOH，其中k＝2～4，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q=2～19。尤以下述結(jié)構(gòu)為主 其中牛膝多糖磷酸酯(鹽)的13C-NMR圖譜數(shù)據(jù)例如果糖呋喃環(huán)上的化學(xué)位移數(shù)據(jù)δ63.3～63.6、106.0～107.0、79.4～80.9、77.5～78.4或83.0～84.1、65.0～66.2ppm，葡萄糖吡喃環(huán)上的碳的化學(xué)位移數(shù)據(jù)δ95.5、74.1、75.5、82.8、74.6、63.0ppm。牛膝多糖磷酸酯(鹽)的紅外圖譜的數(shù)據(jù)例如3700～3000cm-1的強寬峰為分子間及分子內(nèi)羥基吸收，2950～2870cm-1為C-H鍵伸縮振動，1266cm-1為P＝O鍵振動，950～1050cm-1為P-O-C不對稱振動，1000～1100cm-1為C-O-C醚鍵不對稱伸縮振動。對牛膝多糖磷酸酯(鹽)產(chǎn)物中的磷含量進(jìn)行測定，計算得其取代度在0.1～2左右，其計算公式如下D.S.＝(162*P)/(3100-124*P)。其中D.S.為取代度，P為磷的百分含量。例如

其中羥乙基牛膝多糖的13CNMR(D2O)譜例如果糖呋喃環(huán)上的異頭碳的化學(xué)位移δ105.9～107.0；葡萄糖吡喃環(huán)上的異頭碳的化學(xué)位移δ95.2；羥乙基上的1位亞甲基的化學(xué)位移δ74.5、74.9、75.4，2位亞甲基的化學(xué)位移δ63.1、63.2、63.3、63.4。羥乙基牛膝多糖的IR(KBr)譜例如3370cm-1的強寬峰為分子間及分子內(nèi)羥基吸收，2950、2900cm-1為C-H伸縮，羥乙基化后該吸收峰比母體有所增強，1457cm-1為亞甲基的剪式振動，1357cm-1為C-H的非平面搖擺振動，1150～1000cm-1強寬峰為糖環(huán)上醚鍵C-O-C不對稱伸縮振動和鍵伸縮振動的疊加，937cm-1為呋喃環(huán)伸縮振動。892cm-1為-CH2-CH2-的平面搖擺振動。羥乙基牛膝多糖的元素分析例如C，42.87％；H，6.82％。
本發(fā)明的牛膝多糖衍生物可通過如下方法合成在0～100℃下，用磷酸化試劑或羥烷基化試劑，在有機溶劑或堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，生成不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖，所述的羥烷基化試劑是分子式為(CH2)kO的環(huán)氧烷或分子式為X(CH2)kOH的取代烷烴，所述的磷酸化試劑是三氯氧磷、二聚磷酸鈉、多聚磷酸、五氧化二磷等，所述的牛膝多糖與磷酸化試劑或羥烷基化試劑的摩爾比為1∶1～9。推薦的反應(yīng)時間為0.5～72小時。其中通過改變反應(yīng)溶劑、反應(yīng)試劑的量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度，可生成不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖。反應(yīng)后將反應(yīng)溶液中和，再經(jīng)分離純化得純品。其中羥烷基牛膝多糖的制備方法推薦在堿性水溶液中，用(CH2)kO或X(CH2)kOH作為羥烷基化試劑，與牛膝多糖反應(yīng)，生成羥烷基牛膝多糖。所述的X＝Cl、Br、I，所述的k＝2～4。其中牛膝多糖磷酸酯(鹽)的制備方法推薦在0～50℃下，用三氯氧磷、二聚磷酸鈉、多聚磷酸或五氧化二磷為磷酸化試劑，在有機溶劑或堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，生成牛膝多糖磷酸酯(鹽)。所述的有機溶劑是乙腈、吡啶、二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷-5-烯(DBN)、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一烷-7-烯(DBU)或四氫呋喃等；所述的堿性水溶液是無機堿的水溶液或無機堿和無機鹽的混合水溶液，所述的無機堿如NaOH、KOH等，例如NaOH的水溶液或NaOH、NaCl的混合水溶液，推薦的NaOH的水溶液的濃度為1％～30％，推薦的NaCl的水溶液的濃度為0～30％。
經(jīng)生物活性試驗，研究結(jié)果顯示牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖具有較好的抑制Lewis肺癌和S-180肺癌的效果，并能提高小鼠NK細(xì)胞活性，具有增強免疫活性的作用。
本發(fā)明用簡便的合成方法，制備了牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖，大大提高了衍生物的取代度，克服了以往其它多糖取代度低困難。本發(fā)明的牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖有利于構(gòu)效關(guān)系的研究，且具有抗腫瘤及增強免疫力的作用，適于工業(yè)化。
圖4是羥乙基牛膝多糖的13C-NMR圖譜。
圖5是牛膝多糖磷酸酯(鹽)的紅外光譜圖。樣品掃描數(shù)32；背景掃描數(shù)32。
圖6是牛膝多糖磷酸酯(鹽)的13C-NMR圖譜。
圖7是牛膝多糖磷酸酯(鹽)的31P譜圖8是牛膝多糖(AbPS)的質(zhì)譜總圖。
實施例2取5ml二甲亞砜，加入300mg牛膝多糖攪拌溶解，攪拌下滴加1ml三氯氧磷，加入吡啶使pH在中性左右。在室溫攪拌反應(yīng)，反應(yīng)2小時后，傾入冰水中，用氫氧化鈉中和，丙酮沉淀，離心，將沉淀溶解、透析、冰凍干燥，再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。所得產(chǎn)物磷酸根的取代度為0.8，具有抗腫瘤和增強免疫活性。
實施例3取10ml乙腈加入2ml吡啶，在冰水浴下滴加2ml三氯氧磷，滴加0.3ml雙蒸水，攪拌，將500mg牛膝多糖溶于8ml磷酸三甲酯中，在加入上述反應(yīng)液中，加入吡啶使pH在7左右。在冰水浴下攪拌反應(yīng)5小時后，用氫氧化鈉調(diào)pH至中性。丙酮沉淀，離心，將沉淀溶解、透析、冰凍干燥，再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。所得產(chǎn)物磷酸根的取代度為1.5，具有抗腫瘤和增強免疫活性。
實施例4取20ml吡啶，加入1.3g P2O5，攪拌，加入幾滴蒸餾水，加入經(jīng)充分?jǐn)嚢璧呐Ｏザ嗵沁拎ひ?，移?00℃油浴中，加熱反應(yīng)1hr后，傾入冰水中，2N NaOH中和。丙酮沉淀，溶解，透析，濃縮，冰凍干燥。再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。
實施例5稱260mg三聚磷酸鈉溶于水，調(diào)pH至12，加入牛膝多糖250mg。室溫攪拌反應(yīng)4hr。2N HCl中和，丙酮沉淀，溶解，透析，濃縮，冰凍干燥。再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。
實施例6牛膝多糖500mg溶于1％～30％氫氧化鈉與0％～30％氯化鈉的混合溶液中，在冰浴中加入環(huán)氧乙烷0.5ml，加完后，0～50℃反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用1M鹽酸中和至pH＝7，丙酮沉淀，離心，透析，冷凍干燥，Sephadex G-25柱層析純化。
實施例7牛膝多糖500mg溶于20％氫氧化鈉與3％氯化鈉的混合溶液中，在冰浴中加入環(huán)氧乙烷1.0ml，加完后，35℃反應(yīng)12小時。然后，再次在冰浴中加入環(huán)氧乙烷1.0ml，35℃反應(yīng)12小時，反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用1M鹽酸中和至pH＝7，丙酮沉淀，離心，透析，冷凍干燥，Sephadex G-25柱層析純化。
實施例8 牛膝多糖磷酸酯(鹽)的生物活性研究我們對不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(鹽)送檢生物活性測定，其結(jié)果如下1、牛膝多糖磷酸酯(鹽)對小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗

*表示試驗組與陰性對照組相比p＜0.012、牛膝多糖磷酸酯(鹽)對小鼠S-180肉癌(腋皮下接種)的試驗結(jié)果

*表示試驗組與陰性對照組相比p＜0.013、牛膝多糖磷酸酯(鹽)對荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影響

#為(效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞OD均值)-效應(yīng)細(xì)胞OD均值*表示試驗組與陰性對照組相比p＜0.0權(quán)利要求
1.一種牛膝多糖衍生物，其特征是包括牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖具有如下結(jié)構(gòu) 式中R＝H、PO3Na2或(CH2)kOH，其中k＝2～4，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q＝2～19。
2.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征是具有如下結(jié)構(gòu) 式中m、n＝2～19，m+n＝2～19，R如權(quán)利要求1所述。
3.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征是所述的PO3Na2取代度在0.1～2左右。
4.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是包括如下步驟(1)或步驟(2)(1)在0～100℃下，用(CH2)kO或X(CH2)kOH作為羥烷基化試劑，所述的k＝2～4，所述的X＝Cl、Br、I，在堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，其中牛膝多糖與羥烷基化試劑的摩爾比為1∶1～9，生成羥烷基牛膝多糖；(2)在0～100℃下，用三氯氧磷、二聚磷酸鈉、多聚磷酸或五氧化二磷為磷酸化試劑，在有機溶劑或堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，其中牛膝多糖與磷酸化試劑的摩爾比為1∶1～9，生成牛膝多糖磷酸酯(鹽)。
5.如權(quán)利要求4所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是所述的有機溶劑是乙腈、吡啶、二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷-5-烯、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一烷-7-烯或四氫呋喃。
6.如權(quán)利要求4所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是所述的堿性水溶液是無機堿的水溶液或無機堿和無機鹽的混合水溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是所述的無機堿的水溶液或無機堿和無機鹽的混合水溶液是NaOH的水溶液或NaOH、NaCl的混合水溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征在于所述的牛膝多糖衍生物具有抗腫瘤和增強免疫功能作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖，其是用磷酸化試劑或羥烷基化試劑，在相應(yīng)條件下與牛膝多糖生成不同取代度的牛膝多糖衍生物，這一系列不同取代度的牛膝多糖衍生物經(jīng)生物活性試驗表明，具有抗腫瘤及增強免疫功能的作用。
文檔編號C08B37/00GK1397565SQ0211098
公開日2003年2月19日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者田庚元, 陳曉明, 張健 申請人:中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所, 浙江京新藥業(yè)股份有限公司