提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]普魯蘭多糖作為一種溶解性良好，黏合度優(yōu)良的親水膠體，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣泛的使用范圍。然而普魯蘭多糖發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)量也較難控制。大多數(shù)氨基酸，維生素等生長(zhǎng)因子對(duì)于菌體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。而氨基酸與維生素的添加種類(lèi)和添加量不同，對(duì)于菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用也有較大區(qū)別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
[0004]本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是:
[0005]本發(fā)明的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0006](I)將出芽短梗霉活化后，接入種子培養(yǎng)基，OD6qq達(dá)到0.3以上，再將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中；
[0007](2)實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液OD6qq，當(dāng)0.2<0D6Q()<0.3，加入發(fā)酵液體積0.02-0.03 %復(fù)配劑I;當(dāng)0D_ >0.6,加入發(fā)酵液體積0.03-0.05 %的復(fù)配劑Π ;
[0008]其中復(fù)配劑I中包括谷氨酸、甲硫氨酸和維生素B2;
[0009]復(fù)配劑Π中包括絲氨酸和尿嘧啶核苷酸。
[0010]本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)措施:
[00??]種子培養(yǎng)基中:鹿糖90g/L、酵母粉4g/L、氯化鈉3g/L、無(wú)水硫酸錢(qián)lg/L、MgS04.7H20 0.5g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4.7H20 0.05g/L，pH6.5;發(fā)酵培養(yǎng)基中:蔗糖 150g/L、蛋白胨 7g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L,K2HPO4 6g/L,FeSO4.7H20 0.05g/L，初始pH6.0o
[0012]出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，于2012年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC N0.7055，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院生物研究所。
[0013]步驟(I)中，將出芽短梗霉菌株活化6?8h，接入種子培養(yǎng)基中，于28?32°C，180rpm，培養(yǎng)28?32h ;0D6QQ>0.3時(shí)，將其接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為OD6qq<0.5時(shí)，溫度控制在32°C，0D_2 0.5時(shí)，溫度控制在281:，通風(fēng)量1.0(V/V)，轉(zhuǎn)速為300rpm。
[0014]復(fù)配劑I中，按質(zhì)量比，谷氨酸:甲硫氨酸:維生素B2= 8:6:1;復(fù)配劑Π中，按質(zhì)量比，絲氨酸:尿啼啶核苷酸=1:1。
[0015]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0016]本發(fā)明的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法中，在發(fā)酵培養(yǎng)的遲緩期(0.2<0D6Q()<0.3)加入復(fù)配劑I，菌體生長(zhǎng)速率明顯增加，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間明顯縮短。由于其中谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)能分解成酮戊二酸，甲硫氨酸可分解成為琥珀酸輔酶A進(jìn)入中心代謝途徑，增強(qiáng)中心代謝，而維生素B2經(jīng)脫氫反應(yīng)生成黃素-腺嘌呤二核苷酸，黃素單核苷酸，增強(qiáng)氧呼吸鏈的電子傳遞，三者相互協(xié)作，提高胞內(nèi)產(chǎn)能，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600> 0.6)加入復(fù)配劑Π，底物轉(zhuǎn)化速度加快，多糖合成能力增強(qiáng)，產(chǎn)量明顯增高。由于復(fù)配劑Π中的絲氨酸能產(chǎn)生多糖合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而尿嘧啶核苷酸是普魯蘭多糖合成前體尿苷二磷酸葡萄糖的合成所用的重要前體物，故普魯蘭多糖產(chǎn)量有明顯增高，底物轉(zhuǎn)化率提尚O
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0018]本發(fā)明的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0019](I)將出芽短梗霉活化后，接入種子培養(yǎng)基，OD6qq達(dá)到0.3以上，再將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中；
[0020](2)實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液0D_，當(dāng)0.2<0D_<0.3，加入發(fā)酵液體積0.02-0.03 %復(fù)配劑I;當(dāng)0D_ >0.6,加入發(fā)酵液體積0.03-0.05 %的復(fù)配劑Π ;
[0021 ]其中復(fù)配劑I中包括谷氨酸、甲硫氨酸和維生素B2;
[0022]復(fù)配劑Π中包括絲氨酸和尿嘧啶核苷酸。
[0023]復(fù)配劑I中，按質(zhì)量比，谷氨酸:甲硫氨酸:維生素B2= 8:6:1;復(fù)配劑Π中，按質(zhì)量比，絲氨酸:尿啼啶核苷酸=1:1。
[0024]出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，于2012年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC N0.7055，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院生物研究所。
[0025]實(shí)施例1:
[0026](I)、種子培養(yǎng)基:鹿糖90g/L、酵母粉4g/L、氯化鈉3g/L、無(wú)水硫酸錢(qián)Ig/L、MgS04.7H20 0.5g/L,K2HPO4 3g/L、FeS04.7H20 0.05g/L，pH6.5;發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖 150g/L、蛋白胨7g/L、氯化鈉2.5g/L、MgS04.7H20 0.4g/L,K2HPO4 6g/L,FeSO4.7H20 0.05g/L，初始pH6.00
[0027](2)、將出芽短梗霉菌株活化6h，接入裝液量為10mL的500mL擋板瓶中，于30 °C，180rpm，培養(yǎng)29h，測(cè)得OD6qq為0.318。將其接入裝液量為3.51^的51^發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為006()()〈0.5時(shí)，溫度控制在32°(:，00_2 0.5時(shí)，溫度控制在28°(:，通風(fēng)量1.0(￥八)，轉(zhuǎn)速為300rpm。
[0028](3)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液OD6qq，0D_為0.219時(shí)加入0.03%的復(fù)配劑I，加入16h后，OD6Qo達(dá)到0.609，加入0.05%的復(fù)配劑Π，發(fā)酵總時(shí)間達(dá)到60h，殘?zhí)腔緸榱悖?8h結(jié)束發(fā)酵。
[0029](4)、取發(fā)酵液離心去菌體，上清以三倍體積乙醇醇沉，抽濾后，105°C恒溫烘干至恒重。測(cè)得粗普魯蘭多糖產(chǎn)量為81.45g/L。
[0030]實(shí)施例2:
[0031](I)、種子培養(yǎng)基:鹿糖90g/L、酵母粉4g/L、氯化鈉3g/L、無(wú)水硫酸錢(qián)lg/L、MgS04.7H20 0.5g/L,K2HPO4 3g/L、FeS04.7H20 0.05g/L，pH6.5;發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖 150g/L、蛋白胨7g/L、氯化鈉2.5g/L、MgS04.7H20 0.4g/L,K2HPO4 6g/L,FeSO4.7H20 0.05g/L，初始pH6.0ο
[0032](2)、將出芽短梗霉菌株活化7h后，接入種子培養(yǎng)基中，28°C，180rpm培養(yǎng)32h，測(cè)得0D600為0.301時(shí)，將種子以3%的接種量接入裝液量為18L的30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為OD600〈0.5時(shí)，溫度控制在321:，0D_2 0.5時(shí)，溫度控制在281:，通風(fēng)量1.0(V/V)，轉(zhuǎn)速為300rpm。
[0033](3)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液0D_，0D_為0.223時(shí)加入0.02%的復(fù)配劑I，加入16h后，OD600達(dá)到0.605,加入0.05%的復(fù)配劑Π，發(fā)酵總時(shí)間達(dá)到58h，殘?zhí)腔緸榱悖?0h結(jié)束發(fā)酵。
[0034](4)、取發(fā)酵液離心去菌體，上清以三倍體積乙醇醇沉，抽濾后，105°C恒溫烘干至恒重。測(cè)得粗普魯蘭多糖產(chǎn)量為88.79g/L。
[0035]實(shí)施例3:
[0036](I)、種子培養(yǎng)基:鹿糖90g/L、酵母粉4g/L、氯化鈉3g/L、無(wú)水硫酸錢(qián)lg/L、MgS04.7H20 0.5g/L,K2HPO4 3g/L、FeS04.7H20 0.05g/L，pH6.5;發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖 150g/L、蛋白胨7g/L、氯化鈉2.5g/L、MgS04.7H20 0.4g/L,K2HPO4 6g/L,FeSO4.7H20 0.05g/L，初始pH6.00
[0037](2)、將出芽短梗霉菌株活化8h后，接入一級(jí)種子中，32°C，180rpm培養(yǎng)28h，將一級(jí)種子以3%接種量接入二級(jí)種子，28°C，通風(fēng)量1.0(V/V)，轉(zhuǎn)速為300rpm培養(yǎng)16h，測(cè)得OD600為0.323，將其以3%的接種量接入裝液量為150L的200L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為OD6QtK0.5時(shí)，溫度控制在32°C，OD6qP 0.5時(shí)，溫度控制在28°C，通風(fēng)量1.0(V/V)，轉(zhuǎn)速為300rpm。
[0038](3)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液0D_，0D_為0.257時(shí)加入0.02%的復(fù)配劑I，加入18h后，OD600達(dá)到0.623，加入0.04%的復(fù)配劑Π，發(fā)酵總時(shí)間達(dá)到60h，殘?zhí)腔緸榱悖?5h結(jié)束發(fā)酵。
[0039](4)、取發(fā)酵液離心去菌體，上清以三倍體積乙醇醇沉，抽濾后，105°C恒溫烘干至恒重。測(cè)得粗普魯蘭多糖產(chǎn)量為92.79g/L。
[0040]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，然而，并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)然會(huì)利用揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾，成為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟: (I )將出芽短梗霉活化后，接入種子培養(yǎng)基，0D6QQ達(dá)到0.3以上，再將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中； (2)實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液OD6(X),當(dāng)0.2<OD6oo<0.3，加入發(fā)酵液體積0.02-0.03%復(fù)配劑I ；當(dāng)ODboo >0.6,加入發(fā)酵液體積0.03-0.05%的復(fù)配劑Π ； 其中復(fù)配劑I中包括谷氨酸、甲硫氨酸和維生素B2; 復(fù)配劑Π中包括絲氨酸和尿嘧啶核苷酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:種子培養(yǎng)基中:蔗糖90g/L、酵母粉 4g/L、氯化鈉3g/L、無(wú)水硫酸銨 lg/L、MgS04.7H20 0.5g/L,K2HPO4 3g/L、FeSO4.7Η20 0.058/1，？!16.5;發(fā)酵培養(yǎng)基中:蔗糖 150g/L、蛋白胨 7g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgSO4.7H2O0.4g/UK2HPO4 6g/L、FeS04.7H20 0.05g/L，初始pH6.0。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào) CGMCCN0.7055。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:步驟(I)中，將出芽短梗霉菌株活化6?8h，接入種子培養(yǎng)基中，于28?32°C，180rpm，培養(yǎng)28?32h ；OD6oo>0.3時(shí)，將其接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為0D6QQ<0.5時(shí)，溫度控制在320C，ODboo 2 0.5時(shí)，溫度控制在28°C，通風(fēng)量1.0(V/V)，轉(zhuǎn)速為300rpm。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:復(fù)配劑I中，按質(zhì)量比，谷氨酸:甲硫氨酸:維生素B2=S:6:1;復(fù)配劑Π中，按質(zhì)量比，絲氨酸:尿嘧啶核苷酸=1:1o
【專(zhuān)利摘要】一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，將出芽短梗霉活化后，接入種子培養(yǎng)基，OD600達(dá)到0.3以上，再將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中；實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液OD600，當(dāng)0.2＜OD600＜0.3，加入發(fā)酵液體積0.02-0.03%復(fù)配劑Ⅰ，使菌體生長(zhǎng)速率明顯增加，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間明顯縮短；當(dāng)OD600≥0.6，加入發(fā)酵液體積0.03-0.05%的復(fù)配劑Ⅱ，使底物轉(zhuǎn)化速度加快，多糖合成能力增強(qiáng)，產(chǎn)量明顯增高。CGMCCNO.705520121225
【IPC分類(lèi)】C12P19/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105624233
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510904313
【發(fā)明人】喬長(zhǎng)晟, 王萌, 李振海, 馬正旺, 孫芳艷
【申請(qǐng)人】天津北洋百川生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2015年12月9日