一種微生物轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明采用變形桿菌轉(zhuǎn)化L-色氨酸生產(chǎn)R-(-)-吲哚-3-乳酸，屬于工業(yè)微生物領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] R-(-)-吲哚-3-乳酸也叫 R-(-)_3-吲哚-乳酸，英文名為:R-(-)-indole-3_lactic acid、R_(-)-2_hydroxy-3-(lH-indol-3-yl)propanoic acid、R-(-)_Indolelactic acid、 R-(-)-Ind〇lelactate。它具有抗菌活性，同時也是植物激素吲哚乙酸的前體?；赗-(-)_ 吲哚-3-乳酸的重要應(yīng)用價值，本專利提出了采用變形桿菌屬微生物轉(zhuǎn)化L-色氨酸生產(chǎn)R-(-)-吲哚-3-乳酸的方案。L-色氨酸當(dāng)前主要通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，原料豐富易得。
[0003] 變形桿菌(Proteus)是廣泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐敗有機(jī)物及人或 動物的腸道內(nèi)的微生物?，F(xiàn)有5個種：普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、奇異變形桿菌 (Proteus mirabilis)、產(chǎn)黏變形桿菌(Proteus myxofaciens)、潘氏變形桿菌(Proteus penneri )和豪氏變形桿菌（Proteus hauseri )。變形桿菌具有強(qiáng)大的氧化脫氨能力 (Sherris Medical Microbiology，2004,4th ed.)，L_色氨酸可以被變形桿菌氧化脫氨成 Π 引噪-3_丙酮酸。
[0004] 相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為變形桿菌屬微生物只能將L-色氨酸氧化成吲哚-3-丙酮酸，而無法 進(jìn)一步還原成吲噪-3-乳酸（α-keto acids are novel siderophores in the genera proteus,providencia,and morganella and are produced by amino acid deaminases, 1993，Journal of bacteriology, 175(9) ,2727-2733)，這可能與之條件選擇不當(dāng)有關(guān)。
[0005] 本發(fā)明可通過變形桿菌屬微生物將L-色氨酸轉(zhuǎn)化成光學(xué)純的R-(-)_吲哚-3-乳 酸。吲哚-3-丙酮酸雖然是更為直接的底物，但價格較高，因此L-色氨酸是最佳的底物。變形 桿菌是一種兼性厭氧菌，可以在厭氧條件或好氧條件下轉(zhuǎn)化生產(chǎn)R-(-)_吲哚-3-乳酸，具有 高轉(zhuǎn)化率和高純度的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過培養(yǎng)變形桿菌屬微生物菌體，轉(zhuǎn)化L-色氨酸生產(chǎn)R-(-)_吲哚-3-乳酸， 技術(shù)方案如下：
[0007] 1、菌株
[0008] 本發(fā)明所用的菌株有購自美國ATCC菌種庫的Proteus mirabilis ATCC 29906、 Proteus myxofaciens ATCC 19692、Proteus hauseri ATCC 700826、Proteus penneri ATCC 33519、Proteus mirabilis ATCC 25933、Proteus mirabilis ATCC 33946、Proteus vulgaris ATCC 19181、Proteus vulgaris ATCC 27972以及購自中國工業(yè)微生物菌種保藏 管理中心的Proteus vulgaris CICC 10401、Proteus mirabilis CICC 22928〇
[0009] 2、菌體培養(yǎng)
[0010] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:碳源0_50g/L，氮源0-50g/L，磷酸氫二銨0-2g/L，磷酸二 氫鉀〇-lg/L，硫酸鎂〇-〇. 5g/L，硫酸亞鐵〇-〇. 5g/L，氯化納0_5g/L，可調(diào)節(jié)pH至2-8，可也pH 自然;接種量為5-20%，發(fā)酵溫度為20-40°C，發(fā)酵周期為24-72小時。種子和發(fā)酵均采用此 培養(yǎng)基。
[0011] 用于培養(yǎng)菌種的碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、半乳糖、甘油。培養(yǎng) 用氮源可以是硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿等有機(jī)氮源。碳源和氮 源可以是一種或多種的組合。
[0012] 液態(tài)培養(yǎng)菌體的過程可以采用厭氧或好氧方式。
[0013] 3、轉(zhuǎn)化產(chǎn)R-(-)-B引噪-3-乳酸 [0014]轉(zhuǎn)化過程采用的方案有2種：
[0015] (1)細(xì)胞的液態(tài)培養(yǎng)過程，將L-色氨酸底物加入上述的培養(yǎng)體系中；L-色氨酸添加 量為 〇-l〇g/L。
[0016] (2)將液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物離心去除發(fā)酵液得到菌體，將菌體放入含有L-色氨酸底物 的水溶液反應(yīng)體系中進(jìn)行;轉(zhuǎn)化過程溫度20-40 °C，pH 2-8，轉(zhuǎn)化時間1 -24小時。轉(zhuǎn)化液中L-色氨酸起始濃度為〇. l-l〇g/L。
[0017] 4、樣品的檢測分析
[0018]轉(zhuǎn)化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色譜儀檢測分析，色譜條件為:流 動相是甲醇-0.1%甲酸水(40:60)、采用漢邦1^8代8(：18色譜柱(4.6\250111111，54111)，流速 0.6ml/min、柱溫30 °C、進(jìn)樣量20μ1、檢測器波長200nm。
[0019] 采用江蘇漢邦科技有限公司的DAC-HB50制備色譜柱制備轉(zhuǎn)化樣品，制備色譜條件 為:流動相50 %甲醇、柱溫自然、流速3ml/min、進(jìn)樣量5ml。樣品達(dá)到色譜純99.9%，反復(fù)進(jìn) 樣分離得到的產(chǎn)品于50°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸干。稱取制備得到的樣品0.5g，溶于去離子水中并 定容至50ml，采用日本愛宕AP-300全自動旋光儀測定放光度。進(jìn)一步采Varian Gemini 2000(VnmrS 600MHz，600/54/ASP)分析樣品的核磁數(shù)據(jù)。樣品進(jìn)一步采用UPLC-QT0F-MS法 分析分子量，儀器為Waters MALDI SYNAPT QTOF MS液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1
[0021] 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析測定。
[0022]配制培養(yǎng)基如下：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉 Sg/LdOOml三角瓶中裝液量 為 100ml，共50瓶，120°C，20分鐘滅菌。取Proteus mirabilis ATCC 29906甘油管種子液lmL 接種，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。培養(yǎng)24后，將發(fā)酵液離心（轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，時間 10min)，去除上清液獲得菌體，離心獲得的菌體用無菌水清洗兩遍。取20g濕菌體放入L-色 氨酸濃度為l〇g/L的1000ml溶液中，混合均勻。于37°C搖床振蕩（100rpm)48小時后，100°C水 浴加熱3分鐘殺滅菌體。再離心（轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，時間10min)去除菌體，得到轉(zhuǎn)化后的上清 液。液相分析R-(-)_吲哚-3-乳酸濃度為4.2g/L，剩余L-色氨酸濃度為4.6g/L。采用制備色 譜得到2.9g純品。
[0023] 旋光儀分析其旋光度為[αβ0 = -5.30。核磁數(shù)據(jù)為：1H匪R(D20 600ΜΗζ):δ 7.75(lH,d J 7.9Hz),7.46(lH,d,J 8.1Hz),7.21(2H,m,J 7.6Hz),7.13(1H,d,J 0.98, 7.49Hz),4.32(lH,dd,J 4.29,7.65),3.25(lH,ddd,J 4.26,4.85Hz),3.14(lH,dd,J 7.65, 14.86泡）。13(：匪R(D20,600MHz) :δ183·86，138·79，129·95，126·95，124·43，121·61， 121.42,114.23,113.51,74.32,32.710
[0024] 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為：（-ESI,negative mode)m/z:204.0[M-l]。
[0025] 根據(jù)以上數(shù)據(jù)，確定其分子及光學(xué)結(jié)構(gòu)與R-(-)_吲哚-3-乳酸完全一致。
[0026] 實施例2
[0027]好氧培養(yǎng)與厭培養(yǎng)的比較。配制培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，蛋白胨20g/L，磷酸氫二銨 lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸亞鐵0.3g/L;起始pH和發(fā)酵過程pH均為自然 500ml三角瓶中裝液量為100ml，共2瓶，120°C，20分鐘滅菌。
[0028] 取Proteus mirabilis CICC 22928甘油管種子液lmL接種1瓶，于厭氧培養(yǎng)箱中35 °C培養(yǎng)72小時，離心獲得的菌體用無菌水清洗兩遍。取O.lg濕菌體放入L-色氨酸濃度為5g/ L的4ml溶液中，混合均勻，厭氧培養(yǎng)箱中35°C靜置轉(zhuǎn)化24小時后，100°C水浴加熱3分鐘殺滅 菌體。再離心(轉(zhuǎn)速l〇〇〇〇rpm，時間1 Omin)去除菌體，得到轉(zhuǎn)化后的上清液。液相分析R-(-)-吲哚-3-乳酸濃度為2.3g/L，剩余L-色氨酸濃度為1.6g/L。
[0029] 取Proteus mirabilis CICC 22928甘油管