免疫抑制劑雷帕霉素在提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量中的應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及免疫抑制劑雷帕霉素在提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量中的應(yīng)用，還涉及利用免疫抑制劑雷帕霉素提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]出芽短梗霉(Aureobasidum pulIulan)是一類酵母真菌，具有菌絲體和酵母樣兩種形態(tài)。該菌種在自然界中存在較為廣泛。通常出芽短梗霉發(fā)酵過程會同時產(chǎn)生聚蘋果酸和普魯蘭多糖兩個大分子代謝產(chǎn)物。聚蘋果酸和普魯蘭多糖的合成共同的前體有葡萄糖-1-磷酸，如碳代謝流進入TCA循環(huán)或者乙酸循環(huán)積累蘋果酸，將最終聚合生成聚蘋果酸；而碳代謝流經(jīng)葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化UDPG-葡萄糖，將最終合成普魯蘭多糖。
[0003]現(xiàn)有的專利報道希望能同時生產(chǎn)兩種高分子聚合物，如喬長晟等一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法(專利授權(quán)號ZL201110430053.3)，但是由于兩種聚合物的具有不同的物理性質(zhì)和產(chǎn)品附加值，同時生產(chǎn)兩種高分子聚合物，會對下游提取純化造成困難。因此，從生產(chǎn)實踐上，更希望獲得單一目標(biāo)的聚合物產(chǎn)品?，F(xiàn)有技術(shù)報道了0.1%,0.5%和I %的吐溫-80能夠提高出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖的能力；但是未見其他物質(zhì)提高普魯蘭多糖的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有聚蘋果酸和普魯蘭多糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)的不足，經(jīng)過大量研宄發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉生長受氮源調(diào)節(jié)，且在氮限制條件下有利于聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成。通常微生物適應(yīng)外界營養(yǎng)環(huán)境完成的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯修飾等過程，主要依賴于營養(yǎng)感應(yīng)和信號傳導(dǎo)，其中雷帕霉素革El蛋白(Target of rapamycin,TOR)信號途徑被認為是感應(yīng)氮信號的重要途徑，TOR信號通路在真核生物感受外界營養(yǎng)物質(zhì)和逆境脅迫、調(diào)控細胞生長中起重要作用，通過響應(yīng)外界氮及氨基酸、滲透壓、熱、氧化應(yīng)激、以及碳饑餓等信號，調(diào)節(jié)翻譯、轉(zhuǎn)錄、核糖體生物合成、營養(yǎng)物質(zhì)的運轉(zhuǎn)以及自噬作用調(diào)控細胞生長。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白(TOR)的特異性抑制劑，本發(fā)明采用雷帕霉素靶蛋白(TOR)特異性抑制劑雷帕霉素，通過抑制TOR途徑靶蛋白的活性，調(diào)節(jié)代謝流向普魯蘭多糖合成方向進行，實現(xiàn)對出芽短梗霉合成的聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成的代謝流轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)高效合成普魯蘭多糖。本發(fā)明使用的產(chǎn)聚蘋果酸菌種為Aureobasidiumpullulans CCTCC M 2012223，或者來源于美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心(NRRL)，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)等機構(gòu)保藏或自然分離的Aureobasidium 屬菌種。
[0005]優(yōu)選的，所述雷帕霉素的濃度為5?80mg/L ;更優(yōu)選的，所述雷帕霉素的濃度為10 ?70mg/Lo
[0006]本發(fā)明還公開了利用免疫抑制劑雷帕霉素提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，將出芽短梗霉活化后在含5?80mg/L雷帕霉素的條件下發(fā)酵。
[0007]優(yōu)選的，所述發(fā)酵是在溫度為23-30°C、轉(zhuǎn)速為180-300rpm條件下培養(yǎng)96-150小時；
[0008]或在溫度為23-30 °C、轉(zhuǎn)速為300-1000rpm、通氣比1:0.8-1:1.6條件下培養(yǎng)72-200 小時。
[0009]更優(yōu)選的，所述發(fā)酵是在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)96小時；
[0010]或在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為600rpm、通氣比1: 1.2條件下培養(yǎng)96小時。
[0011]優(yōu)選的，所述發(fā)酵使用的培養(yǎng)基各組分如下:糖50-200g/L，硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉 l_5g/L，KH2PO40.005-0.3g/L，ZnSO40.005-0.3g/L，MgSO40.005-0.3g/L，玉米漿0.05-3g/L 和 CaC0310-50g/L，溶劑為水。
[0012]更優(yōu)選的，所述出芽短梗霉活化的方法是將出芽短梗霉接種于種子培養(yǎng)基中，然后在溫度為23-30°C、轉(zhuǎn)速180-300rpm條件下培養(yǎng)36-96小時；所述種子培養(yǎng)基各組分如下:葡萄糖 40-100g/L、硝酸銨 l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L、MgSO40.005-0.3g/L、玉米漿 0.05_3g/L 和 CaC0310_50g/L，溶劑為水。
[0013]更優(yōu)選的，所述出芽短梗霉活化的方法是將出芽短梗霉接種于種子培養(yǎng)基中，然后在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)96小時；所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖90g/L、硝酸鉀 3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、玉米漿 2g/L 和 CaC0320g/L，溶劑為水。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明根據(jù)出芽短梗霉合成聚蘋果酸和普魯蘭多糖的合成特點，采用雷帕霉素靶蛋白特異性抑制劑雷帕霉素，建立操作簡單的定向調(diào)控策略，可以實現(xiàn)對聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成的碳代謝流流向調(diào)節(jié)，抑制聚蘋果酸的合成，轉(zhuǎn)向大幅度合成普魯蘭多糖。同時添加此范圍濃度的雷帕霉素對出芽短梗霉細胞生長不會造成抑制。本發(fā)明具有發(fā)酵成本低、產(chǎn)量高、技術(shù)經(jīng)濟性強等優(yōu)點，可應(yīng)用于普魯蘭多糖的工業(yè)實際放大生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0015]下面將結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]本發(fā)明使用的種子培養(yǎng)基為:葡萄糖40_100g/L、硝酸銨l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L ；MgS040.005-0.3g/L、玉米漿 0.05-0.3g/L 和CaC0310-50g/L ;種子培養(yǎng)條件是采用500mL搖瓶裝液量30_120mL，在溫度為23_30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180-300rpm條件下培養(yǎng)時間為36-96小時。
[0017]本發(fā)明使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖、木糖或其他可利用糖50_200g/L、氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉 l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L ；MgSO40.005-0.3g/L、玉米漿 0.05-3g/L、CaC0310_50g/L。發(fā)酵培養(yǎng)條件是采用 500mL 搖瓶裝液量30-120mL，培養(yǎng)溫度為23_30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180_300rpm，培養(yǎng)時間為96-150小時；5L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝為裝液量3L，培養(yǎng)溫度23-30°C，轉(zhuǎn)速300-1000rpm，通氣比1: 0.8-1:1.6,培養(yǎng)時間為60-200小時。
[0018]實施例1
[0019]取保藏號為CCTCC NO:M 2012223 的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接種于含50mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中(搖瓶體積為500mL)，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)48小時；然后取培養(yǎng)液按接種量為10%接種于500mL搖瓶中，搖瓶含有50mL含10mg/L的雷帕霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)120小時；然后檢測培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，本實施例聚蘋果酸的產(chǎn)量為48.0lg/L，普魯蘭多糖產(chǎn)量為38.6g/L，出芽短梗霉細胞量為19.5g/L。
[0020]同時按照與上述相同的方法進行對比試驗，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基中未加入雷帕霉素，發(fā)酵結(jié)束檢測培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，實驗組與對比實施實驗相比，聚蘋果酸產(chǎn)量比對照組降低了 28.7%;普魯蘭多糖產(chǎn)量比對照組提高了 69%，出芽短梗霉細胞量比對照組提高了 21.87%。
[0021]本實施例中種子培養(yǎng)基為:葡萄糖60g/L、硝酸銨3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.lg/L、MgSO40.15g/L、玉米漿 2g/L 和 CaC0320g/L，溶劑為水。
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖90g/L、硫酸銨 3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、3 玉米漿 lg/L 和 CaC030g/L，溶劑為水。
[0023]實施例2
[0024]取保藏號為CCTCC NO:M 2012223 的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接種于含50mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中(搖瓶體積為500mL)，在溫度為23°C，轉(zhuǎn)速為300rpm條件下培養(yǎng)96小時；然后取培養(yǎng)液按接種量為10%接種于500mL搖瓶中，搖瓶含有50mL含20mg/L的雷帕霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后在溫度為23°C、轉(zhuǎn)速為300rpm條件下培養(yǎng)150小時；然后檢測培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，本實施例聚蘋果酸的產(chǎn)量為47.9g/L，普魯蘭多糖產(chǎn)量為39.8g/L，出芽短梗霉細胞量為21g/L。
[0025]同時按照與上述相同的方法進行對比試驗，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基中未加入雷帕霉素，發(fā)酵結(jié)束檢測培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，實驗組與對比實施實驗相比，聚蘋果酸產(chǎn)量比對照組降低了 28.9%;普魯蘭多糖產(chǎn)量比對照組提高了 74.2%，出芽短梗霉細胞量比對照組提高了 31.3%。
[0026]本實施例中種子培養(yǎng)基為:葡萄糖40g/L、硝酸銨lg/L、KH2PO40.3g/L、ZnSO40.3g/L、MgSO40.3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaC0350g/L，溶劑為水。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖50g/L、硫酸銨 lg/L, KH2PO40.3g/L、ZnSO40.3g/L、MgSO40.3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaC