一種酶法提取降血糖人參多糖及其在食品和藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥植物多糖的生物活性領(lǐng)域，具體涉及一種多次提取人參多糖的方 法及其在制備降血糖藥物和食品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)的日益發(fā)展，人們的生活水平日益提高，我國糖尿病的發(fā)病率也在逐年 上升，糖尿病用藥市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到數(shù)百億人民幣。降血糖藥物的開發(fā)具有非常好的應(yīng)用前景。
[0003] 糖尿病主要分1型糖尿?。╰ypeldiabetes)和2型糖尿病（type2diabetes)，1型 糖尿病和2型糖尿病均有不同程度的胰島beta細(xì)胞損傷?，F(xiàn)有的降血糖藥物，比如胰島 素，格列本脲，羅格列酮，阿卡波糖等，均具有不同程度的副作用，并且不能從根本上改善胰 腺功能。
[0004] 人參被人們稱為"百草之王"，是聞名遐邇的"東北三寶"（人參、紹皮、鹿茸）之一， 是馳名中外、老幼皆知的名貴藥材。多糖是人參的有效成分之一，現(xiàn)有的研究表明，人參多 糖具有很好的降血糖活性，但是人參多糖的提取方法交雜亂，收率低，人參多糖的價(jià)值沒有 得到足夠的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提高人參多糖的產(chǎn)率，發(fā)掘人參多糖的降血糖活性組分。本發(fā)明可以 通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0006] 1. -級(jí)人參多糖的提取：100°C條件下分別經(jīng)蒸餾水煮提人參根4小時(shí)，3小時(shí)及 2小時(shí)。提取物經(jīng)4層紗布過濾，合并三次提取所得濾液，離心去除其中的不溶物。上清液 加入4倍體積的95%乙醇沉淀過夜，離心，收集沉淀，干燥后得到一級(jí)人參多糖。
[0007] 2.二級(jí)人參多糖的提取：上一步剩余人參根殘?jiān)紫燃尤胝麴s水，沸水煮沸 30min，冷卻至50°C后加入α-淀粉酶，保持50°C提取24小時(shí)。提取物經(jīng)4層紗布過濾，收 集提取液，用截留分子量為3500Da的透析膜透析。收集透析膜內(nèi)液，濃縮，干燥后得到二級(jí) 人參多糖。
[0008] 3.三級(jí)人參多糖的提?。荷弦徊绞Ｓ嗟娜藚⒏鶜?jiān)屑尤?0mM的EDTA二鈉鹽水 溶液，60°C提取3小時(shí)，按照相同條件共提取2次。提取物經(jīng)4層紗布過濾，合并2次提取 所得濾液，用截留分子量為3500Da的透析膜透析。收集透析膜內(nèi)液，濃縮，干燥后得到三級(jí) 人參多糖。
[0009] 4.四級(jí)人參多糖的提取：上一步剩余的人參根殘?jiān)屑尤?. 05M Na2COyK溶液， 4°C提取16小時(shí)，提取物經(jīng)4層紗布過濾，殘?jiān)又?5°C提取16小時(shí)。合并2次的提取液， 50%鹽酸中，截留分子量為3500Da的透析膜透析。收集透析膜內(nèi)液，濃縮，干燥后得到四級(jí) 人參多糖。
[0010] 5.五級(jí)人參多糖的提?。荷弦徊绞Ｓ嗟娜藚⒏鶜?jiān)屑尤隝M KOH水溶液，25°C提 取12小時(shí)。提取物經(jīng)4層紗布過濾，所得提取液用50%鹽酸中和，截留分子量為3500Da的 透析膜透析后，收集透析膜內(nèi)液，濃縮，干燥后得到五級(jí)人參多糖。
[0011] 6.六級(jí)人參多糖的提?。荷弦徊绞Ｓ嗟娜藚⒏鶜?jiān)屑尤?M KOH水溶液，25°C提 取18小時(shí)。提取物經(jīng)4層紗布過濾，所得提取液用50%鹽酸中和，截留分子量為3500Da的 透析膜透析后，收集透析膜內(nèi)液，濃縮，干燥后得到六級(jí)人參多糖。
[0012] 步驟2中，α -淀粉酶的使用劑量為終濃度50至250mg/L。
[0013] 以上步驟中，干燥的方法是指乙醇沉淀常規(guī)干燥，冰凍干燥，或者噴霧干燥。
[0014] 通過HPLC法檢測(cè)單糖組成，各級(jí)人參多糖的收率以及單糖組成如表1所示。
[0015] 表1各級(jí)人參多糖對(duì)beta胰島細(xì)胞活力的影響（data=mean土 S. D.)
[0016]
[0017] Glc :葡萄糖；GalA :半乳糖醒酸；Gal :半乳糖；Ara :阿拉伯糖；Xyl :木糖；Rha :鼠 李糖；Man :甘露糖；一，未檢測(cè)到。
[0018] 人參多糖改善beta胰島細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞水平）
[0019] 培養(yǎng)胰島Beta細(xì)胞RIN-m5F，培養(yǎng)基RPMI1640,10%胎牛血清。鋪96孔板，IO 4個(gè) 細(xì)胞/孔，24小時(shí)后，加不同濃度人參多糖樣品，設(shè)4復(fù)孔。48小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活 力。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行Dunnett' s MultipleComparison Test,檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 (Omg/ml)統(tǒng)計(jì)顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1 :
[0020] 表2各級(jí)人參多糖對(duì)beta胰島細(xì)胞活力的影響（data=mean土 S. D.)
[0021]
[0022] 與 Omg/ml 對(duì)比，* 表示 Ρ〈0· 05。
[0023] 從表2可知，各級(jí)人參多糖均具有一定改善beta胰島細(xì)胞活力的活性，具有開發(fā) 為降血糖藥物的潛力，其中一級(jí)人參多糖，二級(jí)人參多糖和三級(jí)人參多糖的最佳濃度均為 lmg/ml，四級(jí)人參多糖的最佳濃度為5mg/ml，五級(jí)人參多糖和六級(jí)人參多糖的最佳濃度均 為 0· lmg/ml〇
[0024] 人參多糖降血糖實(shí)驗(yàn)(活體水平）
[0025] C57小鼠，8周齡，空腹12小時(shí)，腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。72h 后，尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖值，取血糖值大于15. OOmmol/L的小鼠為糖尿病小鼠。
[0026] 糖尿病模型小鼠按血糖值分為6組，每組10只，陰性對(duì)照組灌胃蒸餾水，陽性對(duì)照 組灌胃l〇mg/kg劑量的阿卡波糖，其余4組分別灌胃不同劑量的人參多糖，劑量分別為10、 50、200和400mg/kg，每天灌胃給藥1次，連續(xù)15天。末次給藥后，將所有各組小鼠空腹12h， 尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖值。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行Dunnett' S Multiple Comparison Test，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組統(tǒng)計(jì)顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1至表6。
[0027] 表3 -級(jí)人參多糖對(duì)STZ糖尿病小鼠血糖值影響（n=10)
[0028]
[0029] 注：與陰性對(duì)照組比較，表示p < 0. 05
[0030] 從表3可知，灌胃15天后，50, 200和400mg/kg的一級(jí)人參多糖通過灌胃給藥能夠 顯著降低糖尿病模型小鼠的血糖，說明一級(jí)人參多糖在口服的情況下具有降血糖的作用。
[0031] 表4二級(jí)人參多糖對(duì)STZ糖尿病小鼠血糖值影響（n=10)
[0032]
[0033] 注：與陰性對(duì)照組比較，表示p < 0. 05
[0034] 從表4可知，灌胃15天后，200與400mg/kg的二級(jí)人參多糖通過灌胃給藥能夠顯 著降低糖尿病模型小鼠的血糖，說明二級(jí)人參多糖在口服的情況下具有降血糖的作用。
[0035] 表5三級(jí)人參多糖對(duì)STZ糖尿病小鼠血糖值影響（n=10)
[0036]
[0037] 注：與陰性對(duì)照組比較，表示p < 0. 05
[0038] 從表5可知，灌胃15天后，50mg/kg，200與400mg/kg的三級(jí)人參多糖通過灌胃給 藥能