一種從地龍中提取的cat酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及具有生物活性的酶，具體設(shè)及一種從地龍中提取的CAT酶。
【背景技術(shù)】
[0002] CAT酶，即過氧化氨酶，是催化過氧化氨分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化 物體內(nèi)。CAT酶是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%。CAT酶存在 于所有已知的動物的各個組織中，特別在肝臟中W高濃度存在。
[0003] 地龍，是一味傳統(tǒng)的中藥材，在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中有著悠久的應(yīng)用歷史，因其作為 藥物的安全性好，且具有良好的抗氧化功能，是一種提取CAT酶的理想原料。專利文獻 CN101570743A公開了一種W地龍為原料制備的復合多酶及其制備方法，該復合多酶中包含 CAT酶；其制備方法W地龍為材料，通過緩沖液低溫保護勻漿，離屯、分離，洗漆，加硫酸 錠沉淀分離，透析去除SO%，分子篩層析，超濾濃縮、低溫真空干燥即得；純化制備的復合 多酶，在生物大分子分解、底物利用方面，具有高效、多功能的特點。經(jīng)比較研究，現(xiàn)有技 術(shù)提供的從地龍中提取CAT酶的工藝仍存在產(chǎn)能有限、過程耗時長、效率低等一系列缺陷， 且透析去除SO%的過程會在一定程度上影響CAT酶的純度及活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種從地龍中提取的高活性CAT酶。
[0005] 本發(fā)明W地龍作為提取CAT酶的原料，地龍具有易于養(yǎng)殖、來源廣泛、生物安全性 高的特點；并且地龍中CAT酶含量較高，適于規(guī)?；a(chǎn)CAT酶。
[0006] 本發(fā)明提供了 一種從地龍中提取的CAT酶（過氧化氨酶），所述CAT酶由包括W下 步驟的方法制備而成：
[0007] 1)將地龍浸泡于pH4. 8~5. 2的0. 015~0. 025mol/L巧樣酸緩沖液中，分散成勻 漿液，離屯、后取上清，即得粗酶液；
[000引 2)將硫酸錠加入步驟1)所得粗酶液中，靜置，離屯、后收集沉淀；
[0009] 3)將步驟2)所得沉淀溶解于抑7. 0~7. 4的0. 01~0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液 中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱Se地adex G-25頂端，用本步驟所述磯酸鹽緩沖 液進行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸錠的洗脫液，濃縮，得濃縮液；
[0010] 4)在步驟3)所得濃縮液中加入化C1，得到化C1濃度為0. 4~0. 6mol/L的溶液， 將所得溶液加入平衡好的金屬馨合親和柱頂端，用抑5. 8~6. 2的0. 015~0. 025mol/L 磯酸鹽緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，即得CAT酶。
[0011] 本發(fā)明所述步驟1)中；所述地龍為市售的中藥材地龍；所述巧樣酸緩沖液的濃度 優(yōu)選為0. 02mol/L，抑值優(yōu)選為5. 0 ;地龍與巧樣酸緩沖液的質(zhì)量體積比為1 ;1~20,優(yōu)選 為1 ;3~5,此處地龍的質(zhì)量單位為g，巧樣酸緩沖液的體積單位為ml ;將地龍分散成勻漿 液的設(shè)備選用常規(guī)的高速剪切機，高速剪切機的操作溫度為-5~20°C，優(yōu)選為0~4°C， 轉(zhuǎn)速為300~12000;rpm，優(yōu)選為6000~8000;rpm，剪切時間為0. 5~20min，優(yōu)選為3~ lOmin ;所述離屯、的溫度為-5~20°C，優(yōu)選為0~4°C，離屯、速度為300~120(K)巧m，優(yōu)選 為1000~5000巧111，離屯、時間為0. 5~20min，優(yōu)選為5~15min。
[0012] 本發(fā)明所述步驟2)需要進行兩次硫酸錠沉淀，具體為：將硫酸錠W質(zhì)量體積比 0. 3~0. 5:1溶解于步驟2)所得粗酶液中，此處硫酸錠的質(zhì)量單位為g，粗酶液的體積單位 為ml，靜置20~40min，在0~4°C、7500~8500巧m條件下離屯、10~20min，分離上清液， 收集沉淀；在所得上清液中W質(zhì)量體積比0. 7~0. 9:1加入硫酸錠，此處硫酸錠的質(zhì)量單位 為g，上清液的體積單位為ml,靜置20~40min，在0~4°C、8500~9500巧m條件下離屯、 25~35min，收集沉淀；合并兩次收集所得的沉淀。
[0013] 本發(fā)明所述步驟3)采用葡聚糖凝膠柱Se地adex G-25對酶溶液進行純化，凝膠 柱的平衡和流動相的洗脫均為常規(guī)操作；所述磯酸鹽緩沖液為磯酸二氨鐘-磯酸氨二鐘緩 沖液；緩沖液的濃度優(yōu)選為0. 〇15mol/L，抑值優(yōu)選為7. 2 ;步驟3)所得沉淀W質(zhì)量體積比 1:1~5溶解于磯酸鹽緩沖液中，此處沉淀的質(zhì)量單位為g，磯酸鹽緩沖液體積的單位為ml ; 所述濃縮優(yōu)選為聚己二醇濃縮法，所述聚己二醇優(yōu)選為PEG4000,濃縮步驟為常規(guī)操作。該 步驟能快速獲得不含硫酸錠的蛋白溶液，避免了常規(guī)透析除鹽方法可能造成的目標產(chǎn)物損 失和繁冗過程。
[0014] 本發(fā)明選用比色法檢測洗脫液中的硫酸錠和蛋白質(zhì)，W確定洗脫純化時收集的起 點和終點；其中步驟3)采用奈氏試劑比色法鑒定硫酸錠，步驟為：取1滴洗脫液，滴在白色 比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑混合，若出現(xiàn)棟黃色沉淀則表明洗脫液中含有硫酸錠；步驟 3)和步驟4) W 20%橫基水楊酸為指示劑檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)，步驟為：取1滴洗脫液， 滴在黑色比色磁盤中，加入1滴20%橫基水楊酸混合，若出現(xiàn)白色絮狀沉淀則表明洗脫液 中含有蛋白質(zhì)。
[0015] 本發(fā)明所述步驟4)中，W磯酸二氨鐘-磯酸氨二鐘緩沖液作為洗脫液，選擇金屬 馨合親和柱進行CAT酶的純化；具體而言，所馨合的金屬離子選自銅、鋒、鐵、鑲離子等常規(guī) 的馨合用金屬離子；緩沖液的濃度優(yōu)選為0. 〇2mol/l，pH值優(yōu)選為6. 0 ;所述濃縮優(yōu)選為聚 己二醇濃縮法，所述聚己二醇優(yōu)選為PEG4000,濃縮步驟為常規(guī)操作。該步驟通過金屬親和 層析法進行蛋白純化，能夠快速、安全、環(huán)保地獲得純化后的CAT酶，并且避免CAT酶的活性 損失。
[0016] 作為本發(fā)明的最優(yōu)選方案，所述CAT酶由包括W下步驟的方法制備而成：
[0017] 1)將地龍W質(zhì)量體積比為1 ;3浸泡于冰浴后的抑5. 0、0. 02mol/L巧樣酸緩沖液 中，用高速剪切機將地龍分散成勻漿液，操作條件為〇°C、30(K)巧mUOmin ;在0°C、300化pm 條件下離屯、15min，取上清，即得粗酶液；
[001引 2)將硫酸錠W質(zhì)量體積比0.4:1溶解于步驟1)所得粗酶液中，靜置30min，在 0°C、800化pm條件下離屯、15min，分離上清液，收集沉淀；將硫酸錠W質(zhì)量體積比0. 8:1加入 所得上清液中，靜置30min，在0°C、900化pm條件下離屯、30min，收集沉淀；將兩次收集所得 的沉淀合并；
[0019] 3)將步驟2)所得沉淀W質(zhì)量體積比1 ;5溶解于抑7. 2的0. 015mol/L磯酸二氨 鐘-磯酸氨二鐘緩沖液中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱Se地adex G-25頂端， 用本步驟所述磯酸鹽緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸錠的洗脫液，用PEG4000 濃縮，得濃縮液；
[0020] 4)在步驟3)所得濃縮液中加入化Cl，得到化Cl濃度為0. 5mol/L的溶液，將所得 溶液加入平衡好的鑲離子馨合親和柱頂端，用P冊.〇、〇. 〇2mol/L磯酸二氨鐘-磯酸氨二鐘 緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液，用PEG4000濃縮，冷凍干燥，即得CAT酶。
[0021] 為了保證制備得到的CAT酶的活性，本發(fā)明各個步驟的操作溫度均優(yōu)選為0~ rc。
[0022] 本發(fā)明進一步保護所述從地龍中提取的CAT酶在制備化妝品中的應(yīng)用。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的從地龍中提取的CAT酶具有良好的生物活性，具 有廣闊的應(yīng)用價值。同時，發(fā)明提供的CAT酶的原料地龍為傳統(tǒng)中藥材，來源豐富，安全、環(huán) 保，所述制備CAT酶的方法可擴大應(yīng)用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0024] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0025] 本發(fā)明各實施例中，洗脫液中硫酸錠的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在白色 比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑混合，若出現(xiàn)棟黃色沉淀則表明洗脫液中含有硫酸錠；洗脫 液中蛋白質(zhì)的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在黑色比色磁盤中，加入1滴20%橫基水 楊酸混合，若出現(xiàn)白色絮狀沉淀則表明洗脫液中含有蛋白質(zhì)。實施例1
[0026] CAT酶由W下步驟制備而成：
[0027] 1)將lOOg地龍浸泡于300ml冰浴后的抑5. 0、0. 02mol/L巧樣酸緩沖液中，用高速 剪切機將地龍分散成勻漿液，操作條件為〇°C、300化pm、lOmin ;在0°C、300化pm條件下離屯、 15min，取上清，即得粗酶液370ml ;
[002引 2)將148g硫酸錠溶解于步驟1)所得粗酶液中，靜置30min，在0°C、800化pm條 件下離屯、15min，分離上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入145g硫酸錠，靜置30min，在 4°C、900化pm條件下離屯、30min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并，得沉淀3. 15g ;
[0029] 3)將步驟2)所得沉淀溶解于抑7. 2、0. 015mol/L磯酸二氨鐘-磯酸氨二鐘緩沖 液10ml中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱Se地adex G-25頂端，用本步驟所述磯 酸鹽緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸錠的洗脫液，用PEG4000濃縮，得濃縮液 15ml ；
[0030] 4)在步驟3)所得濃縮液中加入0. 44gNaCl溶解，將所得溶液加入平衡好的鑲離子 馨合親和柱頂端，用P冊.〇、〇. 〇2mol/L磯酸二氨鐘-磯酸氨二鐘緩沖液進行洗脫，收集含有 蛋白質(zhì)的洗脫液，用陽G4000濃縮得濃縮液，冷凍干燥，得白色粉末30.1 mg。
[0031] 經(jīng)蛋白凝膠電泳SDS-PAGE檢測，所得產(chǎn)品分子量與市售CAT酶標準品相同，證明 產(chǎn)物為CAT酶。
[0032] 實施例2
[0033] CAT酶由W下步驟制備而成：
[0034] 1)將lOOg地龍浸泡于500ml冰浴后的pH4. 8、0. 025mol/L巧樣酸緩沖液中，用高 速剪切機將地龍分散成勻漿液，操作條件為4°C、80(K)巧m、3min ;在0°C、100化pm條件下離 屯、15min，取上清，即得粗酶液580ml ;
[0035] 2)將290g硫酸錠溶解于步驟1)所得粗酶液中，靜置40min，在4°C