海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體設(shè)及一種低溫葡 萄糖氧化酶海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E. C 1. 1. 3. 4,簡(jiǎn)寫為GOD)在有氧條件下專一 性催化0-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氨（Ahmed H等，Eur Biophys J，1998)。GOD主 要分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，其中動(dòng)、植物組織中GOD含量有限，而微生物由于其自 身具有來(lái)源廣泛、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)god的主要來(lái)源，目前，GOD的主要生產(chǎn)菌株為 黑曲霉和青霉（王志新等，中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007)。早期GOD的生產(chǎn)主要從動(dòng)、植物體內(nèi)提取， 但該方法很難得到純度高的G0D，而微生物發(fā)酵法具有發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，提取步驟相對(duì) 簡(jiǎn)易，酶的純化工藝穩(wěn)定，生產(chǎn)不受原料來(lái)源影響等特點(diǎn)，且生產(chǎn)的GOD在安全性方面具有 更大優(yōu)勢(shì)，適用于批量生產(chǎn)，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，還可W與食品生產(chǎn)、飼料生產(chǎn)和醫(yī)藥檢測(cè)材 料聯(lián)合在一起，具有廣闊市場(chǎng)應(yīng)用前景（邢良英等，食品科技，2007 ;張?jiān)绖?lì)等，飼料工業(yè)， 2011)。國(guó)外對(duì)GOD的研究比較早，主要在菌種篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、酶的分離純化、酶學(xué) 特性W及GOD基因的克隆與表達(dá)等方面都有深入研究（Sisak C等，Enzyme and Microbial Technology, 2006 ;Mislovicova D 等，Process Biochemistry, 2007;)。相比國(guó)外，我國(guó)有 關(guān)GOD的研究工作起步較晚（朱運(yùn)平等，中國(guó)食品添加劑，2013)目前我國(guó)雖有GOD產(chǎn)品出 售，但酶制劑純度及活性普遍較低，穩(wěn)定性差，生產(chǎn)成本較高，主要依賴進(jìn)口（韓建春等，食 品科學(xué)，2011)。
[0003] 低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過(guò)程的時(shí)間并省卻 昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶的 活力喪失，而低溫或適溫處理不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)（陸小波等，生物技術(shù)通報(bào)，2006 ;曾胤 新等，中國(guó)生物工程雜志，2003)低溫GOD利用低溫酶上述優(yōu)點(diǎn)使其具有非常廣闊的開(kāi)發(fā)潛 力和應(yīng)用前景。低溫GOD將為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如疾病、資源、能源危機(jī)W 及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇，具有非常廣闊的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外未 見(jiàn)低溫GOD的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法，該方法 主要是微生物經(jīng)過(guò)低溫馴化后，在10~16°c液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法，該種 生產(chǎn)方法獲得的低溫葡萄糖氧化酶粗酶液活性可W達(dá)到227. lU/ml，如再經(jīng)過(guò)分離和純化， 可W得到不同濃度和純度的酶制劑。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶 的方法具體包括W下步驟：
[0005] (1)將能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種先活化，再經(jīng)過(guò)逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到 低，25°C - 22°C - 20°C - 18°C - 16°C - 14°C 一 12°C - 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良 好，當(dāng)菌種能在低溫下穩(wěn)定生長(zhǎng)即馴化結(jié)束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基為；葡萄糖20. 0~ 50.0 g，蛋白腺 1. 0 ~5. Og，（畑4)25〇4 2. 0 ~3. Og，CaC〇3 1. 0 ~5. Og，pH 值為自然，于 103kpa、121°C高壓蒸氣滅菌30min ;
[0006] 所述的能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中屯、（CGMCC)，菌種編號(hào)；1. 10601或1. 6446或1. 10904 ;
[0007] 似按常規(guī)方法將步驟（1)中低溫馴化后的葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng) 基中于10~16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；所述的液體種子培養(yǎng)基 為；蛋白腺7.0~12.0g，牛肉膏2.0~7.0g，化C1 8.0~ll.Og，抑值為自然，于103kpa、 121°C高壓蒸氣滅菌30min ;
[000引 （3)將液體二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3~9%的接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在 10~16°C培養(yǎng)72~14化時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶結(jié)束；所述的液體產(chǎn)酶 培養(yǎng)基為：葡萄糖75. 0~85. Og,蛋白腺1. 0~5. Og，KH2P04 1. 4~2. 0g，M拆04.7&0 0. 7~ 0. 8g，KCl 0. 2 ~0. 6g,抑值為 5. 6,于 103kpa、12rC高壓蒸氣滅菌 30min;
[0009] (4)將做的發(fā)酵液在4, 000~8, 00化pm離屯、收集液體，收集到的上清液即為粗 酶液；
[0010] (5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可W將（4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離 純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫葡萄糖氧化酶制劑。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟（1)中產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種活化培養(yǎng)基為；蛋白腺10.0 g，酵 母膏5. Og,化C1 10.0 g,瓊脂20.0 g，蒸饋水1.0L，抑值為自然，于103kpa、121°C高壓蒸氣 滅菌30min。
[0012] 本發(fā)明中使用的能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種初期活化和生長(zhǎng)條件按中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、提供的說(shuō)明進(jìn)行。葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌菌株先活化、 再經(jīng)過(guò)逐級(jí)低溫馴化后發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶時(shí)按本發(fā)明產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)，低溫馴 化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10~25^%甘油制成的菌懸液、在-80°C條件下 可W長(zhǎng)期保藏。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0014] (1)本發(fā)明利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶，經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可 使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理均不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)，特別是低溫脂肪氧合酶 在低溫下仍具有高酶活力及高催化效率，有效改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量；
[0015] (2)本發(fā)明方法簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，縮短加工時(shí)間并從根本上省卻中溫酶使用中加 熱、冷卻設(shè)備的環(huán)節(jié)，省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；
[0016] (3)本發(fā)明方法生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低，無(wú)論在食 品工業(yè)、飼料行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、紡織漂染等行業(yè)還是生物燃料、生物傳感器及生物巧片等新 興領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不限制本發(fā)明。如無(wú)特殊說(shuō) 明，本發(fā)明所用原料均市售可得。
[001引實(shí)施例1
[0019] (1)培養(yǎng)基制備
[0020] ①菌種活化培養(yǎng)基；蛋白腺10.0 g，酵母膏5. Og，化Cl 10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸饋水 1. 抑值為自然，于103kpa、121°C高壓蒸氣滅菌30min ;
[0021] ②菌種低溫馴化培養(yǎng)基；葡萄糖20.0 g，蛋白腺1. Og，（畑4) 2SO4 2. Og，CaC〇3 1. Og,抑值為自然，于103kpa、121°C高壓蒸氣滅菌30min ;
[002引⑨液體種子培養(yǎng)基；蛋白腺7. Og，牛肉膏2. Og，化C1 8. Og，pH值為自然，于 103kpa、121°C高壓蒸氣滅菌30min ;
[002引④液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖75. Og，蛋白腺1. Og，K&POJ. 4g，MgS04 ? 7&0 0. 7g，KCl 0. 2g，抑值為 5. 6,于 103kpa、12rC高壓蒸氣滅菌 30min;
[0024] (2)將產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中屯、（CGMCC) 提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；
[0025] (3)將（2)中活化好的菌種于低溫馴化培養(yǎng)基中逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到 低，25°C - 22°C - 20°C - 18°C - 16°C - 14°C一 12°C - 10°C，馴化 8 天左右，使其在低溫環(huán) 境中生長(zhǎng)良好，當(dāng)菌種能在低溫下穩(wěn)定生長(zhǎng)即馴化結(jié)束；
[0026] (4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于 10~12°C培養(yǎng)48~7化后，按5vt%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和 二級(jí)種子；
[0027] 妨將（4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3~5%的接種量接入10L的液體產(chǎn)酶 培養(yǎng)基中，在10~12°C培養(yǎng)120~14化時(shí)，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶結(jié) 束；
[002引 做將妨的發(fā)酵液在4, 000~8, 00化pm離屯、收集液體，收集到的