一種利用24孔板篩選潤(rùn)滑油降解菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種利用24孔板篩選潤(rùn)滑油降解菌的方法涉及一種功能型微生物的篩選方法，屬于環(huán)境污染物生物降解領(lǐng)域。針對(duì)潤(rùn)滑油降解微生物的篩選，可以利用24孔板評(píng)價(jià)在菌種分離時(shí)獲取的單菌落降解潤(rùn)滑油的能力，特別適用于大規(guī)模的菌種篩選。該方法利用在油水兩相體系中，油膜的變化和細(xì)胞光密度的變化兩個(gè)指標(biāo)同時(shí)表征菌種對(duì)潤(rùn)滑油的降解能力，可以從大量的初篩菌株中優(yōu)選出降解能力優(yōu)良的菌種，為進(jìn)一步開(kāi)展菌種降解能力研究提供優(yōu)化的菌種資源。該發(fā)明適用于油水兩相實(shí)驗(yàn)體系，有效地減少了傳統(tǒng)的以繁瑣的搖瓶降解實(shí)驗(yàn)和含油量檢測(cè)為評(píng)價(jià)依據(jù)的表征方法，大幅度地減少了工作量和實(shí)驗(yàn)耗材、縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
【專利說(shuō)明】一種利用24孔板篩選潤(rùn)滑油降解菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種功能型微生物的篩選方法，適合于微生物在油水兩相反應(yīng)體系中的功能特性表征，特別適用于大規(guī)模的菌種篩選，在環(huán)境微生物生物降解研究方面可以廣泛應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鑒于全球能源匱乏，以石油為原料加工而成的潤(rùn)滑油在生產(chǎn)加工、儲(chǔ)運(yùn)、使用過(guò)程中不可避免地會(huì)污染水土環(huán)境。在我國(guó)，潤(rùn)滑油消耗量已達(dá)到世界第二，且消耗量在逐年攀升。不同于燃油，潤(rùn)滑油在使用過(guò)程中因受到理化等因素的影響將導(dǎo)致品質(zhì)下降，無(wú)法繼續(xù)使用，而形成廢油。受到能源需求緊張和嚴(yán)格的環(huán)保限制必須對(duì)廢潤(rùn)滑油進(jìn)行回收處理。在這部分廢舊潤(rùn)滑油中，有近半數(shù)無(wú)法回收利用，由于包括廢油處理企業(yè)在內(nèi)的廢潤(rùn)滑油產(chǎn)生單位缺乏有效的末端治理環(huán)節(jié)，而將其大量排入環(huán)境中，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞。因此，利用生物降解技術(shù)進(jìn)行潤(rùn)滑油污染的生物治理對(duì)于廢油處理行業(yè)以及生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
[0003]近年來(lái)，利用種群、功能多樣化的微生物，針對(duì)廢潤(rùn)滑油及其組分開(kāi)展生物降解研究的報(bào)道越來(lái)越多。在這些研究中，高活力菌種資源的獲取成為各類相關(guān)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于對(duì)于潤(rùn)滑油及其組分含量的檢測(cè)手段較為繁瑣，在大規(guī)模菌種篩選中工作量大，甚至難以在平行條件下進(jìn)行菌種降解能力的評(píng)價(jià)。對(duì)此，本發(fā)明開(kāi)發(fā)出一種利用24孔板篩選高活力潤(rùn)滑油降解菌種的方法。這種方法的理論基礎(chǔ)建立在如下兩個(gè)方面:其一，建立在油和水可以形成油水兩相，且界面膜較為清晰，可以依賴于油膜在菌種作用下的消退情況來(lái)評(píng)價(jià)菌種對(duì)潤(rùn)滑油的降解能力；其二，依賴于潤(rùn)滑油被生物降解時(shí)生物量增加，同時(shí)，24孔板的每個(gè)參與實(shí)驗(yàn)的孔內(nèi)，可以提供至少2mL以上的細(xì)胞發(fā)酵液，滿足分光光度法檢測(cè)對(duì)液體量的要求，因此，可以利用細(xì)胞光密度檢測(cè)來(lái)作為另一判斷依據(jù)。上述兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)具有操作簡(jiǎn)單便捷、快速的優(yōu)點(diǎn)，極大地減少了菌種大規(guī)模篩選的工作量，綜合評(píng)價(jià)二者可以較為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)菌種的潤(rùn)滑油生物降解特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明涉及一種利用24孔板篩選潤(rùn)滑油降解菌種的方法。在油水兩相體系中，潤(rùn)滑油在無(wú)機(jī)鹽選擇性培養(yǎng)基表面形成油膜，油水界面層清晰可見(jiàn)，生物降解作用則主要發(fā)生在油水兩相間，實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞利用潤(rùn)滑油的結(jié)果可以使油膜顏色從中間開(kāi)始逐漸由黃色或近黑色變成乳白色，反之，若油膜未發(fā)生改變則認(rèn)為該菌種不能較好地利用潤(rùn)滑油，即為非目的菌株。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，大幅度地減少了工作負(fù)荷。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的進(jìn)一步描寫(xiě):
在5-7天的生物降解周期內(nèi)，潤(rùn)滑油不斷被利用，油膜逐漸消退，中心乳白色區(qū)域逐漸向邊緣擴(kuò)散，直至整個(gè)微孔內(nèi)除邊緣隱約可見(jiàn)潤(rùn)滑油外其它部分顏色完全消失，以此來(lái)作為菌種降解潤(rùn)滑油的評(píng)價(jià)依據(jù) 之一。對(duì)于降解能力較弱但可以利用潤(rùn)滑油的菌種，在此體系以及生物降解周期內(nèi)，油膜顏色不消退或僅在中央部分消退，則初步判定該菌種不具備優(yōu)良的潤(rùn)滑油降解能力。不過(guò)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該方法可能存在一定實(shí)驗(yàn)誤差，為此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以平行設(shè)置3個(gè)以上平行樣品參與實(shí)驗(yàn)，這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不會(huì)產(chǎn)生過(guò)大的工作負(fù)荷。在進(jìn)行降解能力評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)于降解能力良好者以表示，降解能力一般者以表示，降解效果不好，油膜基本不消退者以“ + ”表示，最終的菌種篩選結(jié)果則可以根據(jù)大規(guī)模菌種篩選的總體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行確定。比如，在某次大規(guī)模菌種篩選中，幾株菌在降解實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出3個(gè)-”，則可以考慮將降解效果低于2個(gè)和I個(gè)的菌種淘汰；而若出現(xiàn)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的菌種數(shù)量少，不能滿足工作需要，甚至未出現(xiàn)最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則可以保留2個(gè)和I個(gè)的菌種?？傊?，菌種的最終篩選結(jié)果可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)工作需要靈活判定。
[0006]在此實(shí)驗(yàn)體系中，另外一個(gè)評(píng)價(jià)菌種降解能力的依據(jù)是細(xì)胞光密度值。實(shí)驗(yàn)表明，在多數(shù)情況下，細(xì)胞光密度OD6tltl值的變化趨勢(shì)與油膜的變化趨勢(shì)一致，即油膜消退意味著生物降解作用的發(fā)生，說(shuō)明菌種具有潤(rùn)滑油降解能力，更多的底物被消耗且其中部分用以合成新細(xì)胞，而且，隨著油膜的逐漸消退，0D_值逐漸增加。不過(guò)，反復(fù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，少部分實(shí)驗(yàn)中油膜的消退存在著實(shí)驗(yàn)誤差，反饋在OD6tltl值上，沒(méi)有表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，而且這種現(xiàn)象總是發(fā)生在油膜消退實(shí)驗(yàn)平行性不好的樣本中，此時(shí)，應(yīng)考慮淘汰菌種，或根據(jù)實(shí)際情況重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，亦可采用定量化檢測(cè)方法予以驗(yàn)證。
[0007]上述實(shí)驗(yàn)可以實(shí)施的前提在于，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，24孔板的每個(gè)微孔的最大裝液量可以達(dá)到3mL，無(wú)機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基的用量可以控制在2.5mL，利用微量移液器可以有效移取
2.0mL以上的發(fā)酵液，利用最為常規(guī)的Icm比色杯可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞濃度的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用常規(guī)的Icm比色杯進(jìn)行分光檢測(cè)時(shí)，其最少裝液量為1.7mL，高于此裝液量檢測(cè)得到的光密度值結(jié)果一致，因此，利用細(xì)胞光密度檢測(cè)可以提高24孔板法篩選評(píng)價(jià)潤(rùn)滑油降解菌種的準(zhǔn)確性。
[0008]【具體實(shí)施方式】來(lái)自斜面的菌種接種至IOmL富集培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)液培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期(不需嚴(yán)格控制)時(shí)，以1%_2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的富集培養(yǎng)基中，在30-37°C，200rpm條件下培養(yǎng)至0D_=1.2 + 0.0`2 `;同時(shí)，在滅菌的24孔板內(nèi)加入2.5mL無(wú)機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基；取上述制備的種子液200 μ L接種到孔內(nèi)培養(yǎng)基中，再立即加入300 μ L潤(rùn)滑油；將24孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30-37°C下培養(yǎng)5-7天，每天觀察記錄油膜變化情況，待培養(yǎng)結(jié)束后用移液器將移液槍頭插于培養(yǎng)基底部移取2mL (不得少于1.7mL)發(fā)酵液，在600nm波長(zhǎng)下利用分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞密度；根據(jù)油膜消退和細(xì)胞密度評(píng)價(jià)菌株對(duì)潤(rùn)滑油降解能力。
【權(quán)利要求】
1.利用24孔板開(kāi)發(fā)出一種表征微生物降解潤(rùn)滑油能力的方法，來(lái)自斜面的菌種經(jīng)2次LB培養(yǎng)基活化后，控制第二次活化的細(xì)胞培養(yǎng)液0D_=1.2±0.02，取ImL次級(jí)培養(yǎng)液在6000rpm下離心IOmin,棄上清液后用lmLpH=7.2的磷酸緩沖溶液重懸、洗漆細(xì)胞,重復(fù)離心、洗滌操作一次后，利用200 μ L的上述磷酸緩沖液制備成靜止細(xì)胞，將新制備的靜止細(xì)胞作為接種體接種到含2.5mL無(wú)機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基的24孔板的微孔內(nèi)，再向微孔內(nèi)添加300 μ L潤(rùn)滑油，制備成菌種生物降解體系，每株菌做3個(gè)平行的微孔實(shí)驗(yàn)，將24孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中于37°C恒溫培養(yǎng)6-8天，每天觀察微孔表面油膜變化，以黃色或近黑色油膜中心出現(xiàn)乳白色視為潤(rùn)滑油開(kāi)始被降解，且中心乳白色區(qū)域由內(nèi)向外逐漸擴(kuò)展?jié)櫥皖伾俗鳛閮?yōu)良菌株的判斷依據(jù)，同時(shí)，用微量移液器吸取2mL細(xì)胞發(fā)酵液利用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度，根據(jù)油膜消退和光密度值評(píng)價(jià)微生物降解潤(rùn)滑油的能力。
2.權(quán)利要求1 請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案為菌種降解潤(rùn)滑油能力的評(píng)價(jià)方法。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103820522SQ201410085920
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】姜巖, 張賢明, 楊穎
申請(qǐng)人:重慶工商大學(xué)