一種新型水稻d-乳酸脫氫酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型水稻D-乳酸脫氫酶（OsD-LDH）及其編碼基因與應用，屬于植物生物工程領域。新型水稻D-乳酸脫氫酶是細胞色素C依賴的D-乳酸脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；該D-乳酸脫氫酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明的OsD-LDH基因在植物體內參與脅迫條件下產(chǎn)生的丙酮醛代謝，可用于提高植物耐受逆境脅迫和培育高抗逆性植物。本發(fā)明的OsD-LDH基因還可以作為篩選標記，以丙酮醛或D-乳酸作為篩選壓力應用于轉基因篩選中。本發(fā)明的D-乳酸脫氫酶可用來培育高抗逆性的植物及用于轉基因篩選，對增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及改進轉基因方法具有重要的意義。
【專利說明】一種新型水稻D-乳酸脫氫酶及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物工程領域，具體涉及一種新型水稻D-乳酸脫氫酶及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，水稻的生育期內經(jīng)常會遇到各種生物或非生物脅迫等逆境條件。植物在這些逆境條件下會產(chǎn)生丙酮醛，丙酮醛是一種突變劑和基因毒性劑，濃度過高會抑制細胞生長(Ray S，Dutta S, Haider J, RayM(1994)Inhibition of electron flow through complex I of the mitochondrialrespiratory chain of Ehrlich ascites carcinoma cells by methylglyoxal.Biochem J.303:69 - 72)，植物中主要通過乙二醛酶系統(tǒng)來對丙酮醛進行脫毒，最終產(chǎn)生 D-乳酸(Yadav SKj Singla-Pareek SLj Sopory SK(2008)An overview on therole of methylglyoxal and glyoxalases in plants.Drug metabolism and druginteractions23:51-68)。乳酸對細胞也具有低毒性(Bar-Even A, Flamholz A, Noor Ej MiloR(2012)Rethinking glycolysis:on the biochemical logic of metabolic pathways.NatChem Biol8:509-517)，需要通過乳酸脫氫酶代謝除去或者通過單羧酸鹽轉運蛋白轉移到細胞外(Enerson BE，Drewes LR(2003)Molecular features, regulation, and functionof monocarboxylate transporters:1mplications for drug delivery.Journal ofPharmaceutical Sciences92:1531_1544;Bonen A, Heynen M，Hatta H(2006)Distributionof monocarboxylate transporters MCTl_MCT8in rat tissues and human skeletalmuscle.Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism31:31-39)。
[0003]D-乳酸脫氫酶根據(jù)電子受體類型不同，分為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴和非 NAD+ 依賴的乳酸脫氫酶兩大類(Engqvist Mj Drincovich MF，F(xiàn)liigge U-1j MaurinoVG(2009)Two d-2-hydroxy-acid dehydrogenases in Arabidopsis thaliana withcatalytic capacities to participate in the last reactions of the methylglyoxalandβ -oxidation pathways.Journal of Biological Chemistry284:25026_25037)。水稻細胞色素C依賴的D-乳酸脫氫酶(OsD-LDH)屬于后者的一種，是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氧化酶類，具有FAD結合結構域和氧化結構域。在水稻中，OsD-LDH在細胞色素C存在情況下負責催化D-乳酸轉化為丙酮酸，丙酮酸可以進入三羧酸循環(huán)以被重新利用，從而減少D-乳酸的積累，降低對細胞的毒害作用。
[0004]近年來，全球氣候條件惡化，自然災害頻發(fā)，鹽堿地增多，水澇和干旱時有發(fā)生，病蟲害在局部地區(qū)有加劇趨勢；且隨著工業(yè)化的進程，土地受到重金屬如銅、鎘等離子污染嚴重，這些情況都會對作物的生長產(chǎn)生嚴重影響，最終造成農(nóng)作物減產(chǎn)，影響農(nóng)民收入和國家糧食安全。在植物中過量表達D-乳酸脫氫酶可以幫助其消除在逆境脅迫條件下產(chǎn)生的D-乳酸，進而有助于順利 降解丙酮醛，這對于減輕植物在上述逆境脅迫條件下所受的傷害并促進農(nóng)作物增產(chǎn)具有重要意義。[0005]轉基因作物近年遭受到非常大的爭議，其中一個重要原因是人們對于外源基因轉入糧食作物是否安全的擔心，如果轉入序列完全為植物內源序列，可消除此種擔心，因此，建立以內源序列為篩選標記的轉基因篩選方法就顯得非常必要和迫切。擬南芥中D-乳酸脫氫酶轉化擬南芥后在特定濃度的D-乳酸篩選條件下，可以顯著區(qū)分轉基因幼苗和非轉基因幼苗(Wienstroer J, Engqvist MK, Kunz HH, Flugge UI, Maurino VG (2012) D-Lactatedehydrogenase as a marker gene allows positive selection of transgenic plants.FEBS Lett586:36-40)。因此，將水稻D-乳酸脫氫酶置于組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子等的驅動下，在特定濃度的丙酮醛或D-乳酸的篩選壓力下，可區(qū)分轉基因組織和非轉基因組織，這具有非常好的應用潛力。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于提供一種新型水稻D-乳酸脫氫酶。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供所述新型水稻D-乳酸脫氫酶的編碼基因。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供所述新型水稻D-乳酸脫氫酶或其編碼基因的應用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0010]一種新型水稻D-乳酸脫氫酶為細胞色素C依賴的D-乳酸脫氫酶，簡稱為OsD-LDH，來源于秈稻93-11，是如下I)或2)所述的蛋白質:
[0011]I)由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，共由561個氨基酸組成；
[0012]2) SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列經(jīng)過I個至不超過20個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與D-乳酸脫氫相關的衍生蛋白質。
[0013]所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶的編碼基因如下1)、2)或3):
[0014]1)其核苷酸序列是SEQ ID N0.2所示的序列；
[0015]2)與上述1)中序列具有90%以上同源性且編碼上述新型D-乳酸脫氫酶的核苷酸分子;
[0016]3)在嚴謹條件下可與上述I)中序列限定的DNA序列雜交且編碼上述新型D-乳酸脫氫酶的核苷酸分子；
[0017]其中，上述嚴謹條件可為在6XSSC/0.5%SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用2XSSC/0.1%SDS 和 1XSSC/0.1%SDS 各洗膜一次。
[0018]上述OsD-LDH蛋白可人工合成，也可先獲得其編碼基因，再進行生物表達得到。上述OsD-LDH蛋白的編碼基因可通過將SEQ ID N0.2所示的DNA序列中缺失或添加I個至20個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個至60個堿基對的錯義突變，和/或在其5’端或3’添加如組氨酸標簽(His)、原癌基因標簽(myc)、旗幟標簽(FLAG)、谷胱甘肽巰基轉移酶標簽(GST)等商用標簽序列得到。
[0019]擴增OsD-LDH基因全長或部分片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020]含有上述OsD-LDH基因的重組載體、重組菌和轉基因細胞系等也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021]可用現(xiàn)有植物表達載體如pCAMBIA系列、pBI121等載體及其他衍生植物表達載體構建含有OsD-LDH基因的植物重組表達載體。攜帶有OsD-LDH的植物表達載體可通過農(nóng)桿菌介導、基因槍、顯微注射和直接DNA轉化等遺傳轉化方法轉入植物細胞或組織中。[0022]使用OsD-LDH基因構建植物重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異性或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其他啟動子結合使用；此外，還可使用增強子，包括轉錄增強子和翻譯增強子，以及絕緣子調控序列。為了便于對轉基因的細胞、組織或植株進行鑒定和篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的:可產(chǎn)生顏色變化的酶或熒光標記的基因如β葡萄糖苷酸媒(GUS)基因、熒光素酶基因或熒光蛋白基因等，可供篩選的抗生素標記如潮霉素、慶大霉素、卡那霉素基因標記或除草劑篩選標記基因或抗化學試劑標記基因如抗除莠劑基因等。
[0023]上述新型水稻D-乳酸脫氫酶或其編碼基因有如下方面的應用:降解D-乳酸，在植物組織、細胞中促進丙酮醛代謝，提高植物逆境脅迫耐受性，轉基因篩選等。
[0024]一種提高植物耐受逆境脅迫的方法，包含如下步驟:將上述新型水稻D-乳酸脫氫酶編碼基因轉入植物中獲得轉基因植物，然后將所述轉基因植物種植于逆境條件下，其抗逆性獲得提高。所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物，如棉花、小麥、水稻、玉米、大豆、油菜等；所述的逆境條件包括高鹽、重金屬離子、干旱、淹水、低溫或高溫等逆境條件。
[0025]一種轉基因篩選標記，為上述新型水稻D-乳酸脫氫酶編碼基因。
[0026]一種新型轉基因篩選方法，是將上述新型水稻D-乳酸脫氫酶編碼基因作為篩選標記，在轉基因篩選階段或得到轉基因種子后幼苗萌發(fā)篩選階段等，添加一定濃度的丙酮醛或D-乳酸作為篩選壓力，區(qū)分轉基因與非轉基因組織或植株，獲得轉基因材料。
[0027]本發(fā)明通過生物信息學方法從水稻中克隆了一個細胞色素C依賴的D-乳酸脫氫酶(OsD-LDH)，通過原核表達純化鑒定其酶學動力特征，并對其在水稻各組織中的表達模式進行了檢測，轉入OsD-LDH基因的水稻抗逆性提高，本發(fā)明的D-乳酸脫氫酶可用來培育高抗逆性的植物及用于轉基因篩選，對增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及改進轉基因方法具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】`
[0028]圖1為反轉錄PCR擴增的OsD-LDH基因的電泳圖。1:幼根，2:幼葉。
[0029]圖2A為原核表達GST標簽純化的OsD-LDH蛋白電泳圖；圖2B為蛋白質印跡法鑒定的純化蛋白。N1:未誘導菌；IN:誘導菌；S:菌體破碎后上清；P:菌體破碎后沉淀；FT:流穿液；E:洗脫蛋白；kDa:千道爾頓。
[0030]圖3為純化的OsD-LDH蛋白活性鑒定。D-Lac:D_乳酸；K3P04:50mM磷酸鉀溶液；GST:對照谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白。
[0031]圖4為純化的OsD-LDH蛋白動力學參數(shù)檢測。Km:米氏常數(shù)；Vmax:最大反應速度。
[0032]圖5為熒光定量PCR檢測秈稻93-11中OsD-LDH的表達。Cal:愈傷組織；GS:萌發(fā)7天種子；Sh:幼苗；Rt:萌發(fā)14天幼根；FL:成熟劍葉(源劍葉)；SL:未完全展開劍葉(庫劍葉)；SinkFLS:庫劍葉鞘；SourceFLS:源劍葉鞘；Nd:節(jié)；InterN:節(jié)間；Pan5/10/20:5/10/20cm長幼穗；SC1:抽穗后3天穎殼；An:花藥；S0:柱頭和子房；SC2:開花后15天穎殼；Imse:開花后 15 天種子；Carl/3/5/7/10/15/20:開花 1/3/5/7/10/15/20 天的穗。
[0033]圖6為高濃度丙酮醛處理下轉基因植株I周的生長狀況。WT:野生型中花11 ;CK:空載體轉基因對照；0ED-LDH:過表達OsD-LDH轉基因株系；0ED-LDH_GFP:過表達OsD-LDH與綠色熒光蛋白GFP融合蛋白的轉基因株系；MS:Murashige和Skoog植物生長培養(yǎng)基；MG:丙酮醛。【具體實施方式】
[0034]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于以下實施例。本發(fā)明的下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。
[0035]實施例1、水稻OsD-LDH基因的克隆
[0036]取秈稻93-11幼葉和幼根,液氮研磨,按照Trizol法(Invitrogen)提取總RNA,用DNase I (Fermentas)消化混雜的DNA ;氯仿萃取去除DNase I后，以OligocKT) 18為引物，用Superscript II (Invitrogen)反轉錄得到cDNA。以上實驗操作均按照試劑盒說明書進行。
[0037]以擬南芥D-乳酸脫氫酶(AtD-LDH)序列(Engqvist M, Drincovich MF, FliiggeU-1, Maurino VG(2009)Two d-2-hydroxy-acid dehydrogenases in Arabidopsisthaliana with catalytic capacities to participate in the last reactionsof the methylglyoxal andβ—oxidation pathways.Journal of BiologicalChemistry284:25026-25037) BLAST水稻基因組序列，獲得對應的同源序列，設計引物以cDNA為模板，用高保真擴增酶Pfu進行RT-PCR擴增OsD-LDH，所用引物序列見下表:
[0038]
【權利要求】
1.一種新型水稻D-乳酸脫氫酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列經(jīng)過I個至不超過20個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與D-乳酸脫氫相關的衍生蛋白質。
2.權利要求1所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶的編碼基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，或為 A)與SEQID N0.2具有90%以上同源性且編碼權利要求1所述D-乳酸脫氫酶的核苷酸分子，或為 B)在嚴謹條件下可與SEQID N0.2限定的DNA序列雜交的核苷酸分子。
3.一種引物，其特征在于:用于擴增權利要求2所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶的編碼基因全長或部分片段。
4.一種重組載體、重組菌或轉基因細胞系，其特征在于:含有權利要求2所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶的編碼基因。
5.權利要求1所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶或權利要求2所述的編碼基因在降解D-乳酸中的應用。
6.權利要求1所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶或權利要求2所述的編碼基因在植物組織、細胞中促進丙酮醛代謝及逆境脅迫中的應用。
7.一種提高植物耐受逆境脅迫的方法，其特征在于包含如下步驟:將權利要求2所述的編碼基因轉入植物中，得到抗逆能力提高的轉基因植物。
8.權利要 求1所述的新型水稻D-乳酸脫氫酶或權利要求2所述的編碼基因在轉基因篩選中的應用。
9.一種轉基因篩選標記，其特征在于:為權利要求2所述的編碼基因。
10.一種新型轉基因篩選方法，其特征在于:以權利要求2所述的編碼基因作為篩選標記，以丙酮醛或D-乳酸作為篩選壓力，可區(qū)分轉基因與非轉基因組織或植株，獲得相應轉基因組織及植株。
【文檔編號】C12N15/82GK103820409SQ201410085498
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】安保光, 李陽生, 鄧小龍, 蘭杰 申請人:武漢大學