一種楊梅苗木是否攜帶凋萎病菌的快速分子檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種楊梅苗木是否攜帶凋萎病菌的快速分子檢測方法，其特征在于，該方法包括：使用熒光定量PCR對楊梅組織的DNA進行擴增，如果在擴增18-22個循環(huán)時出現(xiàn)熒光，則表示楊梅組織中含有異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌，如果在擴增循環(huán)18-22個循環(huán)時不出現(xiàn)熒光，則表示楊梅組織中不含有異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌。利用該技術可以很好的區(qū)分攜帶凋萎病菌和健康的楊梅樹，并快速準確。
CGMCC No.8713
2014.01.10

CGMCC No.8714
2014.01.10
【專利說明】一種楊梅苗木是否攜帶凋萎病菌的快速分子檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原菌的分子診斷領域，特別的，屬于如何采用RT-PCR并結合特 異的引物檢測楊梅樹中是否攜帶凋萎病菌的方法。

【背景技術】
[0002] 楊梅（Myrica rubra Sieb. Et Zucc.)是我國南方特有的珍稀水果，果實甜酸適 口，風味獨特，在國內外享有盛譽，因其顯著的經(jīng)濟與生態(tài)效益，已成為浙江省主要水果種 類，其產(chǎn)值已穩(wěn)居各類水果首位。楊梅凋萎病是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種病害，發(fā)病初期，楊梅 部分嫩梢干枯，隨病情加重，嫩梢干枯數(shù)量逐漸增多并蔓延至全樹，發(fā)病后3-5年整株死 亡。楊梅凋萎病在浙江省楊梅主產(chǎn)區(qū)呈迅速蔓延趨勢，嚴重影響楊梅產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。引 起楊梅凋萎病的病原菌為異色擬盤多毛孢（Pestalotiopsis versicolor)和小孢擬盤多毛 抱（P. microspora)。
[0003] 在植物病害檢測中，采用分子手段進行病原菌DNA的大量擴增來檢測植物病害目 前被大量使用，這種檢測方法不僅快速，而且特異性比較高。比傳統(tǒng)的分離方法檢測要快 速，而且準確。楊梅凋萎病病原菌為異色擬盤多毛孢和小孢擬盤多毛孢，凋萎病給楊梅樹可 以帶來毀滅性的災害。這就需要提供快速、準確的檢測楊梅樹是否攜帶凋萎病菌的方法。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明實驗小組驚訝的發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)的普通PCR技術不能對健康或攜帶凋萎病 病菌(異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢)的楊梅樹進行準確的區(qū)分。我們進行了特異引物 的設計，采用實時定量RT-PCR (Real time Quantitative PCR)技術對攜帶凋萎病菌的楊 梅苗木進行檢測，發(fā)現(xiàn)可以很好的區(qū)分感病和健康的楊梅苗木，即可以從那些表面看似健 康的楊梅苗木中鑒別出攜帶病菌的楊梅苗木。
[0005] 為了有效利用熒光定量PCR擴增技術，篩選特異性引物及最適的熒光定量PCR擴 增條件是檢測楊梅樹是否患有凋萎病的重要先決條件。
[0006] 本發(fā)明提供方法，該方法采用熒光定量RT-PCR擴增方法對楊梅樹是否帶有異色 擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌進行分子鑒定的方法。該方法包括：使用熒光定量PCR 對楊梅組織的DNA進行擴增，如果在擴增循環(huán)18-22個循環(huán)時出現(xiàn)熒光，則表示楊梅組織 中含有異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌，如果在擴增循環(huán)18-22個循環(huán)時不出現(xiàn)熒 光，則表示楊梅組織中不含有異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌。
[0007] 在一個優(yōu)選的方式中，采用熒光定量RT-PCR所使用的引物對下列引物對中的 一對或多對：AATCCGCCGTTGTAITTCAG/CTGTTCGAGCGTCAITTCAA ;AATCCGCCGTTGTAITTCAG/ TGTTCGAGCGTCATTTCAAC ; TTGAAATGACGCTCGAACAG/TCGAATCTTTGAACGCACAT。用該引物對可以 檢測楊梅組織是否攜帶有異色擬盤多毛孢真菌。
[0008] 在一個優(yōu)選的方式中，采用熒光定量RT-PCR所使用的引物對下列引物對中的 一對或多對：AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ;AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/ CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ;AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA。用該引物對可以 檢測楊梅組織是否攜帶有小孢擬盤多毛孢真菌。
[0009] 在一個優(yōu)選的方式中，該方法的楊梅組織包括根、莖或葉片。
[0010] 在一個優(yōu)選的方式中，使用的最終DNA濃度為lOOpg/μ 1。
[0011] 在一個優(yōu)選的方式中，采用的熒光定量RT-PCR的擴增的體系為： SYBR? PrcinixExTuq? (2X) 10μ 1，2 條 RT-PCR Primer (ΙΟμΜ)各 0·6μ1，ROX Reference Dye II (50Χ)4μ1，Template (50 ?100ng) 2 μ l，dH206.4yl。
[0012] 在一個優(yōu)選的方式中，采用的熒光定量RT-PCR的擴增的程序為：95 °C 30 秒；95 °C 5 秒，55 °C 30 秒，72 °C 34 秒，40 個循環(huán)。
[0013] 對于保藏真菌的生物學特性說明 菌株PMYS1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號碼為 CGMCC No. 8713,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，拉丁 學名：Pestalotiopsis microspora，中文名稱為：小孢擬盤多毛孢，保藏日期為：2014年01 月10日。 菌株PVXJ1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號碼為 CGMCC No. 8714,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，拉丁 學名：Pestalotiopsis versicolor,中文名稱為：異色擬盤多毛孢，保藏日期為：2014年01 月10日。 有益效果
[0014] 本發(fā)明采用特殊的引物以及RT-PCR技術可以有效的從健康楊梅樹中鑒定出感病 的楊梅樹，可以快速有效的獲得鑒定結果，為楊梅樹凋萎病提供了新的分子鑒定技術。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1采用引物CPV1L/CPV1R鑒定異色擬盤多毛孢菌株，引物CPM1L/CPM1R鑒定小 孢擬盤多毛孢菌株的普通PCR擴增的電泳圖。
[0016] 圖2對采用圖1中的引物擴增對照菌普通PCR擴增的電泳圖。
[0017] 圖3PCR檢測健康和接種凋萎病菌楊梅根的樣品(對于相同的葉片和莖的樣品獲 得同樣的結果，圖省略)。
[0018] 圖4使用引物PvlL/PvlR的熒光定量PCR溶解曲線(異色擬盤多毛孢菌株)。
[0019] 圖5使用引物Pv2L/Pv2R熒光定量PCR溶解曲線(異色擬盤多毛孢菌株)。
[0020] 圖6使用引物Pv3L/Pv3R熒光定量PCR溶解曲線(異色擬盤多毛孢菌株)。
[0021] 圖7使用引物PmlL/PmlR熒光定量PCR溶解曲線（小孢擬盤多毛孢菌株）
[0022] 圖8使用引物Pm2L/Pm2R熒光定量PCR溶解曲線（小孢擬盤多毛孢菌株）
[0023] 圖9使用引物Pm3L/Pm3R熒光定量PCR溶解曲線（小孢擬盤多毛孢菌株和異色擬 盤多毛孢菌株）

【具體實施方式】
[0024] 一、采用普誦PCR摶術對帶菌棺株和對照棺物以及病菌的培養(yǎng)某培養(yǎng)講行比較試 驗
[0025] 實施例子1 :PCR引物和探針設計
[0026] 根據(jù)本發(fā)明小組分離的楊梅凋萎病菌的致病力菌株XJ27 (經(jīng)過鑒定屬于異色 擬盤多毛孢）和YS26 (經(jīng)過鑒定屬于小孢擬盤多毛孢）的共有區(qū)域ITS (轉錄間隔區(qū)）的 序列（JN861773;JN861776)(Ren HY，Li Gang，Qi XJ，F(xiàn)ang Li，Wang HR，Wei JG，Zhong S. Identification and characterization of Pestalotiopsis spp. causing twig blight disease of bayberry(Myrica rubra Sieb. &Zucc)in China. European Journal of Plant Pathology, 2013, 173(3) :451-461.)。使用 Primer3software 設計熒光定量 PCR和傳統(tǒng) PCR 的引物。引物用途及序列見表1。
[0027] 表1引物序列特性
[0028]

【權利要求】
1. 一種楊梅苗木是否攜帶凋萎病菌的快速分子檢測方法，其特征在于，該方法包括： 使用熒光定量PCR對楊梅組織的DNA進行擴增，如果在擴增18-22個循環(huán)時出現(xiàn)熒光，則表 示楊梅組織中含有異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌，如果在擴增循環(huán)18-22個循環(huán) 時不出現(xiàn)熒光，則表示楊梅組織中不含有異色擬盤多毛孢或小孢擬盤多毛孢真菌。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，采用熒光定量RT-PCR所使用的引 物對下列引物對中的一對或多對：AATCCGCCGTTGTATTTCAG 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA、 AATCCGCCGTTGTATTTCAG 和 TGTTCGAGCGTCATTTCAAC 或 TTGAAATGACGCTCGAACAG 和 TCGAATCTTTGAACGCACAT 〇
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，采用熒光定量RT-PCR所使用的引 物對下列引物對中的一對或多對：AAAGCAGTAGGCTCCCAACA 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ; AAAGCAGTAGGCTCCCAACA 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ;AAAGCAGTAGGCTCCCAACA 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的的楊梅組織包括根、莖或葉片。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，使用的最終DNA濃度為100 pg /μ?。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，采用的熒光定量RT-PCR的擴增的體系為： SYBR? Premix Ex Taq? (2Χ)10 μ1，2 條 RT-PCR Primer 各 0.6 yl，ROX Dye II (50X) 4 μ?,模板 2 μ1,(1Η20 6·4 μ?。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，采用的熒光定量RT-PCR的擴增的程序為： 95。C 30 秒；95° C 5 秒，55° C 30 秒，72° C 34 秒，40 個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/04GK104232748SQ201410085409
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】任海英, 戚行江, 梁森苗, 鄭錫良, 朱瀟婷 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院