本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有益生功能的益生固態(tài)乳酸菌菌劑的制備方法。

背景技術(shù)：

活性乳酸菌菌劑具有促進(jìn)腸胃消化吸收、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力、防病保健等功能。同時(shí)，乳酸菌制劑因其天然可食用、無毒副作用、安全可靠和易大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于食品保健、畜牧飼料、水產(chǎn)養(yǎng)殖、微生物發(fā)酵和環(huán)境保護(hù)等行業(yè)。然而，目前市售乳酸菌多為液體菌劑，其劑型單一且保存期相對較短，而固態(tài)乳酸菌制劑不僅口感細(xì)膩，而且便于儲存和運(yùn)輸。因此，乳酸菌固態(tài)活性菌劑的開發(fā)和制備具有廣闊的市場潛力。

目前，有關(guān)具有顯著益生功能的益生固態(tài)乳酸菌菌劑工藝研究較少，配方有待優(yōu)化升級。專利cn1369553a公開了一種制備活性乳酸菌固態(tài)制劑的方法，該發(fā)明添加固體淀粉質(zhì)碳源和多種氮源，采用糖化曲霉分解淀粉，并通過低溫干燥制備為固態(tài)制劑。該發(fā)明所述工藝簡單易行，產(chǎn)品便于保存，但是發(fā)酵菌活不高，且產(chǎn)物營養(yǎng)益生物質(zhì)單一。專利cn1400304a公開了一種微生態(tài)制劑的液—固結(jié)合發(fā)酵工藝，該發(fā)明的固體發(fā)酵環(huán)節(jié)在厭氧塑料袋中進(jìn)行，固體基質(zhì)成分簡單、發(fā)酵規(guī)模受限。專利cn103392911a公開了一種飼用高活性乳酸菌固態(tài)制劑及其制備方法，該發(fā)明采用的粘接劑為梭甲基纖維素鈉或微晶纖維素、聚丙烯酸樹脂ⅱ，包衣劑為聚丙烯酸樹脂、海藻酸鈉或氯化鈣，該原料雖然能很好的完成固態(tài)制劑造粒，但是這些成分不是有益于腸道益生菌生長和定植的物質(zhì)，且腸道益生功能未表明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種具有益生功能的益生固態(tài)乳酸菌菌劑的制備方法，該方法經(jīng)濟(jì)環(huán)保，生產(chǎn)工藝簡單高效，生產(chǎn)成本低；產(chǎn)品無異味，口感柔和，有天然發(fā)酵乳香味；固態(tài)菌劑制備的冷凍保護(hù)劑采用的全是有助于對腸道益生菌增殖的原料；乳酸菌具有高酸、膽鹽耐受能力和膽固醇脫除能力，在模擬人工胃腸液中存活率高，具有良好的益生保健功能。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明提供一種具有益生功能的益生固態(tài)乳酸菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將添加脫脂奶粉的培養(yǎng)基滅菌，冷至室溫后接入乳酸菌發(fā)酵菌種，恒溫發(fā)酵至脫脂奶粉乳凝固，ph＝4.0-4.5時(shí)發(fā)酵結(jié)束，攪拌、冷卻至室溫，制得乳酸菌活菌劑；

(2)取乳酸菌活菌劑離心并收集菌體，棄上清液后吸取菌懸液，將菌懸液和凍干保護(hù)劑混勻；其中凍干保護(hù)劑為蒙脫土、海藻糖、普魯蘭多糖、谷胱甘肽、抗性淀粉、甘油、異vc酸、水中的一種或幾種混合；

(3)將混勻后的菌懸液倒入待凍干的器皿中預(yù)冷凍。

作為優(yōu)選，所述乳酸菌發(fā)酵菌種來源于青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格式乳桿菌、瑞士乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅依氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌中的一種或幾種混合。

本發(fā)明所使用的“w/v”是指重量體積比，即g/ml或kg/l。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述培養(yǎng)基的配方中添加10-15％(w/v)脫脂奶粉，以及以下混合物：

作為優(yōu)選，步驟(1)中，在培養(yǎng)基上按1～3％的比例接入乳酸菌發(fā)酵菌種。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，發(fā)酵溫度為30℃-39℃。發(fā)酵時(shí)間為5-8h，發(fā)酵過程中還可以控制氧氣的量，一般在有氧或微好氧條件下發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)選擇微好氧條件發(fā)酵時(shí)，氧氣的量為0～0.5mg/l溶解氧。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，取乳酸菌活菌劑后采用6000r/min離心5min收集菌體。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，加入的凍干保護(hù)劑為甘油0.5-2.5％(w/v)、海藻糖3.0-5.0％(w/v)、抗性淀粉1.0-3.0％(w/v)、普魯蘭多糖1.0-3.0％(w/v)、異vc酸0.1-0.5％(w/v)，谷胱甘肽0.2-0.5mm，蒙脫土0.1-1.0％(w/v)，水5-70％(w/v)中的一種或幾種混合。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述凍干保護(hù)劑和菌懸液混合的比例為4:1～8:1。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，將菌懸液和凍干保護(hù)劑混勻后需要平衡30min。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，預(yù)冷凍參數(shù)為：混勻后的菌懸液在4℃冰箱內(nèi)平衡30min后，移入-30℃冰箱內(nèi)平衡60min，再移入冷凍干燥劑中冷凍干燥。

本發(fā)明在乳酸菌活菌劑的制備過程中定量添加的冷凍保護(hù)劑蒙脫土、海藻糖、普魯蘭多糖、谷胱甘肽、抗性淀粉、甘油、異vc酸的多種生物活性成分，并配制為富含多種營養(yǎng)益生成分和菌體保護(hù)物質(zhì)的乳酸菌制劑，最終經(jīng)過冷凍干燥處理得到乳白色粉粒狀乳酸菌產(chǎn)品，有效提高乳酸菌菌劑活性的同時(shí)，增強(qiáng)了產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和保健功能；蒙脫土具有吸附、固定、滅活病原微生物，以及吸附、清除毒素和有害因子的作用，是一種具有乳化、增稠、助懸、吸附功能和良好的藥用價(jià)值的生物活性輔料。抗性淀粉能顯著促進(jìn)乳酸菌生長，協(xié)助腸道對鐵離子和鈣離子的吸收，且來源廣泛、制備工藝簡單、口感好。谷胱甘肽則具有抗過敏、抗腫瘤、延緩衰老和增強(qiáng)免疫力等功能，是一種重要的抗氧化劑。

本發(fā)明的有益效果為：

1.本發(fā)明使用脫脂奶粉為培養(yǎng)基，且發(fā)酵時(shí)間短。

2.本發(fā)明固態(tài)菌劑制備的冷凍保護(hù)劑采用的全是有助于對腸道益生菌增殖的原料：復(fù)配不同含量的抗性淀粉、海藻糖、普魯蘭多糖、異vc酸、谷胱甘肽、蒙脫土和甘油為冷凍保護(hù)劑。

3.本發(fā)明乳酸菌活性菌劑的制備方法經(jīng)濟(jì)環(huán)保，生產(chǎn)工藝簡單高效，生產(chǎn)成本低；產(chǎn)品無異味，口感柔和，有天然發(fā)酵乳香味；乳酸菌具有高酸、膽鹽耐受能力和膽固醇脫除能力，在模擬人工胃腸液中存活率高，具有良好的益生保健功能。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1菌粉在ph1.5、ph2.5條件下的存活率變化情況；

圖2菌株在ph2.0的人工胃液中活菌數(shù)變化情況；

圖3菌株在ph8.0的人工腸液液中活菌數(shù)變化情況；

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

首先，配制含12％(w/v)脫脂奶粉的培養(yǎng)基，110℃滅菌10min，冷卻至室溫后，按3％的比例接入兩歧雙歧桿菌，發(fā)酵生產(chǎn)乳酸菌活菌劑，35℃恒溫發(fā)酵6h，至脫脂奶粉乳凝固，ph為4.0時(shí)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到乳酸菌活菌，該活菌經(jīng)過150rpm攪拌、冷卻至室溫，得到乳酸菌活菌劑，其有效活菌數(shù)為2.0×10⁹cfu/ml。

然后，將制得的乳酸菌活菌劑在6000r/min離心5min收集菌體，棄上清液，用1ml脫脂奶粉重懸菌體膠頭滴管吸取菌懸液，將菌懸液與凍干保護(hù)劑按照1:4的比例混合均勻，平衡30min，其中保護(hù)劑的配方為：甘油0.5-2.5％(w/v)、海藻糖3.0-5.0％(w/v)、抗性淀粉1.0-3.0％(w/v)、普魯蘭多糖1.0-3.0％(w/v)、異vc酸0.1-0.5％(w/v)，谷胱甘肽0.2-0.5mm，蒙脫土0.1-1.0％(w/v)，水5-70％(w/v)。

將混勻后的菌懸液倒入待凍干的器皿中預(yù)冷凍，預(yù)冷凍參數(shù)為：混勻后的菌懸液在4℃冰箱內(nèi)平衡30min后，移入-30℃冰箱內(nèi)平衡60min，再移入冷凍干燥劑中冷凍干燥，所得固態(tài)乳酸菌菌劑含水量2.2％，乳酸菌有效活菌數(shù)1.17×10¹²cfu/g。

實(shí)施例2

首先，配制含15％(w/v)脫脂奶粉的培養(yǎng)基，110℃滅菌12min，冷卻至室溫后，按3％分別接入嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞桿菌、瑞士乳桿菌，經(jīng)39℃恒溫發(fā)酵6h、ph為4.5時(shí)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到乳酸菌活菌，該活菌經(jīng)過150rpm攪拌、冷卻至室溫，得到乳酸菌活菌劑，其有效活菌數(shù)為3.6×10⁹cfu/ml。

然后，將制得的乳酸菌活菌劑在6000r/min離心5min收集菌體，棄上清液，用1ml脫脂奶粉重懸菌體膠頭滴管吸取菌懸液，將菌懸液與凍干保護(hù)劑按照1:7的比例混合均勻，平衡30min，其中保護(hù)劑的配方為：甘油0.5-2.5％(w/v)、海藻糖3.0-5.0％(w/v)、抗性淀粉1.0-3.0％(w/v)、普魯蘭多糖1.0-3.0％(w/v)、異vc酸0.1-0.5％(w/v)，谷胱甘肽0.2-0.5mm，蒙脫土0.1-1.0％(w/v)，水5-70％(w/v)。

將混勻后的菌懸液倒入待凍干的器皿中預(yù)冷凍，預(yù)冷凍參數(shù)為：混勻后的菌懸液在4℃冰箱內(nèi)平衡30min后，移入-30℃冰箱內(nèi)平衡60min，再移入冷凍干燥劑中冷凍干燥，所得固態(tài)乳酸菌菌劑含水量3.21％，乳酸菌有效活菌數(shù)1.45×10¹²cfu/g。

對照例1為普通市售乳酸菌菌劑。

本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的固態(tài)乳酸菌菌劑性能檢測：

1)取0.1g對比例1、實(shí)施例1和實(shí)施例2中的凍干菌粉，接到5ml新鮮mrs培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)至od600＝1.0，離心收集菌體，棄掉培養(yǎng)基。將菌體懸浮在牛膽鹽濃度為0.5％、1.0％、1.5％的mrs培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h后，等比稀釋，涂布mrs平板，活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，求其平均值將以上所得的乳酸菌菌粉進(jìn)行酸、膽鹽和人工胃腸液耐受能力檢測，膽鹽耐受能力如表1所示：實(shí)施例1和實(shí)施例2中的乳酸菌菌粉對膽鹽的耐受能力高于對比例1。

表1不同膽鹽質(zhì)量濃度下菌株的生長情況

2)取0.1g對比例1、實(shí)施例1和實(shí)施例2中的凍干菌粉，接到5ml新鮮mrs培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)至od600＝1.0，離心收集菌體，棄掉培養(yǎng)基，將菌體懸浮在ph為1.5、2.5的mrs培養(yǎng)基中，根據(jù)胃酸的酸度和食物在胃中的停留時(shí)間，將菌株培養(yǎng)基在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后，等比稀釋，涂布mrs平板，活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，求其平均值，計(jì)算其存活率。結(jié)果如圖1所示，實(shí)施例1和實(shí)施例2的凍干菌粉在酸性ph培養(yǎng)基中存活率高，既實(shí)施例1和實(shí)施例2凍干菌粉的酸耐受性高。如圖1所示為菌粉在ph1.5、ph2.5條件下的存活率變化情況；

其中：a1為0h時(shí)的活菌數(shù)；a2為6h時(shí)的活菌數(shù)。

3)菌粉膽固醇去除能力測定：供試菌株以0.1g轉(zhuǎn)接于mrs-stc-chol培養(yǎng)基，37℃發(fā)酵24h。分別測定培養(yǎng)上清液(12000×g，10min，4℃)中膽固醇含量，計(jì)算膽固醇去除率。膽固醇去除率(％)＝(初始膽固醇含量-上清液膽固醇含量)/初始膽固醇含量×100％，結(jié)果如表2所示，實(shí)施例1的膽固醇降解率低于對比例1，但是實(shí)施例2的膽固醇降解率高于對比例1。

表2菌粉在mrs-stc-chol培養(yǎng)液膽固醇含量降解情況(μg/ml)

4)菌株對人工胃腸液的耐受性評價(jià)：以對比例1、實(shí)施例1和實(shí)施例2為檢測菌粉，用胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽和濃鹽酸模擬人工胃、腸液，對此4中菌粉的人工胃腸液耐受性進(jìn)行比較。結(jié)果如圖2、3所示，實(shí)施例2對人工胃、腸液耐受性較高，該菌粉中菌株在ph＝2.0的人工胃液中處理6小時(shí)，能保持6.3×10⁸cfu/ml活菌數(shù)，在ph＝8.0的人工腸液中處理6小時(shí)，能保持2.3×10⁸cfu/ml活菌數(shù)，該活菌數(shù)的保持，為菌粉在腸道內(nèi)黏附和定植提供了良好的保障。

綜上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過本發(fā)明制備的益生固態(tài)乳酸菌菌劑能夠顯著提高乳酸菌高存活率的同時(shí)，提高乳酸菌菌劑的益生功能。同時(shí)菌粉具有較高的酸、膽鹽耐受能力和膽固醇脫除能力，在模擬人工胃腸液中存活率高，具有良好的益生保健功能。

當(dāng)然，上述說明也并不僅限于上述舉例，本發(fā)明未經(jīng)描述的技術(shù)特征可以通過或采用現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)，在此不再贅述；以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案并非是對本發(fā)明的限制，參照優(yōu)選的實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換都不脫離本發(fā)明的宗旨，也應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍。