本發(fā)明涉及一種提高乳酸菌酸脅迫抗性的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：乳酸菌由于其獨(dú)特的生理特性被廣泛的應(yīng)用于輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥及飼料工業(yè)等許多行業(yè)中。酸脅迫作為乳酸菌生產(chǎn)應(yīng)用中面臨的最廣泛存在的一種環(huán)境脅迫，嚴(yán)重影響了乳酸菌生理功能的發(fā)揮。因此提高乳酸菌的酸脅迫耐受性對(duì)于其在發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用有著重要的意義。二氫硫辛酰胺脫氫酶是一種黃素蛋白，其作用是將二氫硫辛酰胺脫氫轉(zhuǎn)化為氧化型硫辛酰胺，屬于氧化還原酶類，提供一些硫族基團(tuán)，供nad+和nadp+接受，從而在生物的能量代謝中起重要作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)二氫硫辛酰胺脫氫酶進(jìn)行了大量的研究，其中研究最多的原核生物為大腸桿菌，而真核生物主要是酵母、豬以及人類。隨著研究的深入，研究者不斷發(fā)現(xiàn)二氫硫辛酰胺脫氫酶在病原體的致病性以及耐藥性方面起著重要的作用，同時(shí)其還具有較強(qiáng)的免疫原性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種提高乳酸乳球菌酸脅迫抗性的方法。本發(fā)明通過(guò)在乳酸乳球菌中過(guò)量表達(dá)dldh蛋白，實(shí)現(xiàn)了乳酸乳球菌酸脅迫抗性的提高。本發(fā)明解決的第一個(gè)問(wèn)題是提供了一株酸脅迫抗性提高的重組乳酸乳球菌，這株重組菌過(guò)量表達(dá)二氫硫辛酰胺脫氫酶dldh。所述dldh的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。所述dldh的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是seqidno.2所示的序列。所述dldh的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，來(lái)源于乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。所述重組菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000為宿主。本發(fā)明解決的第二個(gè)問(wèn)題是提供了一種所述重組菌的構(gòu)建方法。是將編碼seqidno.1所示氨基酸序列的dldh基因連接到表達(dá)質(zhì)粒上獲得重組質(zhì)粒，再分別轉(zhuǎn)化到宿主菌中獲得重組菌。所述表達(dá)質(zhì)粒為pnz8148。所述宿主菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是lactococcuslactisnz9000。所述構(gòu)建方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：將seqidno.1所示的核苷酸序列克隆到表達(dá)質(zhì)粒pnz8148上，獲得重組質(zhì)粒pnz8148-dldh，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高乳酸乳球菌酸脅迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中過(guò)量表達(dá)二氫硫辛酰胺脫氫酶dldh。所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，dldh的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：將seqidno.2所示的核苷酸序列克隆到表達(dá)質(zhì)粒pnz8148上，獲得重組質(zhì)粒pnz8148-dldh，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)，誘導(dǎo)表達(dá)dldh。本發(fā)明的有益效果：通過(guò)在乳酸乳球菌中過(guò)量表達(dá)dldh蛋白，得到了一株酸脅迫抗性提高的重組乳酸菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。在酸脅迫條件下，ph4.0脅迫3.5h后，重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)的存活率為對(duì)照的7.3倍。附圖說(shuō)明圖1：重組質(zhì)粒pnz8148-dldh的結(jié)構(gòu)圖；圖2：重組菌株和對(duì)照菌株的生長(zhǎng)曲線；圖3：ph4.0條件下重組菌株與對(duì)照菌株的存活率對(duì)比。具體實(shí)施方式實(shí)施例1重組菌株的構(gòu)建從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)lactococcuslactisnz9000的基因組中得到如seqidno.2所示的dldh的基因序列，并將其克隆到乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pnz8148上，獲得重組質(zhì)粒pnz8148-dldh，再將其電轉(zhuǎn)入宿主菌l.lactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。具體如下：根據(jù)dldh的基因序列設(shè)計(jì)分別如seqidno.3、seqidno.4所示的引物dldh-f、dldh-r(表1)，以lactococcuslactisnz9000的基因組為模板，pcr擴(kuò)增或采用化學(xué)合成的方法，獲得seqidno.2所示的基因片段。將pcr產(chǎn)物和載體pnz8148分別用xbai和saci雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌mc1061(商業(yè)化菌株)感受態(tài)，氯霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落pcr驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證，片段大小正確后再進(jìn)行測(cè)序鑒定，最終獲得含有正確序列的重組質(zhì)粒pnz8148-dldh(重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示)。然后從重組mc1061中提取重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化l.lactisnz9000感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落pcr驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證，片段大小正確后，最終獲得含有正確重組質(zhì)粒的菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。電轉(zhuǎn)化條件為：1μl質(zhì)粒中與40μl的感受態(tài)細(xì)胞混合，移入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置10min。電壓2000v，電容25μf，電阻200ω。電擊完畢后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入1ml含有20mmmgcl2和2mmcacl2的gm17培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方：m17培養(yǎng)基+0.5％glucose)。然后置于30℃靜置培養(yǎng)1.5h，涂布于含有氯霉素的gm17平板上，培養(yǎng)36h，挑取轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。表1引物引物序列dldh-fatatatctagaatggttgttggtgcacaagcaacdldh-ratatagagctcttaaacgtgaattggcaagccatc實(shí)施例2dldh蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)誘導(dǎo)重組菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)表達(dá)dldh蛋白，并用sds-page蛋白電泳檢測(cè)重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)中dldh蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與dldh蛋白大小相似的條帶的量顯著增加。具體過(guò)程如下：將菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148)(即含有pnz8148空質(zhì)粒的lactococcuslactisnz9000菌株)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)接種于含有10μg/ml氯霉素的gm17(5ml)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，以4％的接種量轉(zhuǎn)接至50ml含有10μg/ml氯霉素的gm17培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至od6000.4時(shí)加入10ng/ml的nisin(一種乳酸鏈球菌素)誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，經(jīng)50mmtris-hcl緩沖液(ph7.4)離心洗滌兩次后重懸于相同的緩沖液中。將菌懸液置于冰上超聲破碎15min，離心收集上清液，進(jìn)行sds-page分析。經(jīng)sds-page分析，重組菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)成功地表達(dá)了dldh蛋白。sds-page中，在分子量約為49.87kda處的蛋白質(zhì)條帶顯著變厚重，與目標(biāo)蛋白dldh的分子量基本一致，說(shuō)明成功地在lactococcuslactisnz9000中表達(dá)了dldh蛋白。實(shí)施例3過(guò)量表達(dá)dldh蛋白菌株的生長(zhǎng)性能試驗(yàn)對(duì)于考察菌株在過(guò)量表達(dá)dldh蛋白時(shí)的生長(zhǎng)情況，將菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148)(對(duì)照)接種于加了10μg/ml氯霉素的gm17液體培養(yǎng)基(1ml)中進(jìn)行活化，于30℃培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜培養(yǎng)。再以2％的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮的(含10μg/ml氯霉素，ph5.5，乳酸調(diào)節(jié))的gm17液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)。每隔2h取樣，測(cè)定600nm波長(zhǎng)下的od值。培養(yǎng)至od6000.4時(shí)加入10ng/ml的乳酸鏈球菌素(nisin)誘導(dǎo)表達(dá)dldh蛋白。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，od600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。經(jīng)生長(zhǎng)性能試驗(yàn)分析，重組菌株的生物量相對(duì)對(duì)照菌株有所提高，約9.53％，說(shuō)明在lactococcuslactisnz9000中過(guò)量表達(dá)dldh蛋白可提高菌株的酸脅迫抗性。實(shí)施例4酸脅迫條件下耐受性試驗(yàn)對(duì)于考察菌株對(duì)酸的耐受性分析試驗(yàn)，分別測(cè)定了重組菌株和對(duì)照菌株在ph4.0條件下的存活率。具體操作方式如下：將菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，離心收集細(xì)胞，經(jīng)0.85％的生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的新鮮的ph4.0(乳酸調(diào)節(jié))的gm17(含有10μg/ml氯霉素)中，脅迫不同時(shí)間。脅迫后的菌懸液洗滌兩次后重懸于等體積的生理鹽水中，取10μl重懸液，梯度稀釋，選合適的梯度點(diǎn)種于gm17氯霉素平板上測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算存活率。經(jīng)耐受性實(shí)驗(yàn)分析，在ph4.0的gm17中脅迫3.5h后，重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)的存活率為對(duì)照的7.3倍，說(shuō)明重組菌株對(duì)酸脅迫的耐受性顯著提高。通過(guò)實(shí)施例3和實(shí)施例4結(jié)果分析，可知在lactococcuslactisnz9000中過(guò)量表達(dá)dldh蛋白后，菌株耐酸性能顯著提高。說(shuō)明通過(guò)lactococcuslactisnz9000中過(guò)量表達(dá)dldh蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸脅迫抗性。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。sequencelisting<110>江南大學(xué)<120>一種提高乳酸菌酸脅迫抗性的方法<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>472<212>prt<213>lactococcuslactisnz9000<400>1metvalvalglyalaglnalathrgluvalaspleuvalvalilegly151015serglyproglyglytyrvalalaalaileargalaalagluleugly202530lyslysvalthrileileglulysaspasnvalglyglyvalcysleu354045asnileglycysileproserlysalaleuileasnileglyhishis505560tyrglngluserleuglugluglulysglygluasnpropheglyleu65707580servalglyasnvallysleuasntrpgluseralaglnlystrplys859095glnasplysvalvalasnglnleuthrglyglyvallysmetleuleu100105110lyslyshislysvalaspvalileglnglythralaglupheileasp115120125asnasnthrileasnvalgluglngluaspglypheglnleuleugln130135140pheasnaspvalileileserthrglyserargproilegluilepro145150155160serphepropheglyglyargileileaspserthrglyalaleuser165170175leuprogluvalprolyshisleuileilevalglyglyglyvalile180185190glysergluleuglyglyalatyrargmetleuglyserlysilethr195200205ilevalgluglyleuasphisileleuasnglypheasplysglumet210215220seraspileilealaasnargvallysseralaglysergluilephe225230235240thrseralametalalysseralathrglnthrasplysaspvalthr245250255leuthrphegluvalaspglylysgluglnthrvalthrglyasptyr260265270leuleuvalservalglyargargproasnthraspleuileglyleu275280285asnasnthraspvallysleuthraspargglyleuilegluvalasp290295300aspsertyralathrasnvalprohisiletyralaileglyaspval305310315320valproglyprometleualahislysalaserpheglnalalysval325330335alaalaalaalailealaglyalagluaspaspvalaspleuhisval340345350alaleuproalavalalatyrthrthrthrgluleualathrvalgly355360365gluthrprogluservallysasparglysaspvallysileserlys370375380pheprophealaalaasnglyargalailesermetasnasnthrthr385390395400glypheleuargleuilethrgluthrlysgluglyalaleuilegly405410415alaglnilevalglyproglyalaseraspleuileserglyleuser420425430leualailegluasnglyleuthrserlysaspileserleuthrile435440445glnprohisprothrleuglyglualailemetaspthralagluleu450455460alaaspglyleuproilehisval465470<210>2<211>1419<212>dna<213>lactococcuslactisnz9000<400>2atggttgttggtgcacaagcaacagaagttgatttggttgttattggttcaggccctggc60ggttatgttgcggccatccgtgcggctgaacttggtaaaaaagttacgattattgaaaaa120gataatgtcggtggggtttgtttaaatattggatgtatcccatcaaaagcattgattaat180attggtcatcattatcaagaatctttggaagaagaaaagggtgaaaatccttttggactt240tctgtcggaaatgttaaattaaattgggaatctgcccaaaaatggaaacaagataaagtt300gtcaaccagttgacaggtggcgttaaaatgctacttaaaaaacacaaagttgatgtaatt360caaggaacagctgagtttattgataacaatacaatcaatgttgaacaagaagatggtttc420caacttttgcagttcaacgatgtaattatctcaactggttcacgtcctattgaaatccca480tctttcccatttggtggtcgtattattgactcaacaggtgctttgtcacttccagaagtg540cctaaacatttgattattgttgggggtggcgttattggttctgagcttggtggagcttac600cgcatgctcggttctaagattacaattgttgaaggcttggaccacattttaaacggtttt660gataaagaaatgtctgatatcattgcgaatcgtgtgaaatctgctggttctgaaatcttt720acatcggcgatggctaaatcagctactcaaaccgataaagatgtgactttaacttttgaa780gttgacggaaaagaacaaacagtaactggtgattacttactcgtttctgttggacgtcgt840ccaaatactgatttgattggcttgaacaatactgatgtcaaattgactgaccgtggtttg900attgaagttgatgattcttatgcaacgaatgttcctcatatttacgcgattggtgatgtg960gttcctggaccaatgctcgcacacaaagcttctttccaagctaaagttgctgcagcggcc1020attgctggagctgaagacgacgtggacttgcacgttgctttgccagccgttgcttataca1080acaactgaactagcaacagttggagaaacgcctgaatcagttaaagaccgtaaagatgtc1140aagatctctaagttcccatttgctgcaaatggtcgtgccatttcaatgaataataccact1200ggtttcttacgtttgattaccgaaactaaagaaggtgccttaattggtgctcaaatcgtt1260ggtcctggcgcatctgacctgatctctggtttatcactagcgattgaaaatggtttgact1320tctaaagatatctcattgactatccaacctcacccaacacttggtgaagcgattatggat1380acagctgaattggctgatggcttgccaattcacgtttaa1419<210>3<211>34<212>dna<213>人工設(shè)計(jì)用于pcr<400>3atatatctagaatggttgttggtgcacaagcaac34<210>4<211>35<212>dna<213>人工設(shè)計(jì)用作pcr<400>4atatagagctcttaaacgtgaattggcaagccatc35當(dāng)前第1頁(yè)12