一種提高乳酸菌乙醇脅迫抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高乳酸菌乙醇脅迫抗性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌作為一類重要的工業(yè)微生物，菌體及其代謝產(chǎn)物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼 料、精細化學(xué)品等工業(yè)領(lǐng)域中。在工業(yè)生產(chǎn)中以及作為益生菌在人體胃腸道系統(tǒng)中都不可 避免的面臨著來自外界環(huán)境的多種環(huán)境脅迫，包括酸脅迫、乙醇脅迫、氧脅迫、鹽脅迫等，嚴(yán) 重限制著乳酸菌生長性能和發(fā)酵力。
[0003] 乙醇屬有機溶劑，對菌體的毒害主要表現(xiàn)在對細胞膜的破壞上。乙醇滲入膜結(jié)構(gòu) 改變它們的組織和功能，乙醇不僅抑制細菌的生長，乙醇濃度過高還會影響菌體的新陳代 謝、生理活性、影響基體的酶活性等，甚至導(dǎo)致菌體死亡。因此，提供一種提高乳酸菌乙醇脅 迫抗性的方法尤為重要。
[0004] 本發(fā)明通過在乳酸乳球菌中過量表達ArgG和ArgH蛋白，調(diào)節(jié)天冬氨酸到精氨酸 的代謝通路，從而實現(xiàn)了乳酸乳球菌對于乙醇脅迫抗性能力的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種提高乳酸菌抵御乙醇脅迫的方法，從而提 高乳酸乳球菌對于乙醇脅迫條件的適應(yīng)能力。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種提高乳酸菌乙醇脅迫抗性的方法，是在乳酸菌中 過表達精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ArgG的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序 列。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ArgG的核苷酸序列是SEQIDN0. 2所示的序 列。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDN0. 3所示的序 列。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ArgH的核苷酸序列是SEQIDN0. 4所示的序 列。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述乳酸菌為乳酸乳球菌。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將編碼ArgG或者ArgH的基因序列連接 到表達載體上獲得重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主乳酸菌中并誘導(dǎo)重組菌表達ArgG 或者ArgH，再將重組菌置于乙醇脅迫環(huán)境中。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導(dǎo)重組菌表達是將在GM17培養(yǎng)基中，使用 nisin(-種乳酸鏈球菌素）進行誘導(dǎo)。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達載體為pNZ8148、pNZ8149或pNZ8150。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主乳酸菌為LactococcuslactisNZ9000。
[0016] 本發(fā)明還提供一種乙醇脅迫抗性提高的重組乳酸菌，其特征在于，所述重組乳酸 菌過表達了精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組乳酸菌以LactococcuslactisNZ9000為 宿主、PNZ8148為載體過表達了氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的ArgG。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 通過采用在乳酸菌中過量表達精氨酰琥珀酸合成酶（ArgG)或精氨酰琥珀酸裂解 酶（ArgH)的方法，顯著提高了乳酸菌的乙醇脅迫抗性能力。采用本發(fā)明方法，在5%乙醇脅 迫條件下，使重組菌株 L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000(pNZ-argH)相對 于對照菌株的生物量分別提高了 25. 7%和21. 2%;同時，過表達ArgG或ArgH的重組菌，在 15%乙醇脅迫5h后，存活率分別為對照菌株的5. 97和4. 65倍。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :重組質(zhì)粒pNZ8148-argH的結(jié)構(gòu)圖；
[0021] 圖2:重組菌株蛋白電泳圖；其中，M:蛋白Marker;G:L.lactis NZ9000(pNZ-argG)；H：L.lactisNZ9000(pNZ-argH)；VEC：L.lactisNZ9000(pNZ8148)；
[0022] 圖3 :5%乙醇脅迫條件下，重組菌株與對照菌株生長性能對比；
[0023] 圖4 :15%乙醇脅迫條件下，重組菌株與對照菌株存活率對比。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做更詳細的說明。
[0025] 實施例1重組菌株的構(gòu)建
[0026] 從NCBI數(shù)據(jù)庫的L. casei Zhang中得到ArgG和ArgH蛋白的基因序列（分別如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID N0. 4所示），并將其克隆到乳酸乳球菌表達質(zhì)粒pNZ8148上，獲得重 組質(zhì)粒pNZ8148-argG和pNZ8148-argH，再將其電轉(zhuǎn)入宿主菌L. lactis NZ9000中，得到重 組菌株 L.lactis NZ9000 (pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000 (pNZ-argH) 〇
[0027] 具體如下：
[0028] 根據(jù)argG和argH的基因序列分別設(shè)計引物ArgGF、ArgGR、ArgHF和ArgHR(表1)， 以L. casei Zhang的基因組為模板進行PCR擴增，獲得argG和argH基因片段。將PCR產(chǎn) 物和載體PNZ8148分別用Spe I和Sph I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，進行連接。連接產(chǎn)物 電轉(zhuǎn)化L. lactis NZ9000感受態(tài)細胞，氯霉素平板上篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR驗證和酶 切驗證，片段大小正確后，經(jīng)測序驗證正確后最終獲得含有正確重組質(zhì)粒的菌株L. lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000(pNZ-argH)〇
[0029] 電轉(zhuǎn)化條件為：1 yL質(zhì)粒中與40 yL的感受態(tài)細胞混合，移入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中， 冰上放置l〇min。電壓2000V，電容25yF，電阻200Q。電擊完畢后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入 lmL含有20mM MgCljP 2mM CaCl 2的GM17培養(yǎng)基（GM17培養(yǎng)基配方：M17培養(yǎng)基+0. 5% glucose)。然后置于30°C靜置培養(yǎng)1. 5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培養(yǎng)36h，挑取 轉(zhuǎn)化子驗證。
[0030] 表1引物
[0031]
[0032] 實施例2ArgG和ArgH蛋白的誘導(dǎo)表達與檢測
[0033] 誘導(dǎo)重組菌L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)表達 ArgG和ArgH蛋白，并用SDS-PAGE蛋白電泳檢測重組菌株中ArgG和ArgH蛋白的表達情況， 發(fā)現(xiàn)與ArgG和ArgH蛋白大小相似的條帶的量顯著增加。
[0034] 具體過程如下：
[0035]將菌株 L. lactis NZ9000 (pNZ8148)(即含有 pNZ8148 空質(zhì)粒的 L. lactis NZ9000 菌株）和重組菌 L. lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000(pNZ-argH)接種于含有 10 y g/mL氯霉素的GM17(5mL)培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過夜，以4%的接種量轉(zhuǎn)接至50mL 含有10 y g/mL氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，待生長至0D6M0. 4時加入10ng/mL的nisin (-種 乳酸鏈球菌素）誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集誘導(dǎo)后的細胞，經(jīng)50mM Tris-HCl緩沖液（pH 7.4)離心 洗滌兩次后重懸于相同的緩沖液中。將菌懸液置于冰上超聲破碎15min，離心收集上清液， 進行SDS-PAGE分析。
[0036] 經(jīng)SDS-PAGE分析，重組菌 L.lactisNZ9000 (pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000 (pNZ-argH)分別成功的表達了ArgG和ArgH蛋白。SDS-PAGE中，在分子量約為45kDa 和52kDa處的蛋白質(zhì)條帶顯著變厚重，與目標(biāo)蛋白ArgG和ArgH的分子量基本一致，說明成 功地在L.lactisNZ9000中表達了ArgG和ArgH蛋白。
[0037] 實施例3乙醇脅迫下生長性能試驗
[0038] 對于考察菌株在脅迫條件下的生長情況，將菌株L. lactis NZ9000(pNZ8148)和 L. lactis NZ9000 (pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000 (pNZ-argH)接種于含有 10 yg/mL 氯霉素 的GM17 (5mL)培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過夜，以4%的接種量轉(zhuǎn)接至50mL含有10 y g/mL氯 霉素的GM17培養(yǎng)基中，待生長至0D6M0. 4時加入10ng/mL的nisin，誘導(dǎo)培養(yǎng)至0D 2. 0。將 誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液以2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的GM17 (含10 y g/mL氯霉素，10ng/mL nisin， 5%乙醇，v/v)培養(yǎng)基中。分別測定重組菌株和對照菌株在脅迫條件下的生長性能。
[0039] 結(jié)果如圖3所示。經(jīng)生長性能試驗分析，L. lactis NZ9000 (pNZ-argG)和L. lactis NZ9000 (pNZ-argH)相對對照菌株生物量顯著提高，分別提高25. 7%和21.2%，說明在 L. lactis NZ9000中表達了ArgG和ArgH蛋白后，菌株乙醇脅迫抗性顯著提高。
[0040] 實施例4乙醇脅迫條件下耐受性試驗
[0041] 對于考察菌株對乙醇的耐受性分析試驗，分別測定了重組菌株和對照菌株在15% 乙醇脅迫條件下的存活率。
[0042] 具體操作方式如下：將菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)至0D2.0,離心收集細胞，經(jīng)0.85%的生理 鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的新鮮的含有15%乙醇的GM17中，脅迫不同的時間。脅迫 后的菌懸液洗滌兩次后重懸于等體積生理鹽水中，取10 y L重懸液，稀釋不同梯度點種于 GM17平板上測定活菌數(shù)和存活率。
[0043] 經(jīng)耐受性實驗分析（結(jié)果如圖4所示），在15 %的GM17中脅迫5h后，重組菌株 L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000(pNZ-argH)的存活率分別是對照菌株的 5. 97和4. 65倍，說明重組菌株對乙醇脅迫的耐受性顯著提高。
[0044] 結(jié)合實施例3、4分析，可知在L. lactisNZ9000中表達了 ArgG或ArgH蛋白后，菌 株乙醇耐受性顯著提高。說明通過在L. lactisNZ9000中表達ArgG或ArgH蛋白的方法可 以提高乳酸乳球菌乙醇脅迫抗性。
[0045] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種提高乳酸菌乙醇脅迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中過表達 精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述ArgG的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1 所示的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO. 3 所示的序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌為乳酸乳球菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是將編碼ArgG或者ArgH的基因 序列連接到表達載體上獲得重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主乳酸菌中并誘導(dǎo)重組菌 表達ArgG或者ArgH，再將重組菌置于乙醇脅迫環(huán)境中。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達載體為pNZ8148、pNZ8149或 PNZ8150。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述宿主乳酸菌為Lactococcus Iactis NZ9000。8. -種重組乳酸菌，其特征在于，所述重組乳酸菌過表達了精氨酰琥珀酸合成酶 ArgG09.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組乳酸菌，其特征在于，所述重組乳酸菌是過表達了氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1所示的ArgG。10. 權(quán)利要求8-9任一所述重組乳酸菌在食品、飼料、精細化學(xué)品領(lǐng)域的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高乳酸菌乙醇脅迫抗性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法通過在乳酸乳球菌L.lactis？NZ9000中過量表達了來源于干酪乳桿菌L.casei？Zhang的argG和argH基因，得到了一株乙醇脅迫抗性能力顯著提高的重組乳酸乳球菌L.lactis？NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis？NZ9000(pNZ-argH)。在5％乙醇脅迫條件下，重組菌株L.lactis？NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis？NZ9000(pNZ-argH)相對于對照菌株生物量分別提高了25.7％和21.2％；15％乙醇脅迫5h后，存活率分別為對照菌株的5.97和4.65倍。
【IPC分類】A23K1/16, A23L1/30, C12N1/21, C12N15/74
【公開號】CN105063077
【申請?zhí)枴緾N201510591053
【發(fā)明人】張娟, 陳堅, 張明陽, 堵國成, 朱政明, 唐詩
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月16日