專利名稱：獲得用于生產(chǎn)維生素k2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應(yīng)用的制作方法
獲得用于生產(chǎn)維生素K2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應(yīng)用本申請是原申請的申請日為2007年10月4日，申請?zhí)枮?00780037068. 5，發(fā)明名稱為《獲得用于生產(chǎn)維生素K2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應(yīng)用》的中國專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及富含維生素和/或痕量元素營養(yǎng)食品的領(lǐng)域，以便改善人類的營養(yǎng)攝入量及在質(zhì)和量上的營養(yǎng)平衡。本發(fā)明特別涉及使食物富含維生素K的方法。更具體地，本發(fā)明涉及獲得乳酸菌菌株變種的方法，所述乳酸菌變種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下生產(chǎn)的維生素K2是相同條件下培養(yǎng)的初始乳酸菌菌株獲得的維生素K2的至少約
I.2 倍。本發(fā)明還涉及一種食品的制造方法，尤其是富含維生素K2的發(fā)酵產(chǎn)品和/或鮮奶產(chǎn)品的制造方法，以及由此獲得的食品。維生素K是一種脂溶性維生素，它呈現(xiàn)兩種自然形態(tài)維生素Kl (或葉綠醌)和維生素K2 (或甲基萘醌)。維生素Kl由植物合成。人們主要在綠色蔬菜(葉狀蔬菜)和豆油中獲得它。維生素Kl直接參與凝血過程。維生素K2由腸道菌群的細菌生產(chǎn)。它也微量存在于某些發(fā)酵食品(奶酪、基于發(fā)酵黃豆的亞洲典型產(chǎn)品如味噌和日本水豆豉等等)中。多數(shù)細菌有能力合成維生素K2。因此，除了腸道菌群的細菌以及，特別是大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌和類桿菌屬的種，還可以列舉某些乳酸菌的種和亞種，如乳酸乳球菌乳亞種(lactococcus lactis spp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(lactococcus lactis spp. cremoris)、乳明串珠菌、腸膜明串珠菌和丙酸桿菌的種。由所述細菌合成的維生素K2的含量通常在29至90微克/升發(fā)酵乳之間變化(Morishita等人，1999)。需要強調(diào)的是對維生素K2產(chǎn)量的測量通常從沉淀細胞的真空冷凍干燥制品實現(xiàn)，并且這些測量結(jié)果隨不同測試菌株在生產(chǎn)水平上呈現(xiàn)出很大的不均勻性，可能在一倍至三倍多之間變化(Morishita等人，1999 ;Parker等人,2003)。關(guān)于生物活動，維生素K2因其在軟組織鈣化上的作用而尤其被熟知。維生素K最初因為它在凝血過程中的重要作用而被描述。因此，嚴(yán)重缺乏維生素K會導(dǎo)致溢血，凝血時間異常延長，以及淤血。很長時間以來人們認為嚴(yán)重缺乏維生素K在成年中極為少見，對維生素K的需求可以靠多樣平衡的膳食以及體內(nèi)腸細菌的生產(chǎn)來大大滿足。在這一方面，有嚴(yán)重缺乏可能的人主要是-新生兒，它們在出生時腸內(nèi)沒有能產(chǎn)生維生素K的細菌； -肝臟、膽或腸道功能紊亂者(肝病患者、先天性粘液稠厚癥患者、結(jié)腸炎患者、痢疾患者等)；以及-長期服用抗生素的人。近期，人們發(fā)現(xiàn)維生素K對人類健康的影響不僅限于其在凝血機制中的作用。事實上，自從80年代起，維生素K也因其在骨代謝中的作用而聞名(Hart等人，1984 ；Hart等人，1985)。這種維生素在調(diào)節(jié)骨形成中的調(diào)節(jié)骨鈣蛋白活動的酶化學(xué)反應(yīng)中作輔助因子(Hauschka PV等人，1989 ;Ducy P等人，1996)。它的作用更精確地說包括調(diào)節(jié)骨鈣蛋白的羧化，骨鈣蛋白是調(diào)節(jié)成骨過程的關(guān)鍵蛋白。如果缺乏維生素K，這一反應(yīng)無法進行，會引發(fā)血液中脫羧骨鈣蛋白對羧化骨鈣蛋白比率的升高(Vaananen等人，1999)。西方國家人口統(tǒng)計學(xué)的發(fā)展表現(xiàn)為人口的逐漸老齡化，結(jié)果導(dǎo)致變性病理流行病的增長，尤其是骨質(zhì)疏松。在這一方面，骨質(zhì)疏松從此被認為是公眾健康的重大問題。在90年代建立的人口統(tǒng)計學(xué)估計敲響了警鐘，預(yù)計在未來的50年內(nèi)這種病的發(fā)生率會顯著增長，尤其在老年人當(dāng)中。所以采取措施預(yù)防這種疾病成為當(dāng)務(wù)之急，事先稀少地檢查出并隨后處理。
從此人們認為預(yù)防骨質(zhì)疏松應(yīng)該從幼年開始，經(jīng)過最佳的骨質(zhì)增長階段，并在一生中繼續(xù)維護骨量(bone mass)o眾所周知營養(yǎng)因素在骨儲備(bone reverse)的發(fā)展和維護中起重要作用。直到現(xiàn)在，設(shè)想和建議用來預(yù)防骨質(zhì)疏松的營養(yǎng)策略主要集中在兩個重要因素上，它們是鈣質(zhì)和維生素D。然而，人們現(xiàn)在知道其他營養(yǎng)因素可以有顯著的益處。因其在成骨過程中的重要作用，維生素K在文獻中越來越成為維持人類一生中骨健康的有前途的途徑。建議的人類含維生素K的營養(yǎng)供給(I. 5微克/天/千克體重)是只考慮到維生素K凝血作用而確定的。然而，近期研究提出，如果同時考慮到維生素K在骨代謝中的作用，這一建議的營養(yǎng)供給最終估計不足(Ronden等人，1998)。雖然維生素K的需求仍然不被了解，但不足的供給導(dǎo)致成人骨量低并增大骨折的危險(Hart 等人，1985 ；Knapen 等人，1989 ；Szulc 等人，1993 ；Booth 等人,2000)。此外，對絕經(jīng)期女性治療措施的研究指出維生素K可以在這一目標(biāo)減少骨質(zhì)虧損(Shiraki等人，2000 ;Braam等人，2003)。最終，對動物的研究提出它在骨量增長的高峰過程中起到促進作用，協(xié)同維生素D會起到更好的效果。然而，明確地聯(lián)系維生素K和骨質(zhì)增長的研究目前只在動物中進行過。另外，最近研究為維生素K在骨代謝和，尤其在骨量的組成和維持上的作用提供了額外的有利證據(jù)(Booth 等人,2000 ；Shiraki 等人,2000 ；Braam 等人,2003 ；Hirano 和Ishi，2002)。與成人情況不同的是，目前沒有可利用的數(shù)據(jù)證明維生素K對兒童的骨代謝有促進的作用。人們只知道為了最大量儲備骨質(zhì)并保護成人不得骨質(zhì)疏松，在增長期優(yōu)化骨量十分重要。不管怎樣，如今全部數(shù)據(jù)表明改善食品中維生素K的含量是使人構(gòu)造和維護優(yōu)良骨結(jié)構(gòu)(bone structure)的有利的和有前途的途徑。在這種情況下，在食品市場上已經(jīng)存在富含維生素K的工業(yè)產(chǎn)品。特別可以列舉某些含有乳酸菌的乳制品，如“Petits Gervais aux Fruits”在法國被Demanderesse出售。然而可以注意到，一方面，這些產(chǎn)品的維生素K含量通常依賴于使用的發(fā)酵類型，另一方面，傳統(tǒng)在乳制品中使用的乳球菌屬的菌株不能生產(chǎn)足量的維生素K來真正滿足人口的需求，甚至不足以減緩可能出現(xiàn)的維生素K的缺乏。因此目前需要一種食品生產(chǎn)技術(shù)，特別是生產(chǎn)富含維生素K滿足需求的發(fā)酵制品和/或鮮乳制品，如有必要，能夠彌補維生素K的缺陷，無論是在兒童和青少年還是在成年人和老年人中。在下文中，術(shù)語“維生素K2”和“維生素K”不加區(qū)別，指代維生素K2。本發(fā)明目的是滿足這一需要提出使用乳酸菌菌株新變種制備食品，特別是發(fā)酵制品和/或鮮乳制品，生產(chǎn)的維生素K遠遠多于衍生它們的最初菌株。此外，在他們工作過程中，發(fā)明者校準(zhǔn)了乳酸菌的實現(xiàn)條件，相對于傳統(tǒng)生產(chǎn)條件明顯促進了維生素K的生產(chǎn)。因此，在食品制備的后期，如發(fā)酵制品和/或鮮乳制品的制備，增加維生素K2的含量，可以在發(fā)明者認為能特別促進維生素K2生產(chǎn)的實現(xiàn)條件下有利地使用“過剩生產(chǎn)者”這一維生素K的變種，它是本發(fā)明的目標(biāo)也是2006年10月4日的法國專利申請No. 06/08690的發(fā)明目的。術(shù)語“變種”在這里包括
-自然變種，也就是說在選擇壓力作用下從一種參照乳酸菌菌株自發(fā)獲得的變種；自然變種不經(jīng)過任何人工基因處理，而是主要從參照菌株通過突變和選擇而獲得；以及-突變株，在其染色體組中有一個或多個由基因工程技術(shù)誘發(fā)的突變，也就是說靠應(yīng)用在參照菌株上的誘導(dǎo)突變技術(shù)，特別是借助載體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。可以注意到，在某些國家(特別是在歐洲)，食品工業(yè)在開發(fā)含有微生物特別是活體微生物的用于人類和/或動物食品的產(chǎn)品時應(yīng)采取預(yù)防措施。實際上，轉(zhuǎn)基因有機體(這里是微生物)(轉(zhuǎn)基因有機體或突變體)會在消費者中引起畏懼和擔(dān)憂。這種對轉(zhuǎn)基因有機體不利的負面形象在某些國家表現(xiàn)為公眾傾向于“抵制”含有轉(zhuǎn)基因有機體的食品。另外，消費者總是苛求推薦給他們的食品內(nèi)容以及產(chǎn)品包含的各成分來源的透明度，在這一情況下，工業(yè)界會被迫推薦近乎專一的，甚至是專一的無轉(zhuǎn)基因有機體的產(chǎn)品。在本發(fā)明所處的情況下，專一地利用自然菌株或來自自然菌株的變種來生產(chǎn)源于工業(yè)并含有微生物的食品是很有優(yōu)勢的。根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及獲得某乳酸菌菌株自然變種的方法，所述變種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下可以比在相同條件下培養(yǎng)的所述乳酸菌菌株生產(chǎn)更多的維生素K2，倍數(shù)至少等于I. 2，所述方法至少包括a)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下在選擇性介質(zhì)上培養(yǎng)所述乳酸菌菌株，所述介質(zhì)誘發(fā)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變；以及b)將與相同條件下培養(yǎng)的乳酸菌菌株相比，生產(chǎn)至少I. 2倍的維生素K2的變種選擇出來。所述“變種”在本發(fā)明的意義下是能夠比衍生它們的菌株生產(chǎn)更多維生素K2的乳酸菌菌株。更精確地，本發(fā)明的變種能夠生產(chǎn)的維生素K2是初始菌株生產(chǎn)的維生素K2的至少I. 2倍。更優(yōu)的是，根據(jù)本發(fā)明的變種生產(chǎn)維生素K2的產(chǎn)量比相同標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下培養(yǎng)的初始乳酸菌菌株的產(chǎn)量更多，倍數(shù)至少約等于I. 5。這個倍數(shù)還可以更好，更優(yōu)選約等于I. 7，更優(yōu)選約等于I. 8，更優(yōu)選約等于I. 9。這個倍數(shù)值更優(yōu)的是至少約等于2、2. 2,2. 4、2. 5、2. 7、2. 8、2. 9、3?！皡⒄铡被颉俺跏肌钡娜樗峋晔茄苌吮景l(fā)明的變種的菌株。這些菌株可以是自然菌株或者它們本身就是某個變種，也就是說自然變種或突變株。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“實驗室條件”是完全標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵條件并被所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。因此，詞組“實驗室條件”和“標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件”在這里完全是同意詞。在本發(fā)明意義下最優(yōu)的“實驗室條件”如下在商用介質(zhì)M17 (DifcoTM M17)或等同的介質(zhì)上預(yù)先培養(yǎng)菌株。接下來的培養(yǎng)中借助預(yù)培養(yǎng)實現(xiàn)1%的接種。培養(yǎng)溫度為大約30° C。要記住實驗室條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其總體的知識按需要來改變，有可能在常規(guī)的校準(zhǔn)實驗之后。培養(yǎng)基是適于培養(yǎng)乳酸菌菌株特別是乳球菌屬的某些種的菌株的介質(zhì)。根據(jù)一種最佳的實現(xiàn)方式，乳酸菌菌株從乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸球菌屬(Enterococcus)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)中選擇。它特別是從乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、葡聚糖明串珠菌、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、丙酸桿菌的種。
優(yōu)選地，如下文所述，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，要實現(xiàn)一個從含有桿菌肽或氧化劑如過氧化物的培養(yǎng)基中選擇的選擇性介質(zhì)。如此實現(xiàn)的選擇性介質(zhì)可以誘發(fā)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。有利的是，這一變化和從表I列出的I 27號基因中選擇的至少一種基因的表達在所述變種中相對于衍生它的乳酸菌菌株中的變化相關(guān)聯(lián)表I
權(quán)利要求
1.乳酸菌菌株自然變種，該自然變種為乳酸乳球菌乳脂亞種(LactococcusIactissubsp. cremoris) CNCM 1-3558,所述乳酸菌菌株自然變種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下可以比在相同條件下培養(yǎng)的所述乳酸菌菌株生產(chǎn)更多的維生素K2，倍數(shù)至少等于I. 2。
2.權(quán)利要求I記載的乳酸菌菌株自然變種的生物學(xué)純培養(yǎng)物。
3.包括權(quán)利要求I記載的變種的乳酸酵素。
4.制造富含維生素K2食品的方法，其至少包括 a)在所述產(chǎn)品的中間制備階段，使用權(quán)利要求I記載的變種和/或者權(quán)利要求3記載的酵素；以及 b)獲得所述富含維生素K2的產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4記載的方法獲得的富含維生素K2的食品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5記載的食品，其特征在于，它是一種發(fā)酵產(chǎn)品和/或鮮乳制品。
7.權(quán)利要求I記載的變種和/或者權(quán)利要求3記載的酵素的用途，其用于制備富含維生素K2的食品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的用途，其特征在于，所述富含維生素K2的食品使食用者的骨骼更強壯。
全文摘要
本發(fā)明涉及獲得用于生產(chǎn)維生素K2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應(yīng)用，具體涉及一種乳酸菌菌株自然變種，該自然變種為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)CNCM I-3558，所述乳酸菌菌株自然變種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下可以比在相同條件下培養(yǎng)的所述乳酸菌菌株生產(chǎn)更多的維生素K2，倍數(shù)至少等于1.2。
文檔編號C12R1/01GK102732457SQ20121018741
公開日2012年10月17日 申請日期2007年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月4日
發(fā)明者佩吉·加羅, 克洛艾·貝亞爾, 加埃勒·凱雷, 吉約姆·戈貝爾, 熱拉爾·利波夫斯基, 納塔利亞·博基爾, 讓-米歇爾·福里 申請人:達能日爾維公司