本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)和釀酒領(lǐng)域。涉及一株耐乳酸的產(chǎn)酯酵母。
背景技術(shù)：
：中國白酒的主要成分是乙醇和水(占總量的98％－99％)，而占總量1％-2％的微量成分(指溶于酒中的酯、酸、醇、醛等種類眾多的微量有機化合物)作為白酒的呈香呈味物質(zhì)，卻決定著白酒的風格與品質(zhì)。其中，微量成分中酯類物質(zhì)具有芳香的風味物質(zhì)，是形成酒體香氣濃郁的主要因素。在各香型白酒國家標準中，總酯含量是劃分白酒等級的重要指標，例如醬香型優(yōu)級酒總酯含量應(yīng)高于2.2g/l，濃香型優(yōu)級酒總酯含量應(yīng)高于2.0g/l。同時，不同酯類物質(zhì)各自具有獨特的香氣特征，如乙酸乙酯香氣較清純優(yōu)雅，丙酸乙酯果香舒適、乙酸苯乙酯具有玫瑰的甜香，酒中酯類物質(zhì)的多樣性，有助于提升其風味的豐富性與協(xié)調(diào)性。因此，如何提高白酒中酯類的含量及豐富白酒中酯類的多樣性，是白酒生產(chǎn)者普遍關(guān)注的問題。酒中酯類物質(zhì)主要是在釀造過程產(chǎn)酯酵母代謝生成，通過蒸餾取酒環(huán)節(jié)進入。而釀造環(huán)境為酸性環(huán)境，酒醅中含有大量的乳酸，一般不適合產(chǎn)酯酵母的生長繁殖，從而影響酯類物質(zhì)的代謝生成。如專利《一種高耐受性產(chǎn)酯酵母菌株及其應(yīng)用》(專利號：201310191489.0)中篩選獲得了一株環(huán)境耐受性強且產(chǎn)乙酸乙酯能力強的酵母，但該專利并未闡述此酵母對酒醅中主要酸類物質(zhì)——乳酸的耐受能力情況，同時該酵母菌主要代謝產(chǎn)物只是乙酸乙酯，產(chǎn)酯種類較少。因此選育適應(yīng)性好、耐受性好，特別是耐受乳酸能力強、產(chǎn)酯豐富的酵母成為解決這一難題的關(guān)鍵因素。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述提高酒中酯類種類與含量措施中存在的問題和缺陷，本發(fā)明的目的是選育出一種能夠在實際釀造環(huán)境下，特別是在高乳酸濃度下能夠代謝豐富的酯類物質(zhì)的酵母菌。一方面，本發(fā)明提供了一株高耐受乳酸的產(chǎn)酯畢赤酵母。該畢赤酵母菌已于2017年04月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno：14068，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。分類命名為庫德里阿茲威氏畢赤酵母(pichiakudriavzevii)1)菌株來源：本發(fā)明所獲得的庫德里阿茲威氏畢赤酵母(pichiakudriavzevii)，是從白酒釀造過程中分離得到，該畢赤酵母菌生長迅速，適應(yīng)性好、耐受乳酸能力強、產(chǎn)酯種類豐富且產(chǎn)量高。2)形態(tài)特征：該畢赤酵母的菌落呈白色，表面粗糙，易挑取，菌落較大。利用顯微鏡觀察該菌株的細胞形態(tài)，在15×40倍下該菌株細胞呈橢圓形，且有出芽，其繁殖方式為出芽。3)耐受性：所述的耐乳酸產(chǎn)酯酵母可在0％-15％(體積濃度)的乳酸濃度下生長繁殖，所述的耐乳酸產(chǎn)酯酵母的最高耐受溫度為45攝氏度，最適宜生長溫度為30℃；最高耐受乙醇濃度為10％(體積濃度)；最高耐受乙酸濃度為3％(體積濃度)。其可以在溫度25℃-45℃、乙醇濃度0％-10％(體積濃度)，乙酸濃度0％-3％(體積濃度)條件下生長繁殖。4)菌株種子液的培養(yǎng)方法：所述的耐乳酸產(chǎn)酯酵母菌株種子液培養(yǎng)方法為：250ml的三角瓶中裝入100ml液體培養(yǎng)基，121℃，滅菌15min，再從斜面上挑取一環(huán)該菌株于培養(yǎng)液中，28℃-40℃，靜止培養(yǎng)2-4天即得。其中，所述種子液培養(yǎng)基的含有：乳酸10-30g/l，葡萄糖10-30g/l，蛋白胨15-30g/l，酵母膏5-15g/l，氯化鈉0.5-1.5g/l，ph3.2±0.5，該ph為自然ph，無需通過酸堿調(diào)配)。5)產(chǎn)酯特性：該庫德里阿茲威氏畢赤酵母(pichiakudriavzevii)在0％-12％乳酸環(huán)境下代謝產(chǎn)生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯等多種乙酯類揮發(fā)性風味物質(zhì)中的一種或多種。另一方面，本發(fā)明還提供了該畢赤酵母的代謝產(chǎn)物。所述的代謝產(chǎn)物為乙酯類揮發(fā)性風味物質(zhì)。其中，所述的乙酯類揮發(fā)性風味物質(zhì)包含乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯等多種風味物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還提供了該畢赤酵母在釀酒中的應(yīng)用。該畢赤酵母產(chǎn)生的乙酯類風味物質(zhì)，可以提高白酒的風味和品質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還提供了畢赤酵母用于釀酒的方法，其特征在于，取下甑冷卻后酒醅，加入糖化劑或大曲，再接入體積為酒醅質(zhì)量1％-5％的畢赤酵母種子液，攪拌均勻后堆積于室內(nèi)，保持室內(nèi)環(huán)境溫度為25℃-35℃之間，發(fā)酵3-5天后可提高酒醅中酯類物質(zhì)含量。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明得到了一株耐受高濃度乳酸且產(chǎn)酯種類豐富的酵母菌，該菌可在0％-15％(體積濃度)的乳酸濃度下生長繁殖，并在0％-12％(體積濃度)乳酸環(huán)境下代謝產(chǎn)生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多種乙酯類揮發(fā)性風味物質(zhì)。附圖說明圖1為耐乳酸產(chǎn)酯酵母的菌株的菌落形態(tài)。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體的實施方式來對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的限定，但要求保護的范圍不僅局限于所作的描述。需要說明的是，本發(fā)明中“接入體積為酒醅質(zhì)量1％-5％的畢赤酵母種子液”，其中，畢赤酵母種子液的體積與酒醅質(zhì)量的單位對應(yīng)關(guān)系如ml/g，l/kg，或者依次類推。實施例1耐乳酸產(chǎn)酯畢赤酵母的篩選稱取大曲或酒醅樣品10g于90ml帶玻璃珠無菌水中，充分振蕩均勻，吸取0.1ml上清液到富集培養(yǎng)基液體中，30℃條件下靜止培養(yǎng)2-4天，觀察培養(yǎng)液是否渾濁，并進行聞香；若培養(yǎng)液已明顯渾濁且聞香有愉悅的水果香氣時，吸取0.1ml富集液于新的篩選培養(yǎng)基中再次進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4次后將培養(yǎng)液梯度稀釋于平板上，培養(yǎng)3～4天后，挑取單菌落進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液的風味物質(zhì)，挑選產(chǎn)酯能力最高的菌株即為目標菌株。篩選培養(yǎng)基的組成為：乳酸20g/l，葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，氯化鈉1g/l，ph3.2(自然ph)。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：乳酸40g/l，葡萄糖50g/l，蛋白胨2g/l，酵母膏1g/l，磷酸氫二鉀1g/l，氯化鈉1g/l，硫酸鎂0.1g/l，硫酸錳0.05g/l，ph2.9(自然ph)。實施例2耐乳酸產(chǎn)酯畢赤酵母的鑒定對獲得的高效降解乳酸的菌株進行菌落形態(tài)觀察(圖1)，發(fā)現(xiàn)該菌落呈白色，表面粗糙，易挑取，菌落較大。利用顯微鏡觀察該菌株的細胞形態(tài)，在15×40倍下該菌株細胞呈橢圓形，且有出芽，可初步確定為酵母菌。利用酵母特異分類鑒定引物擴增菌株的26srdna片段，并將擴增產(chǎn)物連接到pmd18-t載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行測序與比對，確定所篩得酵母的種屬，其分類命名為：庫德里阿茲威氏畢赤酵母(pichiakudriavzevii)。已于2017年04月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno：14068。實施例3不同耐受條件下菌株生長能力釀造環(huán)境對微生物的生長及代謝有著十分重要的影響。而在白酒釀造過程由于發(fā)酵溫度、乙醇濃度、基質(zhì)酸度等不斷變化，造成微生物所處環(huán)境也時刻發(fā)生變化，因此研究了該酵母菌株在不同發(fā)酵溫度、乙醇濃度、乙酸濃度、乳酸濃度條件下的生長情況。溫度耐受性實驗：將活化后的畢赤酵母菌2％(畢赤酵母種子液的體積/ypd液體培養(yǎng)基的體積)種子液接種到裝有100mlypd液體培養(yǎng)基的三角瓶中，分別放置在25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下條件下靜止培養(yǎng)4天后，測定600nm波長下的od值，濃度大的菌液可以作適當稀釋，經(jīng)稀釋后測得的od值乘以稀釋倍數(shù)，即為培養(yǎng)液實際的od值。從表1中可以看出，該畢赤酵母菌在42℃下仍有較高生長量，在45℃下菌株生長微弱。因此該菌株的最高耐受溫度為45℃，最適生長溫度30℃。表1不同溫度下畢赤酵母生長情況溫度25℃30℃37℃42℃45℃47℃od值32.634.733.816.20.260.06乙醇耐受性實驗：ypd液體培養(yǎng)基滅菌后，分別加入不同體積的無水乙醇，使ypd液體培養(yǎng)基中乙醇的濃度為0％、2％、4％、6％、8％、10％(體積濃度)的無水乙醇，然后將2％(畢赤酵母種子液的體積/ypd液體培養(yǎng)基的體積)種子液接入，30℃條件下靜止培養(yǎng)4天后，測定600nm波長下的od值，濃度大的菌液可以作適當稀釋，經(jīng)稀釋后測得的od值乘以稀釋倍數(shù)，即為培養(yǎng)液實際的od值。從表2中可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高，菌株生長旺盛；但當乙醇濃度進一步上升時，該畢赤酵母菌受到明顯抑制。表2不同乙醇濃度下畢赤酵母生長情況乙醇濃度0％2％4％6％8％10％od值34.745.649.848.733.910.1乙酸耐受性實驗：ypd液體培養(yǎng)基滅菌后，分別加入不同體積的乙酸，使ypd液體培養(yǎng)基中乙酸的濃度為0％、0.5％、1％、2％、3％、4％(體積濃度)的乙酸，然后將2％(畢赤酵母種子液的體積/ypd液體培養(yǎng)基的體積)種子液接入，30℃條件下靜止培養(yǎng)4天后，測定600nm波長下的od值，濃度大的菌液可以作適當稀釋，經(jīng)稀釋后測得的od值乘以稀釋倍數(shù)，即為培養(yǎng)液實際的od值。從表3中可以看出，當乙酸濃度為0.5％時菌株生長od值最高，但當乙酸為2％時菌株受到明顯抑制，而在4％乙酸濃度下幾乎停止生長，因此菌株最高耐受3％乙酸。表3不同乙酸濃度下畢赤酵母生長情況乙酸濃度0％0.5％1％2％3％4％od值34.735.417.247.630.850.17乳酸耐受性實驗：ypd液體培養(yǎng)基滅菌后，分別加入不同體積的乳酸，使ypd液體培養(yǎng)基中乳酸的濃度為0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、15％(體積濃度)的乳酸，然后將2％(畢赤酵母種子液的體積/ypd液體培養(yǎng)基的體積)種子液接入，30℃條件下靜止培養(yǎng)4天后，測定600nm波長下的od值，濃度大的菌液可以作適當稀釋，經(jīng)稀釋后測得的od值乘以稀釋倍數(shù)，即為培養(yǎng)液實際的od值。從表4中可以看出，當乳酸濃度為12％時菌株生長抑制嚴重，而乳酸達到15％，菌株od值只有0.5，因此菌株最高乳酸耐受濃度為15％。表4不同乳酸濃度下畢赤酵母生長情況乳酸濃度0％2％4％6％8％10％12％15％od值34.734.836.330.721.315.53.20.5實施例4不同乳酸濃度條件下菌株產(chǎn)酯能力在含有5％葡萄糖的ypd液體培養(yǎng)基中，分別加入不同體積的乳酸，使ypd液體培養(yǎng)基中乳酸的濃度為0％、2％、4％、8％、10％、12％、15％(體積濃度)的乳酸，然后將2％(畢赤酵母種子液的體積/ypd液體培養(yǎng)基的體積)種子液接入，30℃條件下靜止培養(yǎng)4天后，測定發(fā)酵液中酯類物質(zhì)的種類與含量。從表5中發(fā)現(xiàn)，該畢赤酵母菌株在乳酸濃度為4％時產(chǎn)酯能力最強，在乳酸濃度為15％時產(chǎn)酯能力受到嚴重抑制，表明該菌株可在0％-12％乳酸濃度下進行產(chǎn)酯，但不同酯類物質(zhì)在不同乳酸濃度下產(chǎn)量差異大，如乙酸乙酯在為4％乳酸濃度時產(chǎn)量最高，丙酸乙酯在8％乳酸濃度時產(chǎn)量最高，而辛酸乙酯在0％乳酸濃度時產(chǎn)量最高。表5不同乳酸濃度下畢赤酵母產(chǎn)酯能力(×106峰面積)實施例5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯能力以蒸餾下甑后的酒醅(測得乳酸含量為2.43％)為基質(zhì)，加入0.5％(糖化酶的質(zhì)量/酒醅質(zhì)量)的糖化酶，再接入2％(畢赤酵母種子液的體積/酒醅質(zhì)量)的畢赤酵母種子液，攪拌均勻，30℃，靜止培養(yǎng)4天，以加入0.5％的糖化酶但不接菌液的酒醅為空白對照。培養(yǎng)結(jié)束后，測定酒醅中酯類物質(zhì)含量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，當在酒醅中接入畢赤酵母后，酒醅中酯類含量都得到了不同幅度提升，其中乙酸乙酯含量最高，其次為乙酸苯乙酯。表6固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)酯能力(×106峰面積)在此有必要指出的是，以上實施例僅限于對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的闡述和理解，不能理解為對本發(fā)明的進一步限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員在此基礎(chǔ)上，作出的非突出實質(zhì)性特征和非顯著進步的改進，仍然屬于本發(fā)明的保護范疇。當前第1頁12