本發(fā)明具體涉及一種通過(guò)固定化微生物共培養(yǎng)利用蔗糖異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

微藻作為一類光合自養(yǎng)型微生物，可以利用光能通過(guò)光合作用將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化成多種化學(xué)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素等，此外，某些藻類還可以積累一些具有較高附加值的生物活性物質(zhì)，如雨生紅球藻可以積累較高含量的蝦青素，螺旋藻可產(chǎn)生較高的胡蘿卜素。基于上述特性，微藻可以廣泛應(yīng)用于動(dòng)物及水產(chǎn)餌料、食品、藥品、保健品以及食品添加劑等的生產(chǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

所有的藻類均具有光合能力，因此，微藻通常采用光合自養(yǎng)型的培養(yǎng)模式，自養(yǎng)培養(yǎng)僅需要提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基成本低，且生長(zhǎng)過(guò)程中可固定co2，但是細(xì)胞在自養(yǎng)生長(zhǎng)下，細(xì)胞的生長(zhǎng)容易受到光照條件的限制，使得光合反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和運(yùn)行比較困難，而且自養(yǎng)生長(zhǎng)下細(xì)胞的生長(zhǎng)通常比較緩慢，培養(yǎng)周期通常較長(zhǎng)，且最終生物量濃度較低，而較低的生物量濃度會(huì)進(jìn)一步增加后續(xù)細(xì)胞采收過(guò)程的難度。相比之下，通過(guò)添加有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，可以顯著促進(jìn)微藻培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，大大縮短培養(yǎng)周期，并且可以達(dá)到較高的生物量濃度，此外，異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需光照，反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和運(yùn)行比較簡(jiǎn)單。

針對(duì)微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)，研究人員已做了大量的研究，異養(yǎng)培養(yǎng)研究中大多利用葡萄糖為碳源，但是由于葡萄糖的成本較高，導(dǎo)致培養(yǎng)過(guò)程的成本過(guò)高，從而使得基于葡萄糖的微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性較差。在制糖工業(yè)中會(huì)產(chǎn)生大量的蔗渣、廢糖蜜等下腳料，這類廢棄物中富含大量的蔗糖以及其他糖類，是一種較好的微生物培養(yǎng)的碳源，在微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)中具有較好的應(yīng)用前景。但是，當(dāng)前的研究顯示，在異養(yǎng)條件下，大多數(shù)微藻對(duì)蔗糖等二糖的代謝能力較差，難以直接利用蔗糖生長(zhǎng)，這主要是由于多數(shù)藻類缺乏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，難以直接將蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)利用，同時(shí)，細(xì)胞缺乏胞外蔗糖酶，不能在胞外降解蔗糖。

在眾多的微生物中，許多微生物細(xì)胞均具有胞外蔗糖酶分泌能力，如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，紅發(fā)夫酵母(phaffiarhodozyma)，粘紅酵母(rhodotorulaglutinis)等，它們可以在胞外將蔗糖降解為單糖后供細(xì)胞吸收利用(wieczorker.,krampes.,weierstallt.,etal.concurrentknock-outofatleast21transportergenesisrequiredtoblockuptakeofhexosesinsaccharomycescerevisiae.febslett.,1999,464:123-128)；此外，通常情況下細(xì)胞對(duì)蔗糖的降解速度遠(yuǎn)高于細(xì)胞對(duì)糖的吸收速度，使得胞外具有明顯的單糖積累(kilians.g.,sutherlandf.c.w.,meyerp.s.,etal.transport-limitedsucroseutilizationandneokestoseproductionbyphaffiarhodozyma.biotechnol.lett.,1996,18:975-980)?；谏鲜鰴C(jī)制，cn105441524a和cn105441525a分別公開(kāi)了一種基于酵母共培養(yǎng)來(lái)提高以蔗糖為碳源下微藻油脂及蝦青素生產(chǎn)的方法，通過(guò)將特定的微藻與特定的酵母共培養(yǎng)，微藻可以利用酵母胞外降解產(chǎn)生的單糖異養(yǎng)生長(zhǎng)，有效的解決了微藻難以利用蔗糖異養(yǎng)生長(zhǎng)的問(wèn)題(wangs.k.,wuy.,wangx.heterotrophiccultivationofchlorellapyrenoidosausingsucroseasthesolecarbonsourcebyco-culturewithrhodotorulaglutinis.bioresour.technol.,2016,220:615-620)。但是，上述方法在培養(yǎng)結(jié)束后，微藻與酵母細(xì)胞處在同一體系中，難以將二者分離開(kāi)，最終不能得到純的微藻藻體，因此，難以應(yīng)用于以藻細(xì)胞為主要目標(biāo)物的微藻培養(yǎng)過(guò)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在以蔗糖為碳源的微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，針對(duì)微藻難以異養(yǎng)代謝蔗糖，以及現(xiàn)有微藻-酵母共培養(yǎng)體系中二者難以分離的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)與固定化微生物共培養(yǎng)利用蔗糖異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，先將具有胞外蔗糖酶分泌能力的微生物進(jìn)行固定化，然后將其與微藻進(jìn)行共培養(yǎng)，在該體系中，微藻可以利用固定化細(xì)胞降解蔗糖產(chǎn)生的單糖進(jìn)行生長(zhǎng)，有效解決蔗糖異養(yǎng)培養(yǎng)下微藻難以利用蔗糖的問(wèn)題，同時(shí)，細(xì)胞的固定化使得培養(yǎng)體系中微藻處于純培養(yǎng)狀態(tài)，在培養(yǎng)結(jié)束后，可以獲得純培養(yǎng)的微藻細(xì)胞，可廣泛適用于各種藻基生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種通過(guò)與固定化微生物共培養(yǎng)利用蔗糖異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法包括以下步驟：

(1)微生物細(xì)胞的固定化：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的細(xì)胞進(jìn)行固定化；

(2)配置培養(yǎng)基：在搖瓶或者反應(yīng)器中，加入含蔗糖或蔗糖替代物的常規(guī)的微藻培養(yǎng)基，滅菌冷卻后待接種；

(3)接種：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微藻細(xì)胞以一定的接種量接入，然后，加入特定量的含固定化微生物的微球，開(kāi)始培養(yǎng)；

(4)培養(yǎng)及細(xì)胞收集：在適宜的溫度及通氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾即可將含微生物的微球分離，獲得純?cè)逡骸?/p>

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述微生物為具有胞外蔗糖酶表達(dá)能力的微生物，既包括野生型的釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粘紅酵母(rhodotorulaglutinis)、黑曲霉(aspergillusniger)等具有胞外蔗糖酶活性微生物，也包括利用基因工程改造后的工程菌株；固定化方法包括常規(guī)的吸附、包埋、交聯(lián)。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述反應(yīng)裝置包括不同規(guī)格的搖瓶，氣升式反應(yīng)器，鼓泡塔反應(yīng)器，板式反應(yīng)器等，但不包括機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐等剪切力較高的反應(yīng)器；所述微藻培養(yǎng)基為bg11培養(yǎng)基、chu13培養(yǎng)基、bbm培養(yǎng)基、ct培養(yǎng)基、se培養(yǎng)基；所述蔗糖或蔗糖替代物為純蔗糖、廢糖蜜、蔗渣；所述蔗糖或蔗糖替代物的添加量為1～80g/l。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述微藻為具有一定生產(chǎn)價(jià)值的小球藻、柵藻、衣藻、布朗葡萄藻、雨生紅球藻；微藻的接種量為2％～20％(v/v)；固定化微球中含有的微生物干重為微藻細(xì)胞干重的1％～20％(w/w)。

進(jìn)一步地，步驟(4)中，所述培養(yǎng)的溫度為18～30℃；通氣量為0.1～15vvm；培養(yǎng)的ph為6.5～9.5。

本發(fā)明提供的一種通過(guò)與固定化微生物共培養(yǎng)利用蔗糖異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，不僅解決了微藻難以利用蔗糖進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)的問(wèn)題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)有共培養(yǎng)技術(shù)存在的藻-菌難分離的問(wèn)題，在有效提高微藻對(duì)蔗糖的利用效率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了微藻的純培養(yǎng)。

與現(xiàn)有微藻的蔗糖異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程相比，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)及先進(jìn)性在于：

(1)本發(fā)明提供的方法可以有效地解決微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中難以利用蔗糖的問(wèn)題，使得微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)可以利用比較低廉的有機(jī)碳源進(jìn)行，提高了現(xiàn)有蔗糖廢料的利用率，廢物利用，降低了微藻培養(yǎng)過(guò)程的成本；

(2)本發(fā)明提供的方法通過(guò)將微生物細(xì)胞固定化，實(shí)現(xiàn)了微藻的純培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾即可實(shí)現(xiàn)藻-菌的分離，獲得純培養(yǎng)的微藻細(xì)胞，可廣泛適用于各種藻基生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程中。

具體實(shí)施方式

為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制的實(shí)施例如下：

實(shí)施例1

(1)釀酒酵母培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，通過(guò)海藻酸鈣包埋的方法將其固定化；

(2)在500ml三角瓶中，加入適量的bbm培養(yǎng)基，添加10g/l的純蔗糖，滅菌并冷卻；

(3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的橢圓小球藻以10％的接種量接入，然后加入含酵母干重為微藻干重5％的固定化酵母微球；

(4)在25℃、2vvm的通氣量以及ph7.0的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集藻液。

處理效果測(cè)試：

培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了3.5g/l。

實(shí)施例2

(1)黑曲霉培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，通過(guò)卡拉膠包埋的方法將其固定化；

(2)在2l氣升式反應(yīng)器中，加入適量的bg11培養(yǎng)基，添加80g/l蔗糖當(dāng)量的廢糖蜜，滅菌并冷卻；

(3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻以20％的接種量接入，然后加入含細(xì)胞干重為微藻干重20％的固定化黑曲霉微球；

(4)在18℃、15vvm的通氣量以及ph9.5的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集藻液。

處理效果測(cè)試：

培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了41.3g/l。

實(shí)施例3

(1)具有胞外蔗糖酶表達(dá)活性的大腸桿菌工程菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，通過(guò)戊二醛交聯(lián)的方法將其固定化；

(2)在5l板式反應(yīng)器中，加入適量的chu13培養(yǎng)基，添加50g/l蔗糖當(dāng)量的蔗渣，滅菌并冷卻；

(3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的布朗葡萄藻以5％的接種量接入，然后加入含細(xì)胞干重為微藻干重1％的固定化工程菌微球；

(4)在30℃、0.1vvm的通氣量以及ph6.5的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集藻液。

處理效果測(cè)試：

培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了24.2g/l。

實(shí)施例4

(1)茁芽絲孢酵母培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，通過(guò)中空纖維包埋的方法將其固定化；

(2)在1l鼓泡塔反應(yīng)器中，加入適量的se培養(yǎng)基，添加1g/l的純蔗糖，滅菌并冷卻；

(3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的萊茵衣藻以15％的接種量接入，然后加入含酵母干重為微藻干重10％的固定化酵母微球；

(4)在20℃、5vvm的通氣量以及ph7.5的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集藻液。

處理效果測(cè)試：

培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了0.4g/l。

實(shí)施例5

(1)粘紅酵母培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，通過(guò)角叉菜膠包埋的方法將其固定化；

(2)在2l三角瓶中，加入適量的ct培養(yǎng)基，添加30g/l蔗糖當(dāng)量的廢糖蜜，滅菌并冷卻；

(3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的二形柵藻以2％的接種量接入，然后加入含酵母干重為微藻干重15％的固定化酵母微球；

(4)在26℃、10vvm的通氣量以及ph8.0的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集藻液。

處理效果測(cè)試：

培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了13.3g/l。

實(shí)施例6

(1)斯達(dá)氏酵母培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，通過(guò)殼聚糖吸附的方法將其固定化；

(2)在10l氣升式反應(yīng)器中，加入適量的bg11培養(yǎng)基，添加60g/l的純蔗糖，滅菌并冷卻；

(3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻以8％的接種量接入，然后加入含酵母干重為微藻干重8％的固定化酵母微球；

(4)在28℃、8vvm的通氣量以及ph8.5的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集藻液。

處理效果測(cè)試：

培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了31.7g/l。

以上實(shí)施例中，微藻的終濃度受微藻種類、反應(yīng)器類型、培養(yǎng)條件的綜合影響，但是綜合各因素沒(méi)有明顯的規(guī)律可循。