一種小麥紋枯病菌的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥紋枯病菌的分離方法，屬于植物病原分離【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括以下步驟：(1)取采集到的有典型云紋狀病斑的小麥紋枯病植株，剪取莖基部有單個(gè)典型云紋狀病斑的莖段，用70～80％酒精消毒15～25秒鐘，無菌水洗凈；(2)取處理后的莖段在22～28℃黑暗條件下培養(yǎng)1～2天，挑取病斑處白色菌絲接種到含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，再在22～28℃黑暗條件下培養(yǎng)2～3天；(3)挑取小塊菌落轉(zhuǎn)至馬鈴薯蔗糖斜面培養(yǎng)基上，在22～28℃黑暗條件下培養(yǎng)4～6天，即可進(jìn)行菌株保存。該方法操作簡單，省時(shí)、省力，安全、經(jīng)濟(jì)，分離成功率高，達(dá)95％以上。
【專利說明】一種小麥紋枯病菌的分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物病原真菌的分離方法，具體涉及一種小麥紋枯病菌的分離方 法，屬于植物病原分離【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 在研究病原真菌的形態(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對(duì)寄主植物的致病性和篩選對(duì)病 原菌有抑制作用的藥劑等多種試驗(yàn)中，常常需要病原真菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況 下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨(dú)分離出 來，叫作植物病原真菌的分離。植物病原真菌的分離在植物病理學(xué)科研工作中具有十分重 要的地位。對(duì)分離到的病原真菌進(jìn)行保存可以滿足植物病理學(xué)日常教學(xué)的需要，使學(xué)生對(duì) 植物病原真菌有更直觀的認(rèn)識(shí)。
[0003] 小麥紋枯?。≧hizoctonia cerealis)是影響我國江淮流域、中原地區(qū)和華北平原 南部小麥生產(chǎn)的主要病害之一，自1998年以來呈加重發(fā)生的趨勢，造成小麥重大損失。小 麥感染紋枯病后，苗期會(huì)出現(xiàn)爛芽、死苗癥狀，成株期會(huì)出現(xiàn)花桿爛莖、倒伏，發(fā)病后期導(dǎo)致 枯白穗，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量。由于小麥紋枯病菌屬于弱寄生真菌，可從發(fā)病植株基部分離獲 得純培養(yǎng)，為以后的融合群鑒定及藥劑篩選等提供便利。小麥紋枯病菌的分離是進(jìn)行后續(xù) 研究的基礎(chǔ)。
[0004] 植物病原真菌的分離包括組織分離法和稀釋分離法。由于小麥紋枯病菌不產(chǎn)孢， 通常情況下采用組織分離法進(jìn)行分離。組織分離法的步驟包括：切取小塊患病組織（3? 5mm)，用75%酒精消毒20s左右，再用0. 1 %升汞溶液或2?3%的NaClO消毒3min左右， 最后用無菌水清洗2?3次，濾紙吸干水后轉(zhuǎn)入含有乳酸的PSA上培養(yǎng)3?4天，每皿4? 5塊，一般一個(gè)病斑切下的小塊放入一個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待病組織小塊上長出典型而無雜菌 的小麥紋枯病菌菌落時(shí)，用接種針挑取菌落邊緣小塊至斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3?4天無雜菌 生長，既得小麥紋枯病菌的純菌種，便可置于冰箱中保存。組織分離法在樣品較少時(shí)應(yīng)用很 好，成功率可達(dá)90%以上，但如果要進(jìn)行小麥紋枯病大量病株的分離，則凸顯許多問題：
[0005] (1)樣品處理較為繁瑣，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要對(duì)染病莖桿進(jìn)行切取，并經(jīng)歷兩次消毒， 還要用無菌濾紙吸干水分，一般每個(gè)病株需要處理15min左右才能將分離材料進(jìn)行培養(yǎng)；
[0006] (2)所需試劑、耗材較多，在消毒、清洗過程中需要多個(gè)培養(yǎng)皿，如培養(yǎng)時(shí)每個(gè)病株 切下的莖段都需要一個(gè)培養(yǎng)皿，如果病株較多，則需要的培養(yǎng)皿數(shù)更多，并且需要購買更多 的酒精和NaCIO,成本較高，而用升汞則易污染環(huán)境，且操作安全性較低；
[0007] (3)對(duì)試驗(yàn)操作嚴(yán)格，分離材料必須是新鮮的，消毒時(shí)間不可過長或過短，過長病 菌菌絲易被殺死，過短則消毒不徹底，易產(chǎn)生雜菌。
[0008] 由于組織分離法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、操作要求高等缺陷，不適宜對(duì)大量的小 麥紋枯病株進(jìn)行病原菌分尚。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種小麥紋枯病菌的分離方法。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0011] 一種小麥紋枯病菌的分離方法，包括以下步驟：
[0012] (1)取采集到的有典型云紋狀病斑的小麥紋枯病植株，剪取莖基部有單個(gè)典型云 紋狀病斑的莖段，用70?80%酒精消毒15?25秒鐘，無菌水洗凈；
[0013] (2)取處理后的莖段在22?28°C黑暗條件下培養(yǎng)1?2天（待病斑上長出白色 菌絲），挑取病斑處白色菌絲接種到含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，再在22?28°C黑暗條 件下培養(yǎng)2?3天；
[0014] (3)挑取小塊菌落轉(zhuǎn)至馬鈴薯蔗糖斜面培養(yǎng)基（PSA)上，在22?28°C黑暗條件下 培養(yǎng)4?6天，即可進(jìn)行菌株保存。
[0015] 所述步驟（1)中先將采集到的有典型云紋狀病斑的小麥紋枯病植株在室內(nèi)通風(fēng) 陰涼條件下攤開放置4?5天（以便于植株表面的水分揮發(fā)），再剪取莖基部有單個(gè)典型云 紋狀病斑的莖段。
[0016] 所述步驟⑴中莖段的長度為1. 5?3厘米。
[0017] 所述步驟（1)中莖段先用清水沖洗干凈，吸水紙吸干上面的水分后再用酒精消 毒。
[0018] 所述步驟⑵中先將處理后的莖段置于鋪有無菌濾紙的平底容器（如培養(yǎng)皿）中 (一個(gè)容器可以放置多個(gè)莖段），在容器中加入適量的無菌水保濕。
[0019] 所述步驟⑵中含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基的配方為：每200mL馬鈴薯蔗糖培養(yǎng) 基中含有〇. 5?I. 5mL濃度為20?30%的乳酸。
[0020] 所述的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA)的配方為：去皮馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂粉 16g，水 1000mL。
[0021] 所述步驟（3)中先選取生長一致的菌落，再用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 本發(fā)明根據(jù)病株濕度將從田間采回的小麥植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下放置一段 時(shí)間（4?5天），待上面的水分揮發(fā)后再進(jìn)行后續(xù)消毒處理，采用莖段保濕培養(yǎng)的方法， 使莖桿上盡快長出菌絲。同時(shí)為了排除細(xì)菌污染，莖段處理時(shí)應(yīng)先用70?80%的酒精消 毒（時(shí)間不宜過長），再接種于含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，兩者均有抑制細(xì)菌滋生的作 用。
[0024] 本發(fā)明中小麥紋枯病菌的分離方法操作簡單，對(duì)試驗(yàn)人員的要求不高，適于對(duì)大 量小麥紋枯病病株進(jìn)行病原菌的分離；優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：
[0025] (1)省力，該法僅需對(duì)發(fā)病莖桿進(jìn)行簡單處理，無需從一個(gè)病斑的病健交界處切取 5?6塊3_X 3_的組織塊，也無需升汞溶液或次氯酸鈉消毒、無菌水清洗及濾紙吸干等步 驟，操作簡單；
[0026] (2)省時(shí)，采用組織分離法進(jìn)行小麥紋枯病菌分離時(shí)，一般每個(gè)病株的操作過程需 要15min左右，而此法則可在Imin內(nèi)完成1個(gè)病株的酒精消毒、培養(yǎng)皿保濕的步驟，操作迅 速；
[0027] (3)經(jīng)濟(jì)，組織分離法同一病斑上切下的幾個(gè)組織小塊用酒精及NaClO消毒時(shí)各 需一副培養(yǎng)皿，三次無菌水清洗時(shí)又需要三幅培養(yǎng)皿，且每分離一個(gè)菌株培養(yǎng)皿均需更換 一次，1個(gè)病株至少需要5副培養(yǎng)皿才可以分離完畢，而此法保濕及分離時(shí)4?5個(gè)病株用 1個(gè)培養(yǎng)皿即可，且操作中不用升汞或NaClO等化學(xué)試劑，所需耗材及試劑很少，節(jié)約了試 驗(yàn)成本；
[0028] (4)分離成功率高，處理后的莖桿能很快長出白色菌絲，轉(zhuǎn)入PSA上后也能很快長 出小麥紋枯病菌的典型菌落，成功率達(dá)95%以上。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 本實(shí)施例中小麥紋枯病菌的分離方法，包括以下步驟：
[0032] (1)從田間采集小麥紋枯病病株，帶回實(shí)驗(yàn)室后攤開，室內(nèi)陰涼通風(fēng)條件下放置5 天；
[0033] (2)剪取病株莖基部有單個(gè)、典型的云紋狀病斑的一段莖桿，長約2厘米，清水沖 洗干凈，用吸水紙吸干上面的水分，75%酒精消毒20秒鐘，再用無菌水沖洗2次；
[0034] (3)將無菌水沖洗后的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿里，用移液槍向培養(yǎng) 皿中加入2mL無菌水保濕，25°C生化培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)2天，直至上面長出白色菌絲；
[0035] (4)用接種針從每個(gè)莖桿上挑取白色菌絲，轉(zhuǎn)入含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上 (每200mL PSA培養(yǎng)基中含有ImL濃度為25 %的乳酸；PSA培養(yǎng)基的配方為：去皮馬鈴薯 200g，蔗糖20g，瓊脂粉16g，水IOOOmL)，25°C生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)2天；
[0036] (5)選取生長一致的菌落，用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面上， 25°C生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5天，進(jìn)行菌株保存。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 本實(shí)施例中小麥紋枯病菌的分離方法，包括以下步驟：
[0039] (1)從田間采集小麥紋枯病病株，帶回實(shí)驗(yàn)室后攤開，室內(nèi)陰涼通風(fēng)條件下放置4 天；
[0040] (2)剪取病株莖基部有單個(gè)、典型的云紋狀病斑的一段莖桿，長1. 5厘米，清水沖 洗干凈，用吸水紙吸干上面的水分，70%酒精消毒25秒鐘，再用無菌水沖洗3次；
[0041] (3)將無菌水沖洗后的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿里，用移液槍向培養(yǎng) 皿中加入ImL無菌水保濕，22°C生化培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)3天，直至上面長出白色菌絲；
[0042] (4)用接種針從每個(gè)莖桿上挑取白色菌絲，轉(zhuǎn)入含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上 (每200mL PSA培養(yǎng)基中含有I. 5mL濃度為20%的乳酸；PSA培養(yǎng)基同實(shí)施例I)，22°C生化 培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3天；
[0043] (5)選取生長一致的菌落，用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面上， 22°C生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)6天，進(jìn)行菌株保存。
[0044] 實(shí)施例3
[0045] 本實(shí)施例中小麥紋枯病菌的分離方法，包括以下步驟：
[0046] (1)從田間采集小麥紋枯病病株，帶回實(shí)驗(yàn)室后攤開，室內(nèi)陰涼通風(fēng)條件下放置5 天；
[0047] (2)剪取病株莖基部有單個(gè)、典型的云紋狀病斑的一段莖桿，長3cm，清水沖洗干 凈，用吸水紙吸干上面的水分，80%酒精消毒15秒鐘，再用無菌水沖洗干凈；
[0048] (3)將無菌水沖洗后的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿里，用移液槍向培養(yǎng) 皿中加入I. 5mL無菌水保濕，28°C生化培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)2天，直至上面長出白色菌 絲；
[0049] (4)用接種針從每個(gè)莖桿上挑取白色菌絲，轉(zhuǎn)入含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上 (每200mL PSA培養(yǎng)基中含有0. 5mL濃度為30%的乳酸；PSA培養(yǎng)基同實(shí)施例I)，28°C生化 培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)2天；
[0050] (5)選取生長一致的菌落，用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面上， 28°C生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)4天，進(jìn)行菌株保存。
[0051] 試驗(yàn)例
[0052] 從洛陽市洛龍區(qū)豐李鎮(zhèn)小作村麥田米集小麥紋枯病病株132株，拿回實(shí)驗(yàn)室后選 取癥狀典型的病株1〇〇株，進(jìn)行小麥紋枯病菌的分離，采用組織分離法及莖段保濕培養(yǎng)法 各分離50株。
[0053] (1)傳統(tǒng)的組織分離法
[0054] 采用組織分離法分離時(shí)，對(duì)莖桿進(jìn)行清水處理后，剪取單個(gè)典型病斑的小麥莖桿， 每個(gè)莖段在病健交界處切取3mmX 3mm的組織塊，依次用70%酒精消毒25s，2. 5%的NaClO 消毒3min，然后在無菌水中沖洗三遍，無菌濾紙吸干水后放于含乳酸的PSA上培養(yǎng)，5d后觀 察，挑取生長一致的菌落進(jìn)行保存。
[0055] 由于此法要經(jīng)過莖桿分段再切塊、多次消毒、清水沖洗及濾紙吸干等步驟，一個(gè) 病株處理完畢約需15min，病株多時(shí)相當(dāng)費(fèi)力；且兩次消毒及三次清洗時(shí)需要的培養(yǎng)皿較 多（約200副），培養(yǎng)時(shí)每個(gè)病株又需要1個(gè)培養(yǎng)皿，所需耗材很多；操作過程中如酒精及 NaClO消毒時(shí)間把握不準(zhǔn)，易將病菌也殺死，故對(duì)操作要求高；50個(gè)病株分離用了 2周時(shí)間， 共分離到小麥紋枯病菌46株，成功率達(dá)92%。
[0056] (2)本發(fā)明中莖段保濕培養(yǎng)法
[0057] 采用莖段保濕培養(yǎng)法分離時(shí)，莖桿經(jīng)清水處理后，剪取單個(gè)典型病斑的莖段，2? 3cm，70%酒精消毒25s后在無菌水中沖洗一遍，然后將莖段放于皿底有無菌濾紙的培養(yǎng)皿 里保濕培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿放5個(gè)莖桿，50個(gè)病株需10個(gè)培養(yǎng)皿即可；3d后，莖段上已長出白 色菌絲；用接種針挑取莖段上的白色菌絲，轉(zhuǎn)至含乳酸的PSA上培養(yǎng)，每個(gè)PSA平板可轉(zhuǎn)5 個(gè)莖段上的菌絲，培養(yǎng)3d后進(jìn)行菌株保存。
[0058] 采用莖段保濕培養(yǎng)法，經(jīng)過一周的時(shí)間50株小麥紋枯病病株全部分離完畢，共得 到小麥紋枯病菌48株。
[0059] 上述兩種分離方法的比較見下表1。
[0060] 表1組織分離法與莖段保濕培養(yǎng)法的比較
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 取采集到的有典型云紋狀病斑的小麥紋枯病植株，剪取莖基部有單個(gè)典型云紋狀 病斑的莖段，用70?80%酒精消毒15?25秒鐘，無菌水洗凈； (2) 取處理后的莖段在22?28°C黑暗條件下培養(yǎng)1?2天，挑取病斑處白色菌絲接種 到含乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，再在22?28°C黑暗條件下培養(yǎng)2?3天； (3) 挑取小塊菌落轉(zhuǎn)至馬鈴薯蔗糖斜面培養(yǎng)基上，在22?28°C黑暗條件下培養(yǎng)4?6 天，即可進(jìn)行菌株保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：所述步驟（1)中先 將采集到的有典型云紋狀病斑的小麥紋枯病植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下攤開放置4?5 天，再剪取莖基部有單個(gè)典型云紋狀病斑的莖段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：所述步驟（1)中莖 段先用清水沖洗干凈，吸水紙吸干上面的水分后再用酒精消毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：所述步驟（2)中先 將處理后的莖段置于鋪有無菌濾紙的平底容器中，在容器中加入無菌水保濕。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：所述步驟（2)中含 乳酸的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基的配方為：每200mL馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中含有0. 5?1. 5mL濃度 為20?30%的乳酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：所述的馬鈴薯蔗糖 培養(yǎng)基的配方為：去皮馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂粉16g，水1000mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病菌的分離方法，其特征在于：所述步驟（3)中先 選取生長一致的菌落，再用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104293679SQ201410218757
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】徐建強(qiáng), 侯穎, 劉圣明, 范倩倩, 楊改鳳 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)