利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法，在側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus?laterosporu)發(fā)酵過程中，待抗菌肽產(chǎn)量不再增加時，向發(fā)酵液中直接添加活性炭，通過活性炭對發(fā)酵產(chǎn)物的吸附，解除產(chǎn)物抑制作用，從而大幅提高菌體密度和抗菌肽產(chǎn)量。本發(fā)明所用的吸附分離耦合劑為活性炭，成本低廉，對環(huán)境友好，發(fā)酵過程中直接添加，無需進行活化預(yù)處理，發(fā)酵液無需調(diào)節(jié)pH值，即可實現(xiàn)抗菌肽的吸附。工藝簡單，易于推廣，發(fā)酵結(jié)束后可以通過解吸附處理再生活性炭，實現(xiàn)了活性炭的多次重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們生活水平的提高和對食品安全的日益重視，消費者要求降低化學(xué)防腐劑的使用和抗生素的殘留，因此開發(fā)安全、高效的生物防腐劑成為食品工業(yè)的重要發(fā)展方向，其中抗菌肽(Antimicrobial peptide, AMP)由于其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì),在人或動物體內(nèi)無藥物殘留、無免疫原性、無毒性，在替代化學(xué)防腐劑和抗生素方面具有潛在的應(yīng)用價值。
[0003]抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子多肽，第一個分離獲得的抗菌肽來自于天蠶的蠶蛹，迄今為止，在多種動物、植物和微生物中已發(fā)現(xiàn)了 600多種內(nèi)源性的抗菌肽，但動物源和植物源抗菌肽來源有限，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，而微生物源抗菌肽具有發(fā)酵周期短、成本低、易于培養(yǎng)、易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，已成為抗菌肽研究的重要方向。國內(nèi)外關(guān)于微生物抗菌肽的研究已有50多年的歷史，研究最多的是乳酸菌來源的細菌素——Nisin，其已被批準(zhǔn)可用于食品工業(yè)，但乳酸菌來源的Nisin大多具有抗菌譜窄、穩(wěn)定性差等問題，因此，進一步開發(fā)新型非乳酸菌抗菌肽成為一項迫切且長期的任務(wù)。
[0004]芽孢桿菌屬(Bacillus)由于其在食品工業(yè)中具有安全的應(yīng)用歷史，尤其是側(cè)孢短芽孢桿菌，其產(chǎn)生的抗菌肽具有安全性高、抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、無殘留等優(yōu)點，是非乳酸菌細菌素的一個重要來源，成為近年研究的熱點，已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料和作物病害防治領(lǐng)域。近年來對側(cè)孢短芽孢桿菌抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)，在芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的過程中，當(dāng)抗菌肽達到一定產(chǎn)量后不再增加，表現(xiàn)出一種產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，不僅影響了自身菌體的生長，同時還抑制了抗菌肽的進一步合成?；诖耍岣呖咕牡漠a(chǎn)量，單純通過補加培養(yǎng)基的連續(xù)發(fā)酵工藝達不到生產(chǎn)目的，而應(yīng)該考慮如何解除抗菌肽的這種抑制作用，從而從根本上解決限制抗菌肽實現(xiàn)高產(chǎn)量的瓶頸問題。
[0005]將微生物發(fā)酵與產(chǎn)物分離相耦合的技術(shù)在解決發(fā)酵過程中產(chǎn)物抑制方面效果顯著，且操作方便，這種原位分離發(fā)酵技術(shù)可以選擇性地從發(fā)酵液中連續(xù)地分離出對菌體有抑制性或不穩(wěn)定的產(chǎn)物，既可以使發(fā)酵過程向產(chǎn)物合成的方向進行，還能降低產(chǎn)物在復(fù)雜環(huán)境下自然降解的作用。目前涉及的原位分離技術(shù)主要包括膜發(fā)酵法、電滲析法、溶劑萃取法以及吸附法。從工業(yè)化生產(chǎn)角度看，吸附法以其成本低、選擇性高、交換容量大、操作簡單、易于自動控制等優(yōu)點，成為實現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌抗菌肽高發(fā)酵產(chǎn)量的有效途徑。 [0006]近年來，國內(nèi)外研究者開始探索利用發(fā)酵吸附分離耦合法提高小分子肽的產(chǎn)量。吳兆亮等[徐浩，吳兆亮，殷昊，閻瑾.發(fā)酵吸附分離耦合生產(chǎn)乳酸鏈球菌素工藝.高分子材料科學(xué)與工程，2010, 26 (10): 155-158]報道，在Nisin的發(fā)酵生產(chǎn)中加入陽離子交換樹脂D113作為吸附劑進行吸附耦合發(fā)酵，到達發(fā)酵終點時，Nisin的效價由原來3350IU/mL提高到5189IU/mL，提高了 54.9% ;然而樹脂成本高，且投入發(fā)酵液前需要進行活化處理，操作復(fù)雜° Pongtharangku 等[Pongtharangku T, Demirci A.0nline recovery of nisinduring fermentation and its effect on nisin production in biofilm reactor.AppliedMicrobiology and Biotechnology, 2007, 74(3): 555-562]利用微生物發(fā)酵與膜分離和吸附分離耦合法生產(chǎn)Nisin，該方法使Nisin效價提高近了 4倍，效果顯著，但是該生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本較高，且發(fā)酵液PH值影響大，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。因此，尋找成本低廉、操作簡單的發(fā)酵工藝成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種利用廉價吸附分離耦合劑解除抗菌肽發(fā)酵過程中的產(chǎn)物抑制進而提高菌體密度和抗菌肽產(chǎn)量的方法。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法，在側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporu)發(fā)酵過程中,待抗菌肽產(chǎn)量不再增加時，向發(fā)酵液中直接 添加活性炭，通過活性炭對發(fā)酵產(chǎn)物的吸附，解除產(chǎn)物抑制作用，從而提高菌體密度和抗菌肽產(chǎn)量。
[0009]在發(fā)酵過程中直接添加一種吸附分離耦合劑——活性炭，活性炭無需前期活化處理，無需制備吸附柱，發(fā)酵液無需調(diào)節(jié)PH值，即可解除產(chǎn)物抑制作用，提高發(fā)酵菌體的密度和抗菌肽的產(chǎn)量。
[0010]本發(fā)明中涉及的側(cè)孢短芽孢桿菌包括但不限于B.laterosporu ASl.6343、B.laterosporu ASl.2827、B.laterosporu ASl.2739、B.laterosporu ASl.864、B.laterosporu ACCC06527、B.laterosporu ACCC05440、B.laterosporu ACCC10390 等。
[0011]利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的具體工藝如下:
[0012]I)種子液制備:將側(cè)孢短芽孢桿菌的斜面或甘油管接入滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)溫度30-37°C，培養(yǎng)時間12-24h，獲得一級種子液；然后將一級種子液按3-5￥八％接種量接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30-37°C，培養(yǎng)6-18h，獲得菌濃度為IO7-1O8Cfu/mL的二級種子液；
[0013]2)發(fā)酵培養(yǎng):向發(fā)酵罐內(nèi)裝入發(fā)酵罐體積60-80%的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入步驟I)制備的二級種子液，接種量3-5v/v% ;發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30-34°C，轉(zhuǎn)速200-400r/min，通氣量 1:0.1-1:0.5v/v/min，溶氧 60-70%，培養(yǎng)時間 12_24h ；
[0014]3)活性炭吸附:當(dāng)發(fā)酵12_24h抗菌肽產(chǎn)量不再增加時，向發(fā)酵液中添加活性炭，同時補加發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基，活性炭添加量l_4w/v%，發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基補加量l-3v/v%，繼續(xù)發(fā)酵12_24h ;發(fā)酵條件同步驟2)。
[0015]其中，步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:碳源0.5-3.0w/v%、氮源0.5-3.0w/ 、無機鹽 0.005-1.0w/v%、表面活性劑 0.1-1.0w/v%,il pH7.0-7.4，以水配制。
[0016]步驟3)中所述發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基的配方為:碳源5.0-30.0w/v%、氮源5.0-30.0w/ 、無機鹽 0.05-10.0w/v%、表面活性劑 1.0-10.0w/v%，調(diào) ρΗ7.0-7.4，以水配制。
[0017]上述抗菌肽發(fā)酵工藝中，可利用的碳源選自葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜或甘油等中的一種或多種。
[0018]上述抗菌肽發(fā)酵工藝中，可利用的氮源選自玉米漿、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或豆柏粉等中的一種或多種。
[0019]上述抗菌肽發(fā)酵工藝中，可利用的無機鹽選自Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+或Cu2+鹽等中的一種或多種。
[0020]上述抗菌肽發(fā)酵工藝中，可利用的表面活性劑選自Tween-20、Tween-40>Tween-60、Tween-80, Triton X-100, Triton X-114, Triton X-116, TX-4, TX-6, TX-7, TX-8,TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7 或 AEO-9 等中的一種或多種。
[0021]上述抗菌肽發(fā)酵工藝中添加的活性炭為粉末狀或顆粒狀的竹炭、木炭、果殼炭或椰殼炭?；钚蕴课桨l(fā)酵產(chǎn)物后，可以通過解吸附等手段再生，實現(xiàn)活性炭的循環(huán)利用。
[0022]采用上述抗菌肽發(fā)酵工藝，在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵生產(chǎn)，與未添加活性炭相比，活菌數(shù)提高2-4個數(shù)量級，達到101(l-1012Cfu/mL，抗菌肽產(chǎn)量提高50-130 %，效價為2200-3500AU/mL。
[0023]本發(fā)明所用的發(fā)酵菌株為側(cè)孢短芽孢桿菌，又稱為側(cè)孢芽孢桿菌，其代謝產(chǎn)物具有抑制多種細菌、真菌的功能。在食品工業(yè)中，已經(jīng)被應(yīng)用于生產(chǎn)功能性食品和食品防腐保鮮。在飼料工業(yè)中，已經(jīng)被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)可用于飼用微生態(tài)制劑，應(yīng)用于肉雞、肉鴨、豬和蝦的養(yǎng)殖，具有極高的安全性，是一種潛在的益生菌。
[0024]本發(fā)明所用的吸附分離耦合劑為活性炭，成本低廉，對環(huán)境友好，發(fā)酵過程中直接添加，無需進行活化預(yù)處理，且發(fā)酵液無需調(diào)節(jié)PH值，即可實現(xiàn)抗菌肽的吸附。工藝簡單，易于推廣，發(fā)酵結(jié)束后可以通過解吸附處理再生活性炭，實現(xiàn)了活性炭的多次重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本。
[0025]本發(fā)明提供的抗菌肽發(fā)酵工藝解除了發(fā)酵過程中產(chǎn)物的抑制作用，使發(fā)酵菌體和抗菌妝廣量大幅提聞。
[0026]利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌肽，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，無殘留，安全性好，穩(wěn)定性高，抗菌譜廣，能夠抑制多種細菌和真菌，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、畜禽養(yǎng)殖、生物農(nóng)業(yè)等行業(yè)。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0028]本發(fā)明中涉及到的百分號“％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規(guī)定外，是指IOOmL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
[0029]實施例1利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的工藝
[0030]具體工藝如下:
[0031]1、種子培養(yǎng)
[0032]將保存B.laterosporu ASl.2827的甘油管接入滅菌的NB培養(yǎng)基中，32°C，培養(yǎng)時間24h ;再按5v/v%接種量接入NB培養(yǎng)基，32°C培養(yǎng)8h，獲得菌濃度為107cfu/mL的二級種子液。
[0033]2、5L發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0034]將步驟I中獲得的二級種子液按5￥八％接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，32°C,300r/min,通氣量 1:0.5v/v/min 條件下培養(yǎng) 15h。
[0035] 其中，發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):甘油2.0 %、豆柏粉2.0 %、CaCl20.005 %、Tween-200.5% AM pH7.2，以水配制。[0036]3、添加活性炭吸附分離耦合劑
[0037]步驟2中，當(dāng)培養(yǎng)15h后發(fā)酵液抗菌肽含量不再增加時，向發(fā)酵液中添加3%活性炭，同時補加3v/v%&酵濃縮培養(yǎng)基，按步驟2中發(fā)酵條件繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)20h。
[0038]其中，發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基為步驟2中發(fā)酵培養(yǎng)基的10倍濃縮液。
[0039]發(fā)酵結(jié)束后測定活菌數(shù)與抗菌肽效價，與未添加活性炭的對照組相比，活菌數(shù)提高了 2個數(shù)量級，抗菌肽產(chǎn)量提高了 80%。
[0040]實施例2利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的工藝
[0041]具體工藝如下:
[0042]1、種子培養(yǎng)
[0043]將保存B.Laterosporu ASl.2738的斜面接入滅菌的NB培養(yǎng)基中，34°C，培養(yǎng)時間24h，再按3V/V%接種量接入NB種子培養(yǎng)基，34°C培養(yǎng)12h，獲得菌濃度為108cfu/mL的二級種子液。
[0044]2、發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0045]將步驟I中獲得的二級種子液按8￥八％接種量接入裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0046]發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):可溶性淀粉1.5%、酵母粉1.5%工&(:120.15%,ZnCl20.008%,MnCl20.05%, Tween-202.0%, pH7.0,以水配制。
[0047]發(fā)酵條件:溫度34°C，通氣量1:0.5v/v/min，溶氧60%，溶氧與轉(zhuǎn)速相關(guān)聯(lián)，轉(zhuǎn)速200-400r/min，培養(yǎng) 16h。
[0048]3、添加活性炭吸附分離耦合劑
[0049]步驟2中，當(dāng)培養(yǎng)16h后向發(fā)酵液中添加1.5%活性炭，同時補加2v/v%發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基，按步驟2中發(fā)酵條件繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h。發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基為步驟2中發(fā)酵培養(yǎng)基的10倍濃縮液。
[0050]發(fā)酵結(jié)束后測定活菌數(shù)與抗菌肽效價，與未添加活性炭的對照組相比，活菌數(shù)提高了 3個數(shù)量級，抗菌肽產(chǎn)量提高了近一倍。
[0051]實施例3活性炭添加時間對活菌數(shù)和抗菌肽產(chǎn)量的影響
[0052]以側(cè)孢短芽孢桿菌(B.laterosporu) ASl.864為發(fā)酵菌株，首先將保存菌株的甘油管接入滅菌的NB培養(yǎng)基，32 0C，培養(yǎng)24h，按3v/v%接種量接入NB培養(yǎng)基，32°C培養(yǎng)12h，獲得菌濃度為108cfu/mL的二級種子液。
[0053]采用5L發(fā)酵罐，按5￥八％接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的體系中，在32°C，通氣量1:0.5v/v/min，轉(zhuǎn)速300r/min條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別于發(fā)酵的第12、16、20、24h，添加2%粉末狀活性炭及2v/v%濃縮料培養(yǎng)基，再繼續(xù)發(fā)酵24h ；以未添加活性炭的作為對照，活菌數(shù)及抗菌肽產(chǎn)量見表1。發(fā)酵16h后添加活性炭效果最明顯，活菌數(shù)與對照組相比提聞將近3個數(shù)量級，抗菌妝效價提聞80%。
[0054]NB種子培養(yǎng)基(w/v):蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、NaCl0.5%，調(diào)ρΗ7.2，以水配制。于121°C,高壓蒸汽滅菌20min。
[0055]發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖1.5 %、玉米漿 1.8 %、CaCl20.15%、ZnCl20.008%、Tween-800.1%，調(diào) ρΗ7.0,以水配制。
[0056]發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基的10倍濃縮液。[0057]表1活性炭添加時間對活菌數(shù)和抗菌肽效價的影響
【權(quán)利要求】
1.一種利用側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法，其特征在于，在側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus Iaterosporu)發(fā)酵過程中，待抗菌肽產(chǎn)量不再增加時，向發(fā)酵液中直接添加活性炭，通過活性炭對發(fā)酵產(chǎn)物的吸附，解除產(chǎn)物抑制作用，從而提高菌體密度和抗菌肽產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述側(cè)孢短芽孢桿菌包括但不限于 B.1aterosporu ASl.6343、B.1aterosporu ASl.2827、B.1aterosporu ASl.2739、B.1aterosporu ASl.864、B.1aterosporu ACCC06527、B.1aterosporu ACCC05440、B.1aterosporu ACCC10390。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)種子液制備:將側(cè)孢短芽孢桿菌的斜面或甘油管接入滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30-37°C，培養(yǎng)時間12-24h，獲得一級種子液；然后將一級種子液按3-5V/V%接種量接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30-37°C，培養(yǎng)6-18h，獲得菌濃度為107-108cfu/mL的二級種子液； 2)發(fā)酵培養(yǎng):向發(fā)酵罐內(nèi)裝入發(fā)酵罐體積60-80%的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入步驟I)制備的二級種子液，接種量3-5V/V%;發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30-34°C，轉(zhuǎn)速200-400r/min，通氣量 1:0.1-1:0.5v/v/min，溶氧 60-70%，培養(yǎng)時間 12_24h ； 3)活性炭吸附:當(dāng)發(fā)酵12-24h抗菌肽產(chǎn)量不再增加時，向發(fā)酵液中添加活性炭，同時補加發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基，活性炭添加量l_4w/v%，發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基補加量l_3v/v%，繼續(xù)發(fā)酵12-24h;發(fā)酵條件同步驟2)；
其中，步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:碳源0.5-3.0w/v%、氮源0.5-3.0w/v%、無機鹽 0.005-1.0w/v%、表面活性劑 0.1-1.0w/v%,iI pH7.0-7.4，以水配制； 步驟3)中所述發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基的配方為:碳源5.0-30.0w/v%、氮源5.0-30.0w/v%,無機鹽 0.05-10.0w/v%、表面活性劑 1.0-10.0w/v%,iI pH7.0-7.4，以水配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基和步驟3)中所述發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基中使用的碳源選自葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜或甘油中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基和步驟3)中所述發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基中使用的氮源選自玉米漿、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或豆柏粉中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基和步驟3)中所述發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基中使用的無機鹽選自Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+或Cu2+鹽中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基和步驟3)中所述發(fā)酵濃縮培養(yǎng)基中使用的表面活性劑選自Tween-20、Tween-40> Tween-60> Tween-80>Triton X-100、Triton X-114、Triton X-116、TX-4、TX-6、TX-7、TX-8、TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7或AEO-9中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中使用的活性炭為粉末狀或顆粒狀的竹炭、木炭、果殼炭或椰殼炭。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，活性炭吸附發(fā)酵產(chǎn)物后，通過解吸附手段再生，實現(xiàn)活性炭的循環(huán)利用。
【文檔編號】C12P21/00GK104004803SQ201410218433
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】賈英民, 王志新, 李興峰, 寧亞維, 楊瑾 申請人:河北科技大學(xué)