側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示。本發(fā)明還公開了編碼所述蛋白質(zhì)的基因及應(yīng)用。本發(fā)明所述蛋白質(zhì)能夠提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)，10μM?His-PeBL1處理本生煙葉片3d后接種TMV，對TMV侵染點(diǎn)及侵染直徑的最高抑制率可分別達(dá)到42.91％和43.23％。對假單胞桿菌(Pseudomonas?syringae)的抑制率達(dá)到了29.01％。
【專利說明】側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl及 其編碼基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明所述的側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus)A60菌株是本實(shí)驗(yàn) 室從海南昌江土壤中分離出的高活性生防菌株，已經(jīng)于2012年1月9日在中國微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)進(jìn)行了保藏，登記入冊編號(hào)CGMCC No:5694。本 實(shí)驗(yàn)室已成功從A60代謝產(chǎn)物中分離得到一種新型抗菌肽BL-A60。近年來應(yīng)用生防細(xì)菌及 其代謝產(chǎn)物開發(fā)出來的生防制劑越來越受到人們的關(guān)注。生防細(xì)菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性通常具 有廣譜性、系統(tǒng)性和非特異性，為多途徑利用植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性防治植物病害開辟了廣闊 前景。已有報(bào)道從生防細(xì)菌中篩出可引起植物系統(tǒng)抗性的激發(fā)子。但是目前在側(cè)孢短芽孢 桿菌中并沒有相關(guān)發(fā)現(xiàn)，所以從A60菌株中尋找一種新的蛋白質(zhì)激發(fā)子是非常必要的，并 且可以完善和豐富A60菌株及其代謝產(chǎn)物的生物防治功能，拓展其應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高植物抗性和 誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的側(cè)孢短芽孢桿菌分泌蛋白質(zhì)PeBLl及其基因序列和該蛋白及其基因 的應(yīng)用。
[0004] 一種側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所 /_J、1 ο
[0005] 本發(fā)明所述的側(cè)孢短芽孢桿菌Α60激發(fā)子PeBLl在提高植物系統(tǒng)抗性和誘導(dǎo)植物 防御反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中所述植物為本生煙。
[0007] -種多核苷酸，其核苷酸序列為下列所述之一：
[0008] (1)編碼序列表中SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列；
[0009] (2)與⑴中多核苷酸序列根據(jù)堿基配對原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明所述的多核苷酸，其中，編碼序列表中SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序 列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 一種重組載體，含有本發(fā)明所述的多核苷酸。
[0012] 本發(fā)明所述的重組載體，其中所述載體為在PET30載體多克隆位點(diǎn)插入本發(fā)明所 述的多核苷酸的重組載體。
[0013] 一種遺傳工程的宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明所述的重組載體。
[0014] 本發(fā)明所述的遺傳工程的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為含有本發(fā)明所述的重組 載體的大腸桿菌BL21(DE3)。
[0015] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)，是指來自側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus)A60 的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液或菌體的蛋白質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：
[0017] 本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl蛋白質(zhì)可以明顯的提高植物的抗性， 10yMHis-PeBLl處理本生煙葉3d后接種TMV-GFP，對病斑數(shù)及病斑直徑的最高抑制率可 分別達(dá)到42. 91 %和43. 23%。對假單胞桿菌（Pseudomonas syringae)的抑制率達(dá)到了 29. 01%。
[0018] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl蛋白質(zhì)及其編碼基因 和應(yīng)用作進(jìn)一步說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明中粗蛋白通過陽離子交換柱HiTrap SP FF的色譜圖；實(shí)線為吸收 值，虛線為洗脫液的百分含量;A、B、C代表三個(gè)洗脫峰；
[0020] 圖2為本發(fā)明中利用Agilent 1200HPLC高效液相色譜對洗脫峰B進(jìn)行反相柱層 析的譜圖；Bl、B2、B3、B4、B5代表五個(gè)洗脫峰；
[0021] 圖3為本發(fā)明中利用Agilent 1200HPLC高效液相色譜對有活性的洗脫峰B5進(jìn)行 純度檢測的譜圖；
[0022] 圖4為本發(fā)明中洗脫峰B與B5跑tricine-sds-page圖譜；Μ代表Marker ;
[0023] 圖5為本發(fā)明中在煙草上對不同濃度的His-PeBLl(10yM，5yM，2.5yM，lyM， 0. 1 μ M，0. 01 μ Μ)進(jìn)行活性監(jiān)測的結(jié)果圖；
[0024] 圖6為本發(fā)明中分別經(jīng)過His-PeBLl (實(shí)線）和緩沖液（虛線）處理的煙草懸浮 細(xì)胞活性氧物質(zhì)的定量檢測圖；縱坐標(biāo)為發(fā)光強(qiáng)度檢測，發(fā)光強(qiáng)度越高說明產(chǎn)生的活性氧 物質(zhì)越多，橫坐標(biāo)代表處理時(shí)間。
[0025] 圖7為分別經(jīng)過His-PeBLl和緩沖液（對照）處理的煙草葉片活性氧物質(zhì)的定性 檢測圖；左部分為對照，右部分為處理；
[0026] 圖8為分別經(jīng)過His-PeBLl (實(shí)線）和緩沖液（虛線）處理的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 基喊化情況圖；
[0027] 圖9為His-PeBLl誘導(dǎo)本生煙抑制假單胞桿菌（Pseudomonas syringae)的侵染 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；左側(cè)柱形為對照，右側(cè)柱形為處理；縱坐標(biāo)為每平方厘米葉片中細(xì)菌涂板形 成的菌落數(shù)，橫坐標(biāo)表示為接種三天后的材料。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1偵彳孢短芽孢桿菌A60培養(yǎng)及發(fā)酵代謝液制備
[0029] 采用LB培養(yǎng)基（蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g溶于蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH 至7. 5)。挑取活化單菌落于2L的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C、180rpm 培養(yǎng)大于48h。4600rpm離心去除菌體細(xì)胞，上清液用于抗菌肽分離。
[0030] 實(shí)施例2粗蛋白的制備和活性監(jiān)測
[0031] 對所得上清液用0. 45mm的濾膜（Whatman產(chǎn)品）抽濾兩次，直至沒有菌體。之后 進(jìn)行硫酸銨沉淀，緩慢加入硫酸銨使之達(dá)到80 %飽和度，4°C攪拌過夜。12000rpm，20分鐘 離心收集沉淀。用25m mol/L MES-NaOH(pH 6. 2)對沉淀物進(jìn)行重懸，再利用透析袋脫鹽， 透析袋選取截留分子量在8000D-12000D。首先使用蒸餾水作為透析液，透析三次后使用 25mmol/L MES-NaOH(pH 6. 2)緩沖液，再進(jìn)行透析2-3次，每次透析需要間隔約4h更換一次 透析液，保證透析袋內(nèi)外溶液能夠保持鹽濃度一致，同時(shí)也達(dá)到了更換緩沖液的目的。透析 完成后，lOOOOrpm，離心lOmin去除透析過程中產(chǎn)生的沉淀，得到粗蛋白溶液。
[0032] 生物活性的監(jiān)測：以生長2個(gè)月，具有6-8片葉的本生煙為材料，以25mM、pH 6. 2 的Mes-NaOH緩沖液為對照，粗蛋白溶液濃度為10 μ mol/L，利用lmL不帶針頭的注射器，將 50 μ LMes-NaOH緩沖液、50 μ L粗蛋白溶液從葉子背面分別注射進(jìn)葉片中去。經(jīng)過24h觀察 是否有壞死斑形成。
[0033] 結(jié)果：注射粗蛋白溶液的葉片，注射部位6h后出現(xiàn)水漬斑，12h后注射處葉片變得 透明較薄一些，24h后可以呈現(xiàn)典型的過敏反應(yīng)，有壞死斑形成。對照并無任何反應(yīng)，和正常 葉片一樣。
[0034] 實(shí)施例3粗蛋白溶液中蛋白質(zhì)激發(fā)子的分離純化及生物活性測定
[0035] (1)離子交換層析分離
[0036] 使用AlCTA explore 10 (GE Healthcare)蛋白質(zhì)純化儀對所得的粗蛋白進(jìn)行進(jìn) 一步純化，樣品首先通過陽離子柱HiTrap SP FF陽離子交換柱（GE Healthcare),每次上樣 40ml，平衡液為 25mM 的 MES (pH6. 2)，洗脫液為 20mM 的 MES (pH6. 2)與 1M NaCl，流速 2ml/ min。進(jìn)行線性洗脫（0% -100%，30min)，獲得到蛋白質(zhì)洗脫峰（見圖1)，將各蛋白質(zhì)洗脫 峰組分脫鹽后進(jìn)行生物活性的檢測，所應(yīng)用的各組分中使蛋白質(zhì)濃度為10 μ mol/L，結(jié)果表 明，蛋白質(zhì)峰B可以強(qiáng)烈的引起本生煙的過敏反應(yīng)。峰B經(jīng)tricine-sds-page跑膠檢測， 結(jié)果見圖4。
[0037] (2)反相層析純化
[0038] 利用Agilent 1200HPLC高效液相色譜純化洗脫峰B，色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18150x4. 6mm，粒徑5um，平衡緩沖液為含有1 %三氟乙酸的超純水，洗脫緩沖液為 100%乙腈。洗脫梯度：2011^11，水80%-0%;乙腈20%-100%，洗針上樣，一次80111，流 速：1. 0ml/min。多次重復(fù)上樣收集各組分，反相層析圖譜見圖2。將得到的五個(gè)主要的峰 凍干重溶，按實(shí)施例2中生物活性的監(jiān)測方法進(jìn)行生測，B5峰有明顯活性。
[0039] 將B5峰再過一次反相層析柱，B5為單一峰，純度較高，見圖3。較純的B5峰經(jīng) tricine-sds-page跑膠檢測為大小約為12KDa的單一條帶，結(jié)果見圖4。
[0040] 實(shí)施例4蛋白質(zhì)激發(fā)子的鑒定
[0041] 切取B5膠條進(jìn)行質(zhì)譜分析。儀器：布魯克MicrO T0F-QII，項(xiàng)目： nan〇ESI-QT0F-MS/MS (納升電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜）。1 μ g/ μ L的酶儲(chǔ)液以25mM 碳酸氫銨稀釋15倍，加入脫水后的膠條中，然后加入25mM碳酸氫銨沒過膠條，放入37度水 浴鍋，消化過夜。過夜后，加入終濃度〇. 1 %的TFA終止消化。納升電噴霧將酶切后的隨機(jī)肽 段打碎離子化，進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜的分析。將得到的序列信息在Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，對結(jié)果的 可信度進(jìn)行打分排序。其中分?jǐn)?shù)最高的蛋白為136分（25分以上可信），來自側(cè)孢短芽孢桿 菌的假設(shè)蛋白，大小為12776Da，與跑膠結(jié)果吻合。將此蛋白質(zhì)激發(fā)子命名為PeBLl(Protein elicitor Brevibacillus Laterosporus 1) 〇
[0042] 其氨基酸序列見序列表中的SED ID N0:2。
[0043] 實(shí)施例5蛋白質(zhì)激發(fā)子PeBLl編碼基因的克隆
[0044] 根據(jù)質(zhì)譜測序結(jié)果和密碼子的簡并性設(shè)計(jì)引物為PeBLl正向 5' -ATGAAAAAAGCTGTCTCAAC-3' 和 PeBLl 反向 5' -TTAGTAGGGAACAGTTATATT-3'，并以側(cè)孢短 芽孢桿菌A60基因組為模板，PCR擴(kuò)增出351bp的DNA片段，其中包括351bp的完整開放閱 讀框，將其命名為PeBLl基因，該基因的順序如SEQ ID NO: 1所示。
[0045] 實(shí)施例6 PeBLl基因的原核表達(dá)和純化
[0046] (1)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] 本實(shí)驗(yàn)使用 pET30His TEV/LIC 載體，米用 Ligation-independent cloning (LIC) 技術(shù)（Aslanidis&de Jong, 1990)將目的片段連入載體，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)激發(fā)子基因 PeBLl去 除信號(hào)肽的特異性引物，正向引物：5' -TACTTCCAATCCAATGCCACACCAGCCAAACACTC-3'，反向 引物：5' -TTATCCACTTCCAATGCTATTAGTAGGGAACAGTTATATTC-3'，擴(kuò)增全長 PeBLl 基因（94°C 3min;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，35cycles;72°C 10min;4°C°〇。處理載體與 PCR 產(chǎn) 物，反應(yīng)體系如表1所示：
[0048] 表1.連接體系
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
2. 權(quán)利要求1所述的側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBLl在提高植物系統(tǒng)抗性和誘導(dǎo)植 物防御反應(yīng)中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為本生煙。
4. 一種多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列為下列所述之一： (1) 編碼序列表中SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列； (2) 與（1)中多核苷酸序列根據(jù)堿基配對原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：編碼序列表中SEQ ID NO: 2的蛋白 質(zhì)的多核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
6. -種重組載體，其特征在于：含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：所述載體為在pET30載體多克隆位 點(diǎn)插入權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸的重組載體。
8. -種遺傳工程的宿主細(xì)胞，其特征在于：含有權(quán)利要求6或7所述的重組載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的遺傳工程的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為含有權(quán) 利要求6或7所述的重組載體的大腸桿菌BL21。
【文檔編號(hào)】C07K14/195GK104151404SQ201410392400
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】郭立華, 邱德文, 楊秀芬, 曾洪梅, 袁京京, 王顥潛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所