專利名稱：來源于側(cè)孢芽孢桿菌菌株的殺蟲毒素與基因的制作方法
背景技術(shù)：
昆蟲和其它害蟲使農(nóng)民每年在作物損失與防治這些害蟲的花費中損失數(shù)十億美元。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中由蟲害引起的損失包括作物產(chǎn)量的降低、作物質(zhì)量的降低和收獲成本的提高。
玉米根蟲(一種鞘翅目害蟲)是一種嚴重的植物害蟲。由于玉米根蟲(星葉甲屬(Diabrotica)的種)幼蟲攝食根，美國玉米作物每年遭受重大損失。據(jù)估計，每年約有930萬英畝美國玉米遭受玉米根蟲綜合物種的侵害。玉米根蟲綜合物種包括西方玉米根蟲(玉米根葉甲(Diabrotica virgifera virgifera))、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi)和南方玉米根蟲(黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctata howardi))。
星葉甲屬的每個種的生活周期類似。玉米根蟲的卵沉積于土壤中。新孵化的幼蟲(初齡蟲)滯留于土壤中，以較小的分支玉米根為食。西方及北方玉米根蟲的晚齡蟲侵入向植物運送水和礦物元素的內(nèi)根組織。在大多數(shù)情況中，幼蟲遷移，以最新生長的根為食。幼蟲向根中鉆孔引起可表現(xiàn)為根表面的棕色細長疤痕、根內(nèi)蛀孔或不同程度切斷的損害。根被切斷的植物通常在伴隨大雨和強風的風暴后被拔出。南方玉米根蟲的幼蟲以與西方及北方玉米根蟲幼蟲類似的方式攝食根。南方玉米根蟲幼蟲也可攝食仍接近土壤線的莖的生長點，這可使植物枯死。
攝食約3周后，玉米根蟲幼蟲離開根，并在土壤中化蛹。甲蟲成蟲從土壤中出現(xiàn)，并可攝食玉米花粉及其它許多類型的花粉及玉米穗絲。攝食綠色穗絲能降低傳粉水平，導致谷粒結(jié)粒不良和產(chǎn)量降低。西方玉米根蟲成蟲也攝食玉米葉，這能減緩植物的生長，在較少見的情況中能殺死某些玉米品種的植物。
這些星葉甲屬的種的土壤幼蟲以玉米植物的根為食，引起倒伏。倒伏最終降低玉米產(chǎn)量，并且通常導致植物死亡。通過攝食玉米穗絲，甲蟲成蟲可減少傳粉，因此不利地影響每株植物的玉米產(chǎn)量。另外，星葉甲屬的成蟲和幼蟲侵害用于商業(yè)生產(chǎn)的葫蘆作物(黃瓜、甜瓜、南瓜等)和許多蔬菜作物及大田作物，以及家庭花園中生長的植物。
據(jù)估計，在美國每年用來防治玉米根蟲的殺蟲劑的年度花費和玉米根蟲損害引起的作物損失總計超過10億美元(Meycalf,R.L.《星葉甲屬害蟲研究方法》,Drysan,J.L．和T.A.Miller[編],Springer-Verlag，紐約，NY,ⅶ-ⅹⅴ頁)。在美國每年用價值約2.5億美元的殺蟲劑防治玉米根蟲。在中西部地區(qū)，1990年在愛荷華州和內(nèi)布拉斯加州分別施用了價值6千萬美元和4千萬美元的殺蟲劑。盡管使用殺蟲劑，根蟲每年仍導致約7.5億美元的作物損失，使之成為中西部地區(qū)最嚴重的玉米害蟲。
利用栽培方法，如輪作和應用高水平氮刺激不定根系統(tǒng)的生長，已部分地進行了玉米根蟲的防治。但是，保證希望水平的防治最主要地是依靠化學殺蟲劑。殺蟲劑或者結(jié)合于或者摻入土壤中。對農(nóng)田利用的經(jīng)濟要求限制了輪作的應用。另外，在某些地區(qū)出現(xiàn)的北方玉米根蟲的兩年滯育(或越冬)性狀影響了輪作。
殺蟲劑防治玉米根蟲的用途也有幾個缺點。殺蟲劑的連續(xù)使用使得產(chǎn)生抗性昆蟲。如極大量的幼蟲群、大雨和殺蟲劑施用裝置的不準確刻度等情況均能導致較差的防治。殺蟲劑的應用常引發(fā)對環(huán)境的關(guān)注，如土壤和地表及地下供水的污染。公眾也擔心可在食物中發(fā)現(xiàn)的殘余化學藥品的量。工作中接觸殺蟲劑也可造成對施用它們的人員的危害。因此，合成化學殺蟲劑現(xiàn)正就其潛在的毒性環(huán)境后果受到越來越嚴格的審查，而正應如此。廣泛使用的合成化學殺蟲劑的實例包括有機氯殺蟲劑類，如DDT、滅蟻靈、十氯酮、林丹、艾氏劑、氯丹、涕滅威和狄氏劑；有機磷酸酯類，如毒死蜱、對硫磷、馬拉硫磷和二嗪磷；和氨基甲酸酯類。對使用殺蟲劑的新的嚴格限制和市場上某些有效殺蟲劑的撤除都能限制對防治害蟲的經(jīng)濟、有效的選擇。
由于與使用有機合成化學殺蟲劑有關(guān)的問題，確實需要限制這些藥劑的使用，并需要確定備擇的防治藥劑。合成化學殺蟲劑的替換或這些藥劑與生物殺蟲劑的結(jié)合能降低環(huán)境中有毒化學藥品的水平。
越來越普及的一種生物殺蟲劑是土壤微生物蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)。土壤微生物蘇云金芽孢桿菌(B.t.)是一種革蘭陽性的產(chǎn)芽孢細菌。大多數(shù)蘇云金芽孢桿菌菌株不表現(xiàn)殺蟲活性。某些蘇云金芽孢桿菌菌株產(chǎn)生且其特征為伴胞晶體蛋白質(zhì)內(nèi)含物。這些一般具有特異殺蟲活性的“δ-內(nèi)毒素”不同于具有非特異性宿主范圍的外毒素。這些內(nèi)含物通常在顯微鏡下顯示為特征性形狀的晶體。這些蛋白質(zhì)可能對害蟲非常有毒，并且其毒性特異。已經(jīng)分離并測序了某些蘇云金芽孢桿菌毒素基因。蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達早在15年前就已在公開文獻中描述(Schnepf,H.E.,H.R.Whiteley美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2893-2897)。另外，利用遺傳工程技術(shù)，正研究向農(nóng)業(yè)環(huán)境中施放蘇云金芽孢桿菌毒素的新方法，包括使用以蘇云金芽孢桿菌毒素基因遺傳改造的植物用于昆蟲抗性，和使用穩(wěn)定的完整微生物細胞作為蘇云金芽孢桿菌毒素輸送載體(Gaertner,F.H.,L.KimTIBTECH 6:S4-S7)。因此，分離的蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因是有商業(yè)價值的。
到最近15年，蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的商業(yè)應用主要限于鱗翅目(毛蟲)害蟲的較小范圍。蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克(kurstaki)亞種的芽孢和晶體制劑作為鱗翅目害蟲的商品殺蟲劑已使用多年。例如，蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克HD-1變種產(chǎn)生一種對多種鱗翅目昆蟲的幼蟲有毒的晶體δ-內(nèi)毒素。
然而最近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)了對更多的害蟲有特異性的蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑。例如，蘇云金芽孢桿菌的其它種即以色列(israelensis)和莫氏(morrisoni)(a.k.a.tenebrionis,a.k.a.B.t.M-7)已分別商業(yè)用于防治雙翅目和鞘翅目的昆蟲(Gaertner,F.H.“殺蟲蛋白質(zhì)的細胞輸送系統(tǒng)活與死微生物”，《作物保護劑的受控施放》，R.M.Wilkins編，Taylor和Francis，紐約和倫敦，1990,245-255頁)。參見Couch,T.L.(1980)“蘇云金芽孢桿菌以色列變種的蚊子致病性”，工業(yè)微生物發(fā)展(Developments in Industrial Microbiology)22:61-67；Beegle,C.C.(1978)“昆蟲體寄生菌在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的應用”工業(yè)微生物發(fā)展20:97-104。Krieg,A.,A.M.Huger,G.A.Langenbruch,W.Schnetter(1983)Z.ang.Ent.96:500-508描述了據(jù)報道對鞘翅目的兩種甲蟲有活性的蘇云金芽孢桿菌粉蟲(tenebrionis)變種。它們是科羅拉多馬鈴薯甲蟲--馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata)和楊樹瑩葉甲(Agelastica alni)。
最近，已鑒定了新的蘇云金芽孢桿菌亞種，并分離了活性δ-內(nèi)毒素蛋白的基因(Hofte,H.,H.R.Whiteley微生物學綜述(Microbiological Reviews)52(2):242-255)。Hofte和Whiteley將蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白基因分類為4個主要類別。這些類別是CryⅠ(鱗翅目特異的)、CryⅡ(鱗翅目和雙翅目特異的)、CryⅢ(鞘翅目特異的)和CryⅣ(雙翅目特異的)。已經(jīng)報道發(fā)現(xiàn)了對其它害蟲特別有毒的菌株(Feitelson J.S.,J.Payne,L.Kim生物技術(shù)(Bio/Technology)10:271-275)。已建議用CryⅤ代表一類線蟲特異的毒素基因。Lambert等人(Lambert B.,L.Buysse,C.Decock,S.Jansens,C.Piens,B.Saey,J.Seurinek,K.van Audenhove,J.van Rie,A.van Vliet,M,Peferoen應用與環(huán)境微生物(Appl.Environ.Microbiol.)62(1):80-86)和Shevelev等人(FEBS Lett.336:79-82)描述了對鱗翅目有活性的Cry9毒素的表征。公開的PCT申請WO94/05771和WO94/24264也描述了對鱗翅目害蟲有活性的蘇云金芽孢桿菌分離株。Gleave等人(JGM138:55-62)和Smulevitch等人(FEBS Lett.293:25-26)也描述了蘇云金芽孢桿菌毒素?，F(xiàn)在也已鑒定了大量其它種類的蘇云金芽孢桿菌基因。
Hofte和Whiteley對晶體蛋白的1989命名與分類方案是基于毒素的推斷氨基酸序列和宿主范圍。該系統(tǒng)適于覆蓋14個不同種類的毒素基因，它們被分為5個主要類別。被測序的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白基因的數(shù)量目前超過50個。也提出了一種只基于氨基酸同一性的修訂的命名方案(Crickmore等人無脊椎動物病理學協(xié)會(Societyfor Invertebrate Pathology)，第29屆年會，第3次國際蘇云金芽孢桿菌討論會，科多巴大學，科多巴，西班牙，1996年9月1-6日，摘要)。對除cytA和cytB之外的所有毒素基因保留了命名“cry”，即這是一種單獨的類別。在第一級中用羅馬數(shù)字替換阿拉伯數(shù)字，并去掉第三級中的括號。雖然有許多被重新分類，但除提及的之外仍保留了許多原來的名稱。參見“蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白命名法的修訂”，N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baurn和D.H.Dean，微生物學與分子生物學綜述(Microbiology and Molecular Biology reviews)(1998)62卷807-813；Crickmore,Zeigler,Feitelson,Schnepf,Van Rie,Lereclus,Baum和Dean，“蘇云金芽孢桿菌毒素命名法”(1999)http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html。該系統(tǒng)使用可自由獲得的軟件應用程序CLUSTAL W和PHYLIP。PHYLIP程序包中的NEIGHBOR應用程序使用一種算術(shù)平均(UPGMA)算法。
由于對資源的廣泛研究和投資，已授權(quán)了關(guān)于新蘇云金芽孢桿菌分離株與蘇云金芽孢桿菌分離株的新用途的其它專利。參見Feitelson等人，同上，綜述。然而，新蘇云金芽孢桿菌分離株的發(fā)現(xiàn)和已知蘇云金芽孢桿菌分離株的新用途仍是一種根據(jù)經(jīng)驗的、不可預測的技術(shù)。
Favret和Yousten(無脊椎動物病理學雜志(J.Invert.Path.)45:195-203)檢測了側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)菌株的殺蟲活性，但結(jié)論是，這些菌株所顯示的低水平毒性表明這些菌株不是生物防治劑的潛在候選者。Montaldi和Roth(172細菌學雜志(J.Bac.)4；1990年4月；2168-2171頁)對側(cè)孢芽孢桿菌孢子囊的類芽孢體進行了電子顯微鏡檢查。Bone等人(美國專利號5,045,314)報道所選側(cè)孢芽孢桿菌菌株的芽孢抑制動物寄生線蟲卵的孵化和/或幼蟲的發(fā)育。Aronson等人(美國專利號5,055,293)描述了一種被稱為P5的產(chǎn)芽孢的側(cè)孢芽孢桿菌(ATCC53694)。在此用側(cè)孢芽孢桿菌NRS-590作為陰性對照。Aronson等人假定側(cè)孢芽孢桿菌P5能侵襲極幼的玉米根蟲幼蟲，造成立即或稍后的損害，或者能阻斷玉米根蟲對將其向根引導的信號的接收或應答。WO94/21795或WO96/10083描述了據(jù)說對某些害蟲有活性的毒素。WO98/18932描述了對多種昆蟲有活性的許多新的微生物毒素類型。在此也公開了多種探針和引物。Orlova等人(64應用與環(huán)境微生物學1998年7月7日，2723-2725頁)報道，某些側(cè)孢芽孢桿菌菌株的晶體內(nèi)含物可潛在地用作防治蚊子的候選物。
蘇云金芽孢桿菌毒素的成功農(nóng)業(yè)應用的障礙包括昆蟲對蘇云金芽孢桿菌毒素抗性的發(fā)生。另外，某些昆蟲難以用蘇云金芽孢桿菌的作用防治。后者包括如棉鈴象鼻蟲和小地老虎的昆蟲，及迄今已證明對蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素無明顯敏感性的大多數(shù)種的成蟲。盡管蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)中采用的抗性操作策略是十分有意義的，但仍極其需要發(fā)現(xiàn)能在植物中以適當水平成功表達，從而有效防治多種昆蟲的基因。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在非哺乳動物害蟲，尤其是植物害蟲的防治中有用的材料與方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供可從側(cè)孢芽孢桿菌分離株中獲得的新型殺蟲毒素和毒素編碼基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，靶害蟲是玉米根蟲。本發(fā)明的毒素包括能從所述側(cè)孢芽孢桿菌菌株培養(yǎng)上清液中獲得的熱不穩(wěn)定的可溶性毒素。本發(fā)明的毒素也包括可從這些菌株中獲得的較小的熱不穩(wěn)定毒素。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的毒素的核苷酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列編碼不同于以前所述毒素的毒素。本發(fā)明的核苷酸序列也能用于編碼殺蟲毒素的基因的鑒定與表征。
在本發(fā)明的一個實施方案中，能在引起微生物大量增殖的條件下培養(yǎng)所述芽孢桿菌分離株。處理微生物得到單鏈基因組核酸后，用根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列表征該DNA。用該方法擴增毒素編碼基因的特征片段，從而確定毒素編碼基因的存在。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及植物和植物細胞，其被轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生至少一種本發(fā)明的殺蟲毒素，使得被轉(zhuǎn)化的植物細胞在靶害蟲所攝食的組織中表達殺蟲毒素。另外，根據(jù)本發(fā)明也能使用毒素的混合物和/或組合。
用此處公開的遺傳構(gòu)建體對植物的轉(zhuǎn)化能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的技術(shù)實現(xiàn)，一般包括基因的修飾以優(yōu)化毒素在植物中的表達。
序列簡述SEQ ID NO.1是一種MIS探針。
SEQ ID NO.2是一種WAR探針。
SEQ ID NO.3是一種MIS正向引物。
SEQ ID NO.4是一種MIS反向引物。
SEQ ID NO.5是來源于側(cè)孢芽孢桿菌MB438菌株的MIS毒素基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.6是來源于側(cè)孢芽孢桿菌MB438菌株的MIS毒素基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.7是來源于側(cè)孢芽孢桿菌MB438菌株的MIS毒素的多肽序列。
SEQ ID NO.8是來源于側(cè)孢芽孢桿菌MB438菌株的WAR毒素基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.9是來源于側(cè)孢芽孢桿菌MB438菌株的WAR毒素的多肽序列。
SEQ ID NO.10是來源于側(cè)孢芽孢桿菌MB439菌株的MIS毒素的核苷酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在非哺乳動物害蟲，尤其是植物害蟲的防治中有用的材料與方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供可從側(cè)孢芽孢桿菌分離株中獲得的新型殺蟲毒素和毒素編碼基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，靶害蟲是玉米根蟲。本發(fā)明的毒素包括能從所述側(cè)孢芽孢桿菌菌株培養(yǎng)上清液中獲得的熱不穩(wěn)定的可溶性毒素。下面詳述了可從這些菌株中獲得的MIS型和WAR型毒素。本發(fā)明的毒素也包括可從這些菌株中獲得的較小的熱不穩(wěn)定毒素。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的毒素的核苷酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列編碼不同于以前所述毒素的毒素。本發(fā)明的其它核苷酸序列也能在本領(lǐng)域中眾所周知的診斷與分析方法中使用。例如，能用探針、引物和部分序列鑒定與表征編碼殺蟲毒素的基因。
在本發(fā)明的一個實施方案中，能在引起微生物大量增殖的條件下培養(yǎng)所述芽孢桿菌分離株。處理微生物得到單鏈基因組核酸后，用根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列表征該DNA。用該方法擴增毒素編碼基因的特征片段，從而確定毒素編碼基因的存在。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及植物細胞，其被轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生至少一種本發(fā)明的殺蟲毒素，使得被轉(zhuǎn)化的植物細胞在靶害蟲所攝食的組織中表達殺蟲毒素。另外，根據(jù)本發(fā)明也能使用毒素的混合物和/或組合。在某些優(yōu)選的實施方案中，MIS毒素與WAR毒素一起使用。
用此處公開的遺傳構(gòu)建體對植物的轉(zhuǎn)化能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的技術(shù)實現(xiàn)，一般包括基因的修飾以優(yōu)化毒素在植物中的表達。
根據(jù)本發(fā)明有用的分離株將保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NRRL)的永久保藏所，北方研究中心，1815North University Street，Peoria,Illinois61604，美國。培養(yǎng)物保藏號如下
因本專利申請而保藏的培養(yǎng)物保藏于以下條件下，即，可確保依37CFR1.14和35U.S.C.122授權(quán)的專利商標局官員指定的人員在本專利申請未決期間能獲得這些培養(yǎng)物。當提交本申請書的相應文本或其后續(xù)文本的國家的專利法需要時，這些保藏物應是可獲得的。然而，應當理解，保藏物的可獲得性不構(gòu)成在政府機關(guān)承認的專利權(quán)失效后實施本發(fā)明的許可。
另外，所述培養(yǎng)保藏物應按照布達佩斯微生物保藏條約的規(guī)定貯存，且可為公眾所獲得，即，它們應貯存于使其在最近請求提供保藏樣品后至少5年內(nèi)，及在任何情況下，在保藏日期后至少30年內(nèi)，或可公開培養(yǎng)物的任何專利的有效期內(nèi)存活且不受污染所必需的條件下。保藏者應承認在保藏所因保藏條件而在請求時不能提供樣品時替換保藏物的義務。對培養(yǎng)保藏物公開獲得性的所有限制在公開它們的專利獲準后不能撤回。
此處所指的分離株的突變體能通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法制備。例如，通過分離株的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變能獲得不產(chǎn)芽孢突變體。能通過本領(lǐng)域眾所周知的方法用紫外線和亞硝基胍制備突變體。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及材料與方法，包括用于分離、表征和鑒定編碼對非哺乳動物害蟲有活性的蛋白質(zhì)毒素的芽孢桿菌基因的核苷酸引物和探針。此處所述的核苷酸序列也能用來鑒定新的殺蟲性芽孢桿菌分離株。本發(fā)明還涉及用此處公開的方法與材料鑒定的基因、分離株和毒素。
此處提供的新的毒素和多核苷酸序列根據(jù)幾個參數(shù)來定義。此處所述的毒素的一個特征是殺蟲活性。在一個具體實施方案中，這些毒素具有針對西方玉米根蟲的活性。本發(fā)明的毒素和基因能按照氨基酸和核苷酸序列進一步定義。根據(jù)與例舉的某些序列的同源性，以及根據(jù)與例舉的某些探針和引物雜交的能力，或被其擴增的能力，能定義這些分子的序列。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的MIS型毒素分子量為約70～約100kDa，最優(yōu)選地這些毒素大小為約80kDa。一般而言，這些毒素是可溶的，并能如此處所述從芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中獲得。這些毒素對非哺乳動物害蟲有毒性。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些毒素對西方玉米根蟲有活性。MIS蛋白由于其在細胞中成孔的能力是尤其有用的。這些蛋白質(zhì)能與第二種物質(zhì)包括如其它蛋白質(zhì)一起使用。當與第二種物質(zhì)一起使用時，MIS蛋白可利于第二種物質(zhì)向靶細胞中的進入。在一個優(yōu)選的實施方案中，MIS蛋白與MIS受體在靶細胞中相互作用，導致靶細胞中孔的形成。這第二種物質(zhì)可以是毒素或希望其進入細胞中的另一種分子。
本發(fā)明還涉及大小約為30-50kDa，最典型地大小約40kDa的WAR型毒素。一般而言，這些毒素是可溶的，并能如此處所述從芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中獲得。
能用此處所述的引物鑒定本發(fā)明的MIS型和WAR型毒素。
另一種特殊類型的毒素被確定為由本發(fā)明的芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。這些毒素比本發(fā)明的MIS型和WAR型毒素更小。這些毒素，象MIS型WAR型毒素，是熱不穩(wěn)定的。但是，這些毒素的大致大小為約10kDa～約1kDa。這些毒素也是可溶的，并能如此處所述從芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中獲得。
根據(jù)此處所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應能容易地產(chǎn)生并應用此處所述的多種毒素和多核苷酸序列。
基因與毒素。如在此使用，術(shù)語“野生型毒素”和“野生型基因”是指所述分離株(MB438和MB439)自然產(chǎn)生的基因和毒素。本發(fā)明的基因和毒素不僅包括全長的野生型序列，而且包括這些序列的片段、變體、突變體和融合蛋白，它們保留了此處特別例舉的毒素的特有殺蟲活性。例如，美國專利號5,605,793描述了在隨機斷裂后利用DNA重裝配產(chǎn)生其它分子多樣性的方法。而且，能對此處特別例舉的基因和毒素進行內(nèi)部缺失，只要修飾毒素保留有殺蟲活性。根據(jù)本發(fā)明的教導也可使用由超過一種芽孢桿菌毒素或基因的組合部分產(chǎn)生的嵌合基因和毒素。如在此使用，術(shù)語基因的“變體”或“變異”是指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的相當毒素的核苷酸序列。如在此使用，術(shù)語“相當毒素”是指對靶害蟲有與例舉的毒素相同或基本相同的生物活性的毒素。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當明白，可通過幾種方法鑒定并獲得編碼活性毒素的基因。此處例舉的特異基因可從如上所述保藏于培養(yǎng)物保藏中心的分離株中獲得。這些基因，或其部分或變體，也可用合成方法構(gòu)建，例如，利用基因合成儀構(gòu)建。利用產(chǎn)生點突變的標準技術(shù)可容易地構(gòu)建基因的變異。也能按照標準方法用可商品獲得的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶制備這些基因的片段。例如，能用如Bal31的酶或定點誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。編碼活性片段的基因也可用多種限制酶獲得?？捎玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。
根據(jù)此處所述能由芽孢桿菌分離株和/或DNA文庫產(chǎn)生相當毒素和/或編碼這些相當毒素的基因。有大量方法可獲得本發(fā)明的殺蟲毒素。例如，此處公開并要求保護的殺蟲毒素的抗體能用來從蛋白質(zhì)混合物中鑒別并分離毒素。特別可制備針對最恒定且最不同于其它芽孢桿菌毒素的毒素部分的抗體。然后能用這些抗體通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或Western印跡特異性鑒定具有特定活性的相當毒素。針對此處公開的毒素或相當毒素或這些毒素的片段的抗體能用本領(lǐng)域的標準方法容易地制備。然后能從微生物中獲得編碼這些毒素的基因。
保留了所例舉毒素的殺蟲活性的片段和相當物屬于本發(fā)明的范圍。由于遺傳密碼的豐余性，多種不同的DNA序列也能編碼此處公開的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能較好地制備這些編碼相同或基本相同毒素的DNA序列。這些變體DNA序列屬于本發(fā)明的范圍。如在此使用，“基本相同的”序列是指含有不顯著影響殺蟲活性的氨基酸置換、缺失、添加或插入的序列。該定義中也包括保留殺蟲活性的片段。
鑒定本發(fā)明的毒素和基因的另一種方法是利用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測的核苷酸序列。探針提供一種鑒定本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。用作本發(fā)明的探針的核苷酸片段能用DNA合成儀和標準方法合成。
在此已具體例舉了本發(fā)明的某些毒素。由于這些毒素只是本發(fā)明的毒素的典型，所以應當明白，本發(fā)明包括具有與例舉的毒素相同或相似殺蟲活性的變體或相當毒素(和編碼相當毒素的核苷酸序列)。相當毒素應與例舉的毒素有氨基酸同源性。該氨基酸同一性一般大于60％，優(yōu)選地大于75％，更優(yōu)選地大于80％，更優(yōu)選地大于90％，并能大于95％。這些同一性用標準對比技術(shù)測定，優(yōu)選地如本說明書背景部分所述用Crickmore等人所用的技術(shù)測定。在決定生物活性或與決定最終影響生物活性的三維構(gòu)型有關(guān)的毒素重要區(qū)域中，氨基酸同源性最高。就此而言，某些氨基酸置換是可接受的且可能是希望的，只要這些置換位于對于活性而言不重要的區(qū)域中，或是不影響分子三維構(gòu)型的保守氨基酸置換。例如，氨基酸可屬于下列類別非極性、不帶電荷極性、堿性和酸性。一種氨基酸被替換為相同類型的另一種氨基酸的保守置換屬于本發(fā)明的范圍，只要該置換基本上不顯著改變化合物的生物活性。下面表1中列出的是分屬每一類別的氨基酸的實例。
在某些情況中，也能進行非保守置換。關(guān)鍵因素在于這些置換必須不能明顯降低毒素的生物活性。
如在此使用，“分離的”多核苷酸和/或“純化的”毒素是指不與天然發(fā)現(xiàn)時所結(jié)合的其它分子相結(jié)合的這些分子。因此，“分離和純化的”表示與如此處所述的“人工”有關(guān)。嵌合毒素和基因也與“人工”有關(guān)。
重組宿主。本發(fā)明的毒素編碼基因能被引入多種微生物或植物宿主中。毒素基因的表達直接或間接地導致殺蟲劑的產(chǎn)生和維持。優(yōu)選植物宿主的轉(zhuǎn)化。攝食表達毒素的重組植物的害蟲由此接觸毒素。通過合適的微生物宿主，如假單胞菌(Pseudomonas)，微生物能加到害蟲所處位置，在此增殖并被攝食。利用任何不同方法，結(jié)果都將是害蟲的防治。另外，在可延長毒素活性和穩(wěn)定細胞的條件下，帶有毒素基因的微生物能被殺死及處理。然后可將保留毒素活性的被處理細胞施用于靶害蟲環(huán)境。通過經(jīng)適當載體向微生物宿主中引入一種基因，然后將該宿主以存活狀態(tài)應用于環(huán)境，也能應用芽孢桿菌毒素。
有多種方法可用于在能夠穩(wěn)定保持并表達基因的條件下向宿主中引入編碼毒素的芽孢桿菌基因。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，如在美國專利號5,135,867中有述，其在此引用作為參考。
也能用功能上與本發(fā)明的毒素相當?shù)暮铣苫蜣D(zhuǎn)化宿主。例如，在美國專利號5,380,831中能找到產(chǎn)生合成基因的方法。在優(yōu)選的實施方案中，為在植物中表達而優(yōu)化本發(fā)明的基因。
細胞的處理。如上所述，能處理表達芽孢桿菌毒素的芽孢桿菌或重組細胞，以延長毒素活性并穩(wěn)定細胞。形成的殺蟲劑微囊體在一種細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)包含芽孢桿菌毒素，當應用于靶害蟲環(huán)境時它可穩(wěn)定并保護毒素。合適的宿主細胞可包括原核生物或真核生物。作為宿主，特別有意義的是原核生物和低等真核生物，如真菌。當處理時，細胞通常是完整的，且基本上為增殖形式，而不是芽孢形式。
微生物細胞如含芽孢桿菌毒素基因的微生物細胞能通過化學或物理方法處理，或通過化學和/或物理方法的組合處理，只要該技術(shù)不能不利地影響毒素的性質(zhì)，也不降低細胞保護毒素的能力。在美國專利號4,695,455和4,695,462中公開了微生物細胞的處理方法，在此引用作為參考。
防治害蟲的方法與制劑。利用本發(fā)明的毒素和基因?qū)οx的防治能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法來實現(xiàn)。這些方法包括，例如，對害蟲(或其位置)施用芽孢桿菌分離株，對害蟲(或其位置)施用重組微生物，用編碼本發(fā)明的殺蟲毒素的基因轉(zhuǎn)化植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能用標準技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化所必需的材料在此公開，或易于為技術(shù)人員所獲得。
配制的含有引誘劑和芽孢桿菌分離株毒素的餌料顆粒，或含有可從此處公開的芽孢桿菌分離株中獲得的基因的重組微生物，能施用于土壤。配制的產(chǎn)品也能用于種子包被或根處理或在種植周期后期時整個植物的處理。芽孢桿菌細胞的植物和土壤處理可通過與不同惰性材料如無機礦物質(zhì)(頁硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物性材料(粉狀玉米穗軸、稻殼、核桃殼等)混合，用作可濕性粉末、顆粒或粉劑。該制劑可包含粘展劑、穩(wěn)定劑、其它殺蟲添加劑或表面活性劑。液體制劑可以是水性的或非水性的，并可用作泡沫、凝膠、懸液、濃縮乳劑等。成份可包括流變劑、表面活性劑、乳劑、分散劑或聚合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，殺蟲濃度將隨特定制劑的性質(zhì)尤其因它是一種濃縮物還是直接使用而大大不同。殺蟲劑至少為1％重量，并可達100％重量。干制劑為約1-95％殺蟲劑重量，而液體制劑在液相時通常為約1-60％固體重量。含有細胞的制劑通常為約102～約104細胞/mg。這些制劑可以以每公頃約50mg(液體或干)～1kg或更多的量施用。
能通過噴霧、撒粉、噴灑等將這些制劑施用于害蟲環(huán)境，如土壤和樹葉。
多核苷酸探針。眾所周知，DNA具有稱為堿基互補的基本性質(zhì)。實際上，DNA通常以反平行鏈對的形式存在，每條鏈上的堿基從該鏈向相對的鏈伸出。一條鏈上的堿基腺嘌呤(A)總是對應于另一條鏈上的堿基胸腺嘧啶(T)，而堿基鳥嘌呤對應于堿基胞嘧啶(C)。堿基由于其以這種特殊方式氫鍵鍵合的能力而保持并列。盡管每一單個鍵相對較弱，但許多相鄰氫鍵鍵合堿基的凈效應與堿基堆積效應一起可穩(wěn)定連接兩條互補鏈。這些鍵能被如高pH或高溫的處理所打破，這些條件導致兩條鏈的解離或“變性”。如果之后將DNA置于使堿基熱力學上趨于氫鍵鍵合的條件下，則DNA鏈將退火，或“雜交”，并重新形成原來的雙鏈DNA。如果在適當條件下進行，該雜交可能是高度特異的。即，只有高度堿基互補的鏈才能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交特異性與反應條件的關(guān)系眾所周知。因此，可用雜交檢測兩種DNA堿基序列是否互補。該雜交機理利于用本發(fā)明的探針方便地檢測和表征目的DNA序列。
探針可以是RNA、DNA或PNA(肽核酸)。探針通常有至少約10個堿基，更通常至少約17個堿基，并可有高達約100個堿基或更多。能方便地使用更長的探針，例如這些探針長度可為幾千個堿基。探針序列設(shè)計為至少基本上互補于編碼目的毒素的基因的一部分。探針不需要與雜交序列完全互補。探針可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的技術(shù)標記。
本發(fā)明使用探針的一種方法需要首先通過對芽孢桿菌分離株基因庫的Southern印跡分析，鑒定與公開的核苷酸序列同源的所有DNA片段。因此，不借助于生物學分析，也能預先了解多種新芽孢桿菌分離株和特定芽孢桿菌分離株表達的個別基因產(chǎn)物的可能活性。這種探針分析提供了一種快速方法，用于在多種芽孢桿菌亞種中鑒定具有潛在商業(yè)價值的殺蟲毒素基因。
根據(jù)本發(fā)明有用的一種雜交方法一般包括最初的分離目的DNA樣品并化學純化的步驟。能使用裂解的細菌或從細菌中分離的總分級分離核酸。能用已知技術(shù)處理細胞以釋放其DNA(和/或RNA)。用合適的限制酶能將DNA樣品切為片段。通過凝膠電泳通常為瓊脂糖或丙烯酰胺電泳能按大小分離這些片段。并將目的片段轉(zhuǎn)移到固定的膜上。
特定的雜交技術(shù)不是本發(fā)明的關(guān)鍵。由于雜交技術(shù)的改進，能容易地使用這些方法。
然后能在雜交緩沖溶液中使探針與樣品結(jié)合，并在適當溫度下保持直到發(fā)生退火。之后，洗滌該膜使之不含外源物質(zhì)，一般通過放射自顯影和/或液體閃爍計數(shù)檢測，并定量樣品和結(jié)合的探針分子。本領(lǐng)域中眾所周知，如果探針分子和核酸樣品通過在兩種分子間形成強烈的非共價鍵而雜交，則可以合理地假定探針和樣品基本上相同。探針的可檢測標記提供了一種以已知方法確定是否發(fā)生雜交的方法。
在使用核苷酸片段作為探針時，用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何適當標記物，包括放射性和非放射性標記物，標記特定探針。典型的放射性標記包括32P、35S等。非放射性標記包括，例如，配體如生物素或甲狀腺素，以及酶如水解酶或過氧化物酶，或不同的化學發(fā)光劑如螢光素，或熒光化合物如熒光素及其衍生物。如國際申請?zhí)朩O93/16094所述可使探針固有熒光。
能使用不同程度的雜交嚴格性。條件越嚴格，雙鏈體形成所需的互補性越強。通過溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間等能控制嚴格性。優(yōu)選地，如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)《DNA探針》,Stockton出版社，紐約，NY,169-170頁所述，用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在中等到高度嚴格條件下進行雜交。該信息在此引用作為參考。
如在此使用，雜交的“中等到高度嚴格”條件是指達到與本申請人所用條件相同或大致相同程度的雜交特異性的條件。此處提供了中等到高度嚴格條件的實例。特別用標準方法(Maniatis等人)進行Southern印跡中固定DNA與32P標記基因特異性探針的雜交。通常在中等到高度嚴格條件下進行雜交和隨后的洗滌，該條件使得可檢測與例舉的毒素基因有同源性的靶序列。對于雙鏈DNA基因探針，在比DNA雜合體的解鏈溫度(Tm)低20-25℃的溫度下，在6×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中雜交過夜。解鏈溫度以下列通式表述(Beltz,G.A.,K.A.Jacobs,T.H.Eickbush,P.T.Cherbas和F.C.Kafatos《酶學方法》,R.Wu,L.Grossman和K.Moldave[編]，學院出版社，紐約100:266-285)。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/堿基對中雙鏈體的長度。
洗滌一般如下進行(1)用1×SSPE、0.1％SDS室溫洗兩次15分鐘(低嚴格性洗滌)。
(2)用0.2×SSPE、0.1％SDS在Tm-20℃下洗一次15分鐘(中等嚴格性洗滌)。
對于寡核苷酸探針，在比雜合體的解鏈溫度(Tm)低10-20℃的溫度下，在6×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中雜交過夜。寡核苷酸探針的Tm由下列通式確定Tm(℃)=12(T/A堿基對數(shù))+4(G/C堿基對數(shù))(Suggs,S.V.,T.Miyake,E.H.Kawashime,M.J.Johnson,K.Itakura和R.B.WallaceICN-UCLA symp.dev.Biol.Using Purified Genes,D.D.Brown[編]，學院出版社，紐約，23:683-693)。
洗滌一般如下進行(1)用1×SSPE、0.1％SDS室溫洗兩次15分鐘(低嚴格性洗滌)。
(2)用1×SSPE、0.1％SDS在雜交溫度下洗一次15分鐘(中等嚴格性洗滌)。
通常，能改變鹽和/或溫度從而改變嚴格性。標記的DNA片段長度＞70個左右堿基時，能用下列條件低1或2×SSPE，室溫低1或2×SSPE,42℃中0.2×或1×SSPE,65℃高0.1×SSPE,65℃。
雙鏈體形成和穩(wěn)定性取決于雜合體兩條鏈之間的基本互補性，并且如上所述，能允許某種程度的錯配。因此，本發(fā)明的探針序列包括希望序列的突變(單和多)、缺失、插入，及其組合，其中該突變、插入和缺失使得能與目的多核苷酸形成穩(wěn)定的雜合體。能用多種方法在特定多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失，這些方法為技術(shù)人員所公知。其它方法在將來也可成為公知的。
因此，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法能容易地制備公開的核苷酸序列的突變、插入和缺失變體。這些變體能以與例舉的引物序列相同的方法使用，只要這些變體與原始序列有基本的序列同源性。如在此使用，基本序列同源性是指足以使變異探針以與原始探針相同的能力起作用的同源性。優(yōu)選地，這種同源性大于50％，更優(yōu)選地，該同源性大于75％，最優(yōu)選地，該同源性大于90％。變體以預期能力起作用所需的同源性或同一性的程度取決于序列的預期用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員能進行突變、插入和缺失突變，用來提高序列的功能，或另外提供方法優(yōu)點。
PCR技術(shù)。聚合酶鏈反應(PCR)是一種重復、酶促、引發(fā)的核酸序列合成。該方法眾所周知，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用(見Mullis，美國專利號4,683,195、4,683,202、4,800,159；Saiki,Randall K.,Stephen Scharf,Fred Faloona,Kary B.,Mullis,Glenn T. Horn,HenryA.Erlich,Norman Arnheim“β-珠蛋白基因組序列的酶促擴增和限制位點分析，用于診斷鐮狀細胞貧血”，科學230:1350-1354)。PCR基于側(cè)翼為兩條可與靶序列相對鏈雜交的寡核苷酸引物的目的DNA片段的酶促擴增。引物用彼此指向的3’末端定向。模板熱變性、引物與其互補序列的退火和用DNA聚合酶使退火引物延伸的重復循環(huán)，導致PCR引物5’端所限定的片段的擴增。由于每條引物的延伸產(chǎn)物能用作另一條引物的模板，所以每一循環(huán)基本上使前一循環(huán)產(chǎn)生的DNA片段的量加倍。這導致特異靶片段的指數(shù)積累，在幾個小時后可達幾百萬倍。利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶如從嗜熱菌棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中獲得的Taq聚合酶，擴增過程能完全自動化?？墒褂玫钠渌笧楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所周知。
本發(fā)明的DNA序列能用作PCR擴增的引物。在進行PCR擴增時，可允許引物與模板之間的某種程度的錯配。因此，所例舉的引物的突變、缺失和插入(特別是核苷酸向5’端的添加)屬于本發(fā)明的范圍。利用技術(shù)人員周知的方法能在特定引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失。
此處引用的所有參考文獻均在此引入作為參考。
下面是說明實施本發(fā)明的方法的實施例。這些實施例不應看作是限制。除非另外指明，否則所有百分數(shù)都是重量百分數(shù)，所有溶劑混合比例均為體積比。
實施例1-根據(jù)本發(fā)明有用的側(cè)孢芽孢桿菌分離株的培養(yǎng)天然側(cè)孢芽孢桿菌菌株和表達側(cè)孢芽孢桿菌MIS和WAR毒素的蘇云金芽孢桿菌重組體在30℃和300轉(zhuǎn)/分下在TB(+甘油)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)25小時。離心沉淀細胞，傾析出上清液(“SN”)并保存。加入EDTA至1mM，樣品貯存于-20℃。在收獲的同一天用新鮮樣品進行生物測定。于4℃融解冷凍樣品，離心沉淀并去除任何固體，然后用于生物測定或分級分離。實施例2-基因組DNA的制備和Southern印跡分析從在Luria Bertani(LB)培養(yǎng)液中生長至600nm可見光下的光密度為0.5-0.8的不同側(cè)孢芽孢桿菌菌株中制備總細胞DNA。根據(jù)針對革蘭氏陽性菌的方法(Qiagen Inc.；Valencia,CA)用QiagenGenomic-tip 500/G試劑盒或Genomic-tip 20/G和基因組DNA緩沖液組提取DNA。制備的總基因組DNA用不同限制酶消化，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，用標準方法固定于支持尼龍膜上(Maniatis,T.,E.F.Fritsch,J.Sambrook《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)。用32p標記探針經(jīng)標準Southern雜交或通過利用DIG核酸標記和檢測系統(tǒng)的非放射性方法檢測新型毒素基因(BoehringerMannheim；Indianapolis,IN)。
SEQ ID NO.1顯示約2.6kbp的MIS探針。SEQ ID NO.2顯示約1.3kbp的WAR探針。這些探針能用多種方法包括利用“基因機”制備，或者能從蘇云金芽孢桿菌分離株P(guān)S177CB克隆，并用與各自基因的5’和3’端同源的引物PCR擴增。在后一情況中，凝膠純化DNA片段，用32p隨機標記約25ng的每種DNA片段進行放射性檢測。用DIGHigh Prime試劑盒隨機標記約300ng的每種DNA片段進行非放射性檢測。固定DNA與隨機32p標記的探針的雜交在標準的甲酰胺條件下進行50％甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、2％SDS、0.1mg/ml,42℃過夜。在低嚴格性下用2×SSC、0.1％SDS 42℃洗滌印跡，并對膠片曝光。
以下表2所示的是側(cè)孢芽孢桿菌菌株MB438和MB439的總細胞DNA的限制片段長度多態(tài)性(RFLP)結(jié)果，其如述通過以MIS或WAR探針探查的Southern印跡分析測定。這些條帶至少含有目的MIS樣或WAR樣操縱子的一個片段。
表2
實施例3-毒素基因克隆由大小為9-20kb的部分消化、大小分離的DNA制備側(cè)孢芽孢桿菌菌株MB439或MB438的總基因組DNA的λ文庫。確定使用1:10稀釋的NdeⅡ酶(約0.5單位)的特異消化時間，以優(yōu)化希望大小的消化DNA。DNA消化適當時間，然后經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠分級分離。用溴化乙錠染色顯示DNA，從凝膠上切下大小為9-20kb的DNA。將凝膠片段與2ml 10mM Tris-HCl、1mM EDTA緩沖液pH8.0(TE)一起置入透析管中(12-14000MW界值)。在大約30mA下用0.1×TAE緩沖液從該凝膠片段上電洗脫DNA1小時。從管中移出溶于TE緩沖液的DNA，并用Elutip柱及方案(Schleicher和Schuell；Keene,NH)純化。乙醇沉淀純化的DNA，重懸浮于10μl TE中。
按照方案將純化、分級分離的DNA與λ-GEM-11BamHI消化的臂(Promega Corp.,Madison,WI)連接。然后按照方案用GigapackⅢGold包裝提取物(Stratagene Corp.,La Jolla,CA)將連接的DNA包裝于λ噬菌體中。用包裝提取物感染大腸桿菌菌株KW251，并平板接種于LB平板的LB頂層瓊脂中。噬斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并準備用標準方法雜交(Maniatis等人，同上)。制備32P標記的探針(見上)，如上所述雜交并洗滌濾膜。通過將濾膜暴露于Kodak XAR-5膠片顯示含有希望克隆的噬斑。從平板上分離噬斑，將噬菌體從瓊脂中重懸浮于轉(zhuǎn)移到SM緩沖液中。用LambdaSorb噬菌體吸收劑(Promega,Madison,WI)制備噬菌體的DNA。用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作為引物對噬菌體DNA進行PCR，以證實其含有靶操縱子。兩個DNA樣品的PCR反應都產(chǎn)生一條1kb的帶，再次證實這些克隆含有mis型基因。為了鑒定之后能被亞克隆到細菌載體中進一步分析并表達的含有目的操縱子的較小片段，用不同酶消化噬菌體DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠分級分離，并進行Southern印跡分析。Southern分析如上所述進行。對MB438鑒定大小約為10kb的HincⅡ片段。凝膠純化該片段，并克隆到pBluescriptⅡ(SK+)的EcoRⅤ位點；產(chǎn)生的質(zhì)粒被命名為pMYC2608，含有該質(zhì)粒的重組大腸桿菌菌株被命名為MR957。實施例4-MB438 MIS和WAR基因的測序?qū)CR擴增的DNA片段測定MB438mis基因的部分DNA序列。用MIS引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)對MB438和MB439的總細胞基因組DNA進行PCR。MB438產(chǎn)生一條大約1kbp的DNA片段，隨后如廠商(Invitrogen,San Diego,CA)所述將其克隆到PCRDNATA克隆質(zhì)粒載體pCR2.1中。從MB438PCR的重組克隆中分離質(zhì)粒，用質(zhì)粒載體引物T3和T7經(jīng)PCR檢測約1kbp插入片段的存在與否。如廠商所述用QIAGEN(Santa Clarita,CA)miniprep試劑盒分離含有該插入片段的質(zhì)粒，用作測序模板。用PE Applied Biosystems的染料終止循環(huán)測序快速反應試劑盒進行測序反應。在ABI PRISM377自動測序儀上進行測序反應。用PE ABI的ABI PRISM377收集、制作、自動組接軟件收集、編輯、組接序列數(shù)據(jù)。MB438mis型基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
通過組接pMYC2608的隨機限制片段的序列數(shù)據(jù)并通過引物步移pMYC2608中的DNA插入片段確定MB438MIS和WAR基因的完整序列。通過用多接頭限制酶NotⅠ和ApaⅠ從載體上酶切分離質(zhì)粒pMYC2608的插入DNA，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠分級分離，并用QiaexⅡ試劑盒(Qiagen Inc.；Valencia,CA)從瓊脂糖凝膠中純化。然后用限制酶AluⅠ、MseⅠ和RsaⅠ消化凝膠純化的插入DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠分級分離。從凝膠上切下0.5-1.5kb的DNA片段，用QiaexⅡ試劑盒純化。回收的片段與EcoRⅤ消化的pBluescriptⅡ連接，并轉(zhuǎn)化XL10Gold細胞。從隨機選擇的轉(zhuǎn)化子中制備miniprep DNA，用NotⅠ和ApaⅠ消化以證實插入片段并用于測序。用dRhodamine測序試劑盒(ABI Prism/Perkein Elmer Applied Biosystems)進行測序反應。按照手冊(ABI Prism)在測序凝膠上電泳序列，用制作與自動組接程序(ABI Prism)分析。MB438mis基因的完整核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；推斷的MB438MIS肽序列如SEQ ID NO.7所示。MB438war基因的完整核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；推斷的MB438WAR肽序列如SEQ ID NO.9所示。
由PCR擴增的DNA片段測定MB439mis基因的部分DNA序列。使用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4對MB439的總細胞基因組DNA進行PCR。獲得約1kbp的DNA片段，隨后如廠商(Invitrogen,San Diego,CA)所述將其克隆到PCR DNA TA克隆質(zhì)粒載體pCR-TOPO中。從MB439PCR的重組克隆中分離質(zhì)粒，用質(zhì)粒載體引物T3和T7經(jīng)PCR確定約1kbp的插入片段的存在與否。然后如廠商所述用QIAGEN(Santa Clarita,CA)miniprep試劑盒分離含有該插入片段的質(zhì)粒用作測序模板。應用PE Applied Biosystems的染料終止循環(huán)測序快速反應試劑盒進行測序反應。在ABI PRISM377自動測序儀上進行測序反應。用PE ABI的ABI PRISM377收集、制作、自動組接軟件收集、編輯、組接序列數(shù)據(jù)。MB439mis型基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。實施例5-亞克隆MB438MIS和WAR毒素以在蘇云金芽孢桿菌中表達通過將克隆的pMYC2608的基因組DNA片段亞克隆到能在大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌宿主中復制的高拷貝數(shù)穿梭載體中，實現(xiàn)MB438MIS和WAR毒素在蘇云金芽孢桿菌中的表達。穿梭載體pMYC2614是pHT370(O.Arantes和D.Lereclus,1991，基因108:115-119)的一種修飾形式，其含有pBluescriptⅡ(Stratagene)的多克隆位點區(qū)。用NotⅠ和ApaⅠ限制酶從pMYC2608上切下含有war和mis基因的基因組DNA插入片段，凝膠純化，連接于pMYC2614的NotⅠ和ApaⅠ位點。產(chǎn)生的蘇云金芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒被命名為pMYC2609。
為了檢測蘇云金芽孢桿菌中MB438毒素基因的表達，經(jīng)電穿孔用pMYC2609轉(zhuǎn)化不結(jié)晶的(Cry-)蘇云金芽孢桿菌宿主CryB(A.Aronson,Purdue University,West Lafayette,IN)。將該重組菌株命名為MR557。通過用針對PS177C8 WAR毒素的抗體免疫印跡，證明WAR毒素的表達。如以下實施例8所述對西方玉米根蟲測定MR557的培養(yǎng)上清液和細胞沉淀制品。實施例6-MB438和MB439的西方玉米根蟲生物測定以215μl/1.36cm2的速度將如實施例1所述制備的上清液樣品施加于人造食物中。然后用新生的西方玉米根蟲感染這些制品，并在暗處于25℃下保持4天。除非另外指明，否則在感染后第4天測定樣品的死亡率。
表3涉及MB438和MB439的時程。MB438和MB439顯示在22-30小時(MB438)和24-39小時(MB439)左右出現(xiàn)活性。所有菌株都在TBG培養(yǎng)基上生長。未加熱處理這些樣品中的任一個。
表3
表4報告的結(jié)果表明，加熱消除了24小時和48小時培養(yǎng)的MB438和MB439的新鮮、未加熱樣品所表現(xiàn)的大部分或全部活性。
表4
表5報告的結(jié)果表明，MB438和MB439的活性是劑量反應性的。所有菌株都在TBG培養(yǎng)基上生長。未加熱處理這些樣品中的任一個。所有樣品均為24小時培養(yǎng)物。
表5
實施例7-分級分離的樣品的西方玉米根蟲生物測定對于透析的樣品，將培養(yǎng)上清液等份轉(zhuǎn)移至纖維素透析管中，并在4℃攪拌過夜下對25mM NaPO4、1mM EDTA,pH7透析。這可除去小于透析膜標稱分子量界值的上清液的任何自由流動成分?？状笮?-8kD和50kD，對這些樣品檢查保留于透析膜內(nèi)的成分的活性，其可稱為高分子量”。
在4℃下以氮氣壓通過1、3或10kD孔大小的膜進行超濾(“UF”)，產(chǎn)生低分子量級分。該方法產(chǎn)生含有小于超濾膜標稱分子量界值的上清液成分的溶液。這些溶液被稱為透過物”。
表6報告的結(jié)果表明，MB438和MB439的低于10kD的成分顯示活性。所有樣品都在TBG培養(yǎng)基上生長。未加熱處理任一種樣品。所有樣品均為24小時培養(yǎng)物。
表6
表7報告的結(jié)果表明，MB438和MB439的＜10kD成分顯示可被高熱降低的活性，而透析后低分子量成分的去除不能降低活性。所有樣品均為在TBG培養(yǎng)基上生長的24小時培養(yǎng)物。
表7
表8報告的結(jié)果表明，MB438和MB439在不能通過1kD超濾膜的低于10kD的成分中具有活性。所有樣品均為在TBG培養(yǎng)基上生長的24小時培養(yǎng)物。
表8
實施例8-MR957和MR557的生物活性MR957培養(yǎng)物在16×150mm帶蓋塑料管中的5.0ml培養(yǎng)基(DifcoTB預混合物；4g/升甘油)中生長。培養(yǎng)物于37℃下在滾筒上搖動24小時。離心沉淀細胞，傾析出上清液并保存。加入EDTA至1mM，樣品貯存于20℃。為進行細胞密度的測定，振蕩樣品，并將100μl每種培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到Falcon管(14mL；17×100mm)中。向每一管中加入4.9mL蒸餾水進行1∶50稀釋，并再次振蕩。用分光光度計在600nm下進行OD讀取。如實施例1所述培養(yǎng)重組蘇云金芽孢桿菌菌株。
用基本同實施例6所述的實驗設(shè)計對大腸桿菌克隆MR957和蘇云金芽孢桿菌克隆MR557(每種均含有MB438mis和war基因)進行西方玉米根蟲生物測定。MR948和MR539是含有無毒素基因插入片段的克隆載體的陰性對照菌株。為測定大腸桿菌菌株，以215μl/1.36cm2的劑量將上清液或整個培養(yǎng)樣品加于食物表面，而細胞沉淀樣品濃縮5倍，并以50ul/1.36cm2的劑量加于食物表面(表9)。為測定蘇云金芽孢桿菌菌株，以215μl/1.36cm2的劑量將上清液樣品加于食物表面，而細胞沉淀樣品濃縮5倍，并以不同的速度加于食物上(表10)。待樣品蒸發(fā)后立即向食物上轉(zhuǎn)移約6-8個幼蟲。使用釘板熨斗用聚酯薄膜密封生物測定平板，并在每個孔上打一針眼以利于氣體交換。包埋4天后測定死亡率。
這兩個實驗的結(jié)果證明了可歸因于克隆的MB438mis和war基因的較高CRW死亡率。表9顯示了大腸桿菌培養(yǎng)物粗制品中克隆的MB438毒素對西方玉米根蟲的定性活性。
表9
表10顯示蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)物粗制品中克隆的MB438毒素對西方玉米根蟲的劑量依賴的活性。在表9和表10中，下劃線的數(shù)字是百分死亡率；括號中的數(shù)字是指試驗中死亡的幼蟲除以總幼蟲數(shù)。
表10
實施例9-毒素基因向植物中的插入本發(fā)明的一個方面是用編碼本發(fā)明的殺蟲毒素的基因?qū)χ参锏霓D(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的植物可耐受靶害蟲的侵害。
能用本領(lǐng)域中眾所周知的多種技術(shù)將如此處公開的編碼殺蟲毒素的基因插入植物細胞中。這些技術(shù)包括用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化體用T-DNA轉(zhuǎn)化、融合、注射、biolistic(微粒轟擊)或電穿孔及其它可能的方法。
如果用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，則必須將欲插入的DNA克隆到特定質(zhì)粒中，即中間載體或二元載體中。通過與T-DNA序列同源的序列的同源重組，能將中間載體整合到Ti或Ri質(zhì)粒中。Ti或Ri質(zhì)粒也含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的vir區(qū)。中間載體本身不能在農(nóng)桿菌中復制。利用輔助質(zhì)粒(接合)能將中間載體轉(zhuǎn)移到根瘤農(nóng)桿菌中。二元載體本身能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復制。它們含有處于左右T-DNA邊界區(qū)之間的一種選擇性標記基因和一種接頭或多接頭。它們可被直接轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中(Holsters等人分子與普通遺傳學163:181-187)。用作宿主細胞的農(nóng)桿菌應含有一種攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是向植物細胞中轉(zhuǎn)移T-DNA所必需的。也可含有其它T-DNA。這樣轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌用于植物細胞的轉(zhuǎn)化。為了向植物細胞中轉(zhuǎn)移DNA，能方便地將植物外植體與根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)。然后在可含有用于篩選的抗生素或殺生物劑的適當培養(yǎng)基中，由被感染的植物材料(例如葉切片、莖切片、根，以及原生質(zhì)體，或懸浮培養(yǎng)細胞)再生為完整的植物。然后可檢測這樣得到的植物是否存在插入的DNA。
在注射和電穿孔中對質(zhì)粒沒有特殊要求。能使用普通質(zhì)粒，如pUC衍生物。在biolistie轉(zhuǎn)化中，能使用質(zhì)粒DNA或線性DNA。
含有大腸桿菌復制系統(tǒng)和允許篩選轉(zhuǎn)化細胞的標記的多種克隆載體可用于準備向高等植物中插入外源基因。這些載體包括，例如，pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，能將編碼芽孢桿菌毒素的序列插入載體的適當限制酶切位點處。用產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。大腸桿菌細胞在適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收獲并裂解?；厥赵撡|(zhì)粒。通常采用序列分析、限制酶切分析、電泳和其它生物化學-分子生物學方法作為分析方法。每一操作后，能酶切使用的DNA序列，并與下一個DNA序列連接。每種質(zhì)粒序列都能被克隆到同一或其它質(zhì)粒中。根據(jù)向植物細胞中插入希望的基因的方法，其它DNA序列可能是必需的。例如，如果用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，則Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界，但通常是左右邊界必須作為欲插入基因的側(cè)翼區(qū)連接。
T-DNA在植物細胞轉(zhuǎn)化中的應用已進行了大量研究，描述于EP120 516；Hoekema(1985),《二元植物載體系統(tǒng)》OffsetdrukkerijKanters B.V.,Alblasserdam，第5章；Fraley等人，植物科學評述(Crit.Rev.Plant Sci.)4:1-46；和An等人(1985)EMBO J.4:277-287。
插入的DNA整合到基因組中后，相對穩(wěn)定于此，并且通常不再移出。其通常含有一種選擇性標記，該選擇性標記賦予被轉(zhuǎn)化的植物細胞對殺生物劑或抗生素尤其如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素的抗性。因此單個使用的標記應使得能篩選出除不含插入DNA的細胞之外的轉(zhuǎn)化細胞。
轉(zhuǎn)化細胞以常規(guī)方式再生為形態(tài)學正常的植物。如果轉(zhuǎn)化事件涉及種系細胞，則插入的DNA和相應的表型性狀將遺傳給子代植物。這些植物能以正常的方式生長，并與具有相同轉(zhuǎn)化遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。產(chǎn)生的雜種個體具有相應的表型特性。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，能用已為植物優(yōu)化了密碼子選擇的基因轉(zhuǎn)化植物。參見，例如，美國專利號5,380,831。
應當理解，此處所述的實施例和實施方案只是用于說明目的，可為本領(lǐng)域技術(shù)人員建議根據(jù)它們的多種修改或改變，其包括于本說明書和以下權(quán)利要求書的精神和范圍之內(nèi)。
序列表<110>申請人姓名MYCOGEN公司街道地址5501Oberlin Drive城市San Diego州/省加利福尼亞國家美國郵政編碼92121電話(800)745-7475傳真(619)453-0142<120>來自側(cè)孢芽孢桿菌的殺蟲毒素和基因<130>MA-719XC2<140><141><150>60/095,955<151>1998-08-10<150>60/138,251<151>1999-06-08<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2645<212>DNA<212>側(cè)孢芽孢桿菌<400>1atgaagaaga agttagcaag tgttgtaacg tgtacgttat tagctcctat gtttttgaat 60ggaaatgtga atgctgttta cgcagacagc aaaacaaatc aaatttctac aacacagaaa 120aatcaacaga aagagatgga ccgaaaagga ttacttgggt attatttcaa aggaaaagat 180tttagtaatc ttactatgtt tgcaccgaca cgtgatagta ctcttattta tgatcaacaa 240acagcaaata aactattaga taaaaaacaa caagaatatc agtctattcg ttggattggt 300ttgattcaga gtaaagaaac gggagatttc acatttaact tatctgagga tgaacaggca 360attatagaaa tcaatgggaa aattatttct aataaaggga aagaaaagca agttgtccat 420ttagaaaaag gaaaattagt tccaatcaaa atagagtatc aatcagatac aaaatttaat 480attgacagta aaacatttaa agaacttaaa ttatttaaaa tagatagtca aaaccaaccc 540cagcaagtcc agcaagatga actgagaaat cctgaattta acaagaaaga atcacaggaa 600ttcttagcga aaccatcgaa 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1．編碼一種毒素的分離的多核苷酸，其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。
2．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素是熱不穩(wěn)定的。
3．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素能從所述側(cè)孢芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)上清液中獲得。
4．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素的分子量為約1kDa～約10kDa。
5．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素與第二種蛋白質(zhì)一起對玉米根蟲有毒，其中第二種蛋白質(zhì)由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。
6．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素是一種MIS毒素。
7．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素是一種WAR毒素。
8．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述菌株是MB438。
9．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述菌株是MB439。
10．權(quán)利要求1的多核苷酸，其編碼一種選自SEQ ID NO:7、SEQID NO:9、SEQ ID NO:7的殺蟲部分和SEQ ID NO:9的殺蟲部分的氨基酸序列。
11．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其活性部分。
12．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
13．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其活性部分。
14．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
15．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的引物經(jīng)聚合酶鏈反應擴增該多核苷酸的一部分。
16．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中編碼所述毒素的核苷酸序列，或該核苷酸序列的互補序列，在嚴格條件下可與第二種核苷酸序列雜交，此第二種核苷酸序列選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:6的一部分和足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:8的一部分。
17．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:1。
18．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:2。
19．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:5。
20．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:6。
21．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:8。
22．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:10。
23．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:6的一部分。
24．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第二種核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:8的一部分。
25．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸包含一種序列，該序列選自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:6的一部分和足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:8的一部分。
26．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:5的序列。
27．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:6的序列。
28．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:8的序列。
29．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:10的序列。
30．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:6的一部分。
31．權(quán)利要求16的多核苷酸，其中該多核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO:8的一部分。
32．一種分離的毒素，其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。
33．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素是熱不穩(wěn)定的。
34．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素能從所述側(cè)孢芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)上清液中獲得。
35．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素的分子量為約1kDa～約10kDa。
36．權(quán)利要求32的毒素，它與第二種蛋白質(zhì)一起對玉米根蟲有毒，其中該第二種蛋白質(zhì)由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。
37．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素是一種MIS毒素。
38．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素是一種WAR毒素。
39．權(quán)利要求32的毒素，其中所述菌株是MB438。
40．權(quán)利要求32的毒素，其中所述菌株是MB439。
41．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其活性部分。
42．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
43．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
44．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
45．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其活性部分。
46．權(quán)利要求32的毒素，其中該毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
47．一種重組宿主，其包含編碼一種毒素的多核苷酸，其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。
48．權(quán)利要求47的宿主，其中該宿主是一種細菌細胞。
49．權(quán)利要求47的宿主，其中該宿主是一種植物細胞。
50．權(quán)利要求47的宿主，其中該宿主是一種植物。
51．權(quán)利要求47的宿主，其中該宿主是一種玉米細胞。
52．權(quán)利要求47的宿主，其中該宿主是一種玉米植物。
53．一種防治非哺乳動物害蟲的方法，其中該方法包括使該害蟲接觸一種分離的毒素，其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生。
54．權(quán)利要求53的方法，其中所述害蟲是一種鞘翅目昆蟲。
55．權(quán)利要求53的方法，其中所述害蟲是一種玉米根蟲。
56．權(quán)利要求53的方法，其中該方法還包括使所述害蟲接觸由選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的第二種蛋白質(zhì)。
57．選自MB438和MB439的側(cè)孢芽孢桿菌菌株的生物純培養(yǎng)物。
58．權(quán)利要求36的培養(yǎng)物，其中所述菌株是MB438。
59．權(quán)利要求36的培養(yǎng)物，其中所述菌株是MB439。
全文摘要
公開了可從此處公開的側(cè)孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)分離株中獲得的新型毒素和基因,并申請專利。在優(yōu)選的實施方案中,此基因及毒素用于防治西方玉米根蟲。
文檔編號C12N15/31GK1319138SQ99810679
公開日2001年10月24日 申請日期1999年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月10日
發(fā)明者H·E·施奈佩, K·E·納瓦, B·A·斯托克霍夫, S·芬斯塔得李, M·沃爾茲, B·斯特吉斯 申請人:麥考根公司