專利名稱：能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
911事件之后的炭疽芽孢襲擊事件，引起了人們對(duì)生物武器的恐慌。炭疽桿菌形成的芽孢具有存活時(shí)間長(zhǎng)，易于傳播，引起的炭疽桿菌病發(fā)病時(shí)間快和死亡率高等特點(diǎn)，在我 國(guó)被列為乙類傳染病，是恐怖主義者首選武器之一。炭疽桿菌毒性菌株含有兩個(gè)大質(zhì)粒，分別是編碼毒素基的PXOl質(zhì)粒(184. 5kbp)， 合成莢膜相關(guān)基因的PX02質(zhì)粒(95. 3kbp)。強(qiáng)毒株需要兩種質(zhì)粒的存在，缺少pXOl則不產(chǎn) 生毒素，即為弱毒菌；缺少PX02則不形成莢膜，比野生型菌毒力低百倍，因此炭疽桿菌致病 因子主要是莢膜和炭疽毒素兩個(gè)方面，而能夠引起機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生免疫保護(hù)應(yīng)答的成分豈今 發(fā)現(xiàn)主要是炭疽毒素中的保護(hù)性抗原(PA)，另外炭疽桿菌的芽孢成分、水腫因子(EF)及致 死因子(LF)均有增強(qiáng)免疫保護(hù)的作用。我國(guó)當(dāng)前應(yīng)用于疫苗的A16R株是只具有pXOl大 質(zhì)粒的弱毒株，但殘留一定的毒性，存在一定的副作用等缺點(diǎn)。我們已經(jīng)消除PXOl毒性質(zhì) 粒，建立“無(wú)毒”的炭疽桿菌芽孢突變株，并且獲得專利(專利號(hào)ZL200610007229. 3)。根據(jù)PA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，可將其分成4個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域1 (PADl)由1 258氨 基酸殘基組成，其中PA2tl成熟蛋白序列為第20 186氨基酸殘基，PADl含有弗林蛋白酶 (furin)的切割位點(diǎn)和LF及EF的結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域2 (PAD2)由259 487氨基酸殘基組 成，參與蛋白七聚體的形成及LF、EF進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)孔道的形成；結(jié)構(gòu)域3(PAD3)由488 595 氨基酸殘基組成，參與七聚體的形成；結(jié)構(gòu)域4(PAD4)由596 735氨基酸殘基組成，為細(xì) 胞受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PADl包括furin蛋白酶的作用位點(diǎn)和EF/LF的結(jié)合位點(diǎn)，抗PA2tl抗體 能阻止LF或EF與PA結(jié)合，從而阻止LF或EF進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽桿菌突變株及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽桿菌株，是將PagA2tl基因插入 到炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端獲得的菌株。所述pagA2Q基因具有自GeneID =2820165的5'端第20-186位核苷酸序列；所述 bclA基因具有自GeneID =62823670的5'端第1-389位核苷酸序列。所述能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽芽孢桿菌株還經(jīng)過去除構(gòu)建過程中引入 的抗生素標(biāo)記。所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)為減毒活疫苗菌株，具體為炭疽芽孢桿 菌(Bacillus anthracis)AP422 CGMCC Na . 1569。所述能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽芽孢桿菌株優(yōu)選為炭疽芽孢桿菌 (Bacillusanthracis)AP423 CGMCC Na . 3403 炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423CGMCC Ns. 3403是通過同源重組將pagA2Q基因插入到炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) 芽孢蛋白bclA基因未端，并采用重組酶將引入的卡那抗性基因敲除，通過大量鑒定篩選獲 得的一株能在芽孢表面展示PA2tl蛋白，并且無(wú)抗生素標(biāo)記的炭疽芽孢桿菌株。所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423，已于2009年11月05日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū) 大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC Na . 3403。本發(fā)明還提供一種能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽芽孢桿菌株的獲得方法，是 將將PagA2tl基因插入到炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端。所述pagA2Q基因具有自GeneID =2820165的5'端第20 186位核苷酸序列；所 述bclA基因具有自GeneID =62823670的5 ‘端第1-389位核苷酸序列；所述PagA2tl基因通 過同源重組的方法敲入所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)中。所述炭疽芽孢桿菌 (Bacillusanthracis)優(yōu)選為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP422 CGMCC Na. 1569 上述能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽芽孢桿菌株可用于制備減毒活疫苗。本發(fā)明的炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423應(yīng)用基因打靶技術(shù)成功將 PagA20基因插入到炭疽桿菌芽孢蛋白bclA基因未端，并在此突變體芽孢蛋白中檢測(cè)到PA2tl 的存在，這為將來(lái)研制新型炭疽桿菌芽孢疫苗打下基礎(chǔ)，如滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位 疫苗或基因工程疫苗。炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP423菌株可用于制備減毒活 疫苗，應(yīng)用此減毒活疫苗免疫人和動(dòng)物后可產(chǎn)生對(duì)PA2tl和相關(guān)芽孢蛋白的免疫應(yīng)答。


圖1為重組載體酶切鑒定瓊脂糖電泳圖；圖中，泳道M :DNA Marker ；泳道1 pT-pagA2Q用Pst I和Sac II雙酶切的結(jié)果；泳道2 :pT-pagA2(1用Pst I和Sac II雙酶切的 結(jié)果；泳道3 :pT-da用EcoR I和Xho I雙酶切的結(jié)果；泳道4 :pT_lpka用Sac II和EcoR I雙酶切的結(jié)果。圖2為pagA2Q基因敲入所采用的方法示意圖。圖3為PagA2tl基因敲入陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子重組菌PCR鑒定結(jié)果。圖4為kana基因成功去除重組轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果。圖5為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP423芽孢蛋白電泳6為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423芽孢蛋白免疫印跡7為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423芽孢蛋白免疫效果實(shí)驗(yàn)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、一株能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽桿菌突變株的獲得1、打靶載體的構(gòu)建提取炭疽桿菌A16R株(炭疽芽孢桿菌A16R株無(wú)菌培養(yǎng)濾液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析董 梅，莊漢瀾，王希良軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2009年2月第33卷第1期，由中國(guó)人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所保存)內(nèi)質(zhì)粒pXOl，以質(zhì)粒pXOl為模板通過PCR反應(yīng)獲得 pagA2(l 基因，引物為 PA20F(5，CCAATGCATGAAGTTAAACAGGAGAA3，(序列表中序列 1))和 P A20R(5，TCCCCGCGGTTATCGCTTTTTTCT 3，(序列表中序列 2))，PCR 擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變性 5min，然后擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)-MV 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，最后 72°C延伸 lOmin，純化 PCR 片 段并連入pEASY-Tl載體(全式金生物技術(shù)公司)，得到重組質(zhì)粒PTl-PagA2tl，并對(duì)其進(jìn)行酶 切鑒定和測(cè)序分析表明載體構(gòu)建正確。其酶切鑒定結(jié)果見圖1的泳道1，結(jié)果表明，重組質(zhì) 粒PTl-PagA2tl含有該501bp的pagA2(1基因，且經(jīng)測(cè)序鑒定沒有發(fā)生突變。
上游打靶片段和下游打靶片段以炭疽桿菌AP422 (保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 委理員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC Na . 1569 ；專利號(hào)為ZL200610007229. 3，授權(quán) 公告號(hào)為CN 100362094C)基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游打靶片段引物為ARMBclAF(5，C CGGATCCACTAGGACTTCCAGCAGGAC 3，(序列表中序列 3))和 ARMBc IAR (5，CGCTGCAGACCTGGAGC AACTTTTTCAATAATAATG 3，(序列表中序列4))，下游打靴片段引物為DAFF (5，GACGAATTCACT TAGCAGTAAAACTGATATC 3，(序列表中序列 5))和 DAFR (5，TCGAGCTCTTTCCTTGACTACAGTTTCC 3，(序列表中序列17)。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，然后擴(kuò)增30個(gè)循環(huán):94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，最后72°C延伸lOmin，純化PCR片段并分別連入pEASY_Tl載體(全式 金生物技術(shù)公司)得到含有上游打靶片段的重組質(zhì)粒pTl-ua和含有下游打靶片段的重組 質(zhì)粒pTl-da，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。含有上游打靶片段的重組質(zhì)粒pTl-ua和含 有下游打靶片段的重組質(zhì)粒pTl-da的酶切鑒定結(jié)果分別如圖1中泳道2和泳道3所示，結(jié) 果表明pTl-ua含有1218bp的上游打靶片段，pTl-da中含有851bp的下游打靶片段，且經(jīng) 測(cè)序鑒定沒有發(fā)生突變。以質(zhì)粒pBE2 (參考文獻(xiàn)枯草桿菌一大腸桿菌多功能穿梭載體的構(gòu)建，郭興華、熊 占、周民、賈士芳、許怡，生物工程學(xué)報(bào)(70) :224 229，1991，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué) 科學(xué)院生物工程研究所保存)為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得LoxP-kana基因片段(攜帶重組 酶識(shí)別位點(diǎn)LoxP的卡那抗性基因片段)，引物為lpkaF(5，TCCCCGCGGATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTATGTCGACAATTAGACTATGATCCAA3，(序列表中序列 6))和 lpkaR(5，GCCGAAT TCGTATGACAAGGTGAGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGACTCAAAATGGTATGCGT 3，(序列表中序列7))，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，然后擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)94°C30s， 60°C 30s, 72°C lmin，最后72°C延伸lOmin，純化PCR片段并連入pEASY_Tl載體(全式金 生物技術(shù)公司)得到重組質(zhì)粒pTl-lpka，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析表明載體構(gòu)建正 確，pTl-lpka中含有1400bp的LoxP-kana基因片段，且經(jīng)測(cè)序鑒定沒有發(fā)生突變。其中， 酶切鑒定結(jié)果見圖1的泳道4。用Pst I 和 Sac II 雙酶切 pTI-PA20 回收 PagA20 片段(具有自 GENBANK GeneID 2820165的5 ‘端第20 186位核苷酸序列)，將PagA20片段插入到pTl-ua的Pst I和Sac II酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到重組載體，將其進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定表明正確的重組質(zhì)粒 命名為 pTl-pagA20uao 用 BamH I 和 Sac II 雙酶切 pTl_pagA20ua，回收 pagA2(1ua 上游臂片 段，將該片段插入到pTl-lpka的BamH I和Sac II酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體，將重組載 體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pTl-pagA2(1ualpka。用EcoR I 禾Π Xho I 對(duì) pTl_pagA20ualpka 禾Π pTl-da 進(jìn)行雙酶切，回收 pTl-pagA20ualpka載體片段和da片段，T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體，將重組載體 進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pTl-pagA2(1ualpkada。
用BamH I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pTl_pagA2(lualpkada和pMAD，回收pMAD載體片段和 打靶片段PagA2ciUalpkada,得到重組載體，將重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的 重組質(zhì)粒命名為 pMAD-pagA2(lualpkada，將 pMAD_pagA2(lualpkada 電轉(zhuǎn)化 E. coli SCSllO (購(gòu) 自Stratagene公司)，提取質(zhì)粒得到非甲基化的質(zhì)粒pMAD-pagA2(1ualpkada，用于轉(zhuǎn)化 B.anthracis。2、Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以枯草桿菌N2 168(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱ATCC，保藏編號(hào)為 ATCCNo. 23857)為模板，利用引物amyrF和amyrR擴(kuò)增得到淀粉酶啟動(dòng)子AmyRl，并在兩 端分別引入BamH I和Hind III位點(diǎn)。將擴(kuò)增回收的片段用BamH I和Hind III酶雙酶 切處理后與經(jīng)同樣的內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒PHY304連接后轉(zhuǎn)化E. coli ToplO，得到的重組 質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pHY-AmyR。然后以質(zhì)粒pBS185 (購(gòu)自 GibcoBRL公司)為模板，以creF和creR為引物，擴(kuò)增Cre重組酶基因，通過引物序列在兩 端分別引入Hind III和Xho I位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增得到的Cre重組酶基因片段用Hind III 和Xho I雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pHY-AmyR連接轉(zhuǎn)化E. coli ToplO,得到的重 組質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化E. coliSCSllO，最終得到可用于轉(zhuǎn)化炭疽 桿菌的去甲化的質(zhì)粒pHY-Cre。上述引物序列為amyrF :GCGGATCCGACGACAGGGGGATTC(序 列表中序列 8)，amyrR :CCCAAGCTTTCTTGACTCCTTAT (序列表中序列 9) ； creF CCCAAGCTTATGTCCAATTTACTG (序列表中序列 10)，creR CCGCTCGAGCTAATCGCCATCTTCC (序列 表中序列11)。3、pagA2Q 基因敲入pagAm基因敲入所采用的策略如圖2所示。具體方法如下所述從-70°C保存的減毒活疫苗株B. anthracis AP422 CGMCC Ns . 1569菌種中劃線 分離單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng).將過夜培養(yǎng)物按1 %的比例接種到 IOOmL新的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng).當(dāng)0D_值達(dá)到0. 5-0. 6時(shí)(約2小時(shí))，從 搖床中取出，制備感受態(tài)細(xì)胞。每40 μ L感受態(tài)細(xì)胞加3 μ L (約0. 9 μ g)質(zhì)粒pMAD-pagA2(1ualpkada，混合后于 0. Icm電擊杯中冰浴5分鐘，然后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，條件為1. 8kV、200Q和 25 μ F。電擊完畢后立即加入ImL冰冷的BH培養(yǎng)基(3. 7% Brain-Heart培養(yǎng)基購(gòu)自BD公 司)，30度孵育2. 5小時(shí)。分別200 μ L涂布于含卡那酶素(25 μ g/mL)的LB平板上，30°C 培養(yǎng)24小時(shí)。挑取單菌落，接種到含卡那酶素(25μ g/mL)5mL LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)12小時(shí)， 并取IOyL培養(yǎng)物繼續(xù)接種含卡那酶素(25yg/mL)5mL LB培養(yǎng)基中，連續(xù)傳5代后，取 5 μ L培養(yǎng)物梯度稀釋，取10_2、10_3和10_4稀釋液各100 μ L涂布于含卡那酶素(25 μ g/mL) 的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。由于質(zhì)粒pMAD上含有β -半乳糖苷酶基因，因此在X_gal存 在的情況下，能夠顯藍(lán)色，所以如果質(zhì)粒與基因組沒有發(fā)生重組，那么菌落就是藍(lán)色的，只 有菌落為白色的菌才有可能是發(fā)生了同源重組。因此按照上述操作后，隨機(jī)挑取白色單菌 落，用進(jìn)行PCR鑒定。取10個(gè)37°C培養(yǎng)生長(zhǎng)出的單菌落，接種到含卡那酶素(25yg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)物5 μ L進(jìn)行全菌PCR鑒定，用BclA基因上游同源臂外側(cè)IOObp處的引物GPl (5，AACGGGCTATTGTCTTCTCCTCATC 3，(序列表中序列12))和引物PA20R(5’ TCCCCGCGGTTATCGCTTTTTTCT 3'(序列表中序列13))，下游同源臂外側(cè) IOObp左右的的引物GP2 (5，ATCATCGATTTGAGTCATAGGAGT 3，(序列表中序列14))和引物 KPl (5，AACAGAGGAAGCAGAGTTCAGCC 3，(序列表中序列15))兩對(duì)引物對(duì)重組轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR鑒定。同時(shí)以正常B. anthracis AP422菌株做對(duì)照。引物GPl和引物PA20R擴(kuò)增得到 1939bp的片段，引物GP2和引物KPl擴(kuò)增得到1588bp時(shí)，則篩選得到陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)化子。部 分菌落PCR鑒定的結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明篩選得到1株陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)化 子兩對(duì)鑒定引物均能成功擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，對(duì)擴(kuò)增DNA的片段進(jìn)行序列分析表明基 因重組成功，對(duì)擴(kuò)增DNA的片段進(jìn)行序列分析表明PagA2tl成功的插入bclA基因的未端，這 對(duì)BclA蛋白未端表達(dá)PA2tl蛋白具有重要意義，將該菌株命名為AP423K，AP423K在42°C條 件下，重組菌株在LB液體培培養(yǎng)基連續(xù)傳代3代，使得重組質(zhì)粒丟失，以徹底去除可能的紅 霉素抗性。圖3中，M :DNA Marker ；1 =GPl和PA2tlR擴(kuò)增的PCR片段；2 :GP2和KPl擴(kuò)增的 PCR片段。 4、重組菌kana基因的去除 將質(zhì)粒pHY-Cre轉(zhuǎn)化步驟3獲得的傳代后的菌株AP423K，方法同樣采用電轉(zhuǎn)化，條件同按步驟3中所述方法，電擊完畢后按照步驟3所述的方法立即加入ImL冰冷的BH培養(yǎng) 基，30度孵育2. 5小時(shí)。取50 μ L涂布于含紅霉素(5 μ g/mL)的LB平板上，30°C過夜培養(yǎng)， 取單菌落在含紅霉素(5 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中30°C傳兩代后，，在37°C無(wú)抗生素存在 的條件下(LB培養(yǎng)基)連續(xù)傳三代，然后取菌液稀釋涂無(wú)抗生素的LB平板，在此平板上的 單個(gè)菌落標(biāo)記數(shù)字記號(hào)，取每個(gè)單菌落分別接種含有無(wú)抗生素、卡那霉素和紅霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，得到在卡那霉素和紅霉素的LB液體培養(yǎng)基不長(zhǎng)的菌株，將其命名為炭疽芽孢 桿菌(Bacillus anthracis)AP423。所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423，已于2009年11月05日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū) 大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC Na . 3403。用帶卡那霉素抗性重組菌AP423K和AP423兩株菌的基因組作為模板，以引物PA20 F (5‘ CCAATGCATGAAGTTAAACAGGAGAA 3，(序列表中序列 16))和 DAFR (5，TCGAGCTCTTTCCTTG ACTACAGTTTCC 3’(序列表中序列17))進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖4。從圖中我們可以看出， 重組菌AP423基因組用上述引物擴(kuò)出的片段大小約1.3kb，AP423K基因組用上述引物擴(kuò)出 的片段大小約2. 7kb，而AP423未能擴(kuò)增出PCR片段，這與理論值相當(dāng)。擴(kuò)增得到的片段連 接到T載體后測(cè)序，結(jié)果顯示卡那霉素基因已經(jīng)完全缺失，相應(yīng)位點(diǎn)處只剩下一個(gè)LoxP位 點(diǎn)，這就在基因水平上證實(shí)了卡那霉素基因成功去除。圖4中M =DNA Marker ；1 :AP423 ；2 AP423K。實(shí)施例2、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423的芽孢蛋白分析將炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423接種于IOOmL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C連續(xù)培養(yǎng)5天，并涂菌染色觀察芽孢形成情況。取所有培養(yǎng)液，17000g離心5分鐘，棄上清，再用等體積無(wú)菌水洗滌一次，最后用 100 μ L芽孢蛋白裂解液(0. IM DTT, 0. 5% (質(zhì)量百分含量)SDS，0. IM NaCl, ρΗΙΟ. 0)重懸 菌體，37°C孵育2小時(shí)30分鐘，17000g離心10分鐘，棄上清，沉淀用100 μ L PBS溶解得到 重組菌全菌蛋白，用10%凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
在SDS-PAGE分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行免疫印跡分析。將AP422 (全菌蛋白獲得方法 同上述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423)和重組菌全菌蛋白用10%凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 小時(shí)；再與抗PA2tl的抗血清(1 5000稀釋)37°C共孵育2小時(shí)；用PBST洗滌3次，每次5 分鐘，再與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(該抗體購(gòu)自中杉公司，1 5000稀釋)共孵育1小 時(shí)，最后將膜用PBST洗干凈后用HRP顯色試劑盒(購(gòu)自天根公司)進(jìn)行顯色。上述抗PA2tl的抗血清的制備方法為按照炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原PA20 基因成熟肽編碼序列設(shè)計(jì)引物(所述PagA2tl基因具有自GeneID :2820165的5 ‘ 端第 20-186 位核苷酸序列)(PA20F CGAGGATCCAGAAGTTAAACAGGAGAAC, PA20R GCACTCGAGTCGCTTTTTTCTTGAGTTC)。提取炭疽桿菌A16R株(炭疽芽孢桿菌A16R株無(wú)菌培養(yǎng) 濾液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析董梅，莊漢瀾，王希良軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2009年2月第33卷第1 期，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所保存)內(nèi)質(zhì)粒PX01，以質(zhì)粒pXOl為 模板，擴(kuò)增出PagA2tl基因片段，將該片段定向插入到原核表達(dá)載體pET_28a(購(gòu)自Novagen 公司)中(酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I)，獲得了 pET_PA2(1原核表達(dá)重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自Invitrogen公司)獲得表達(dá)PA2tl的重組菌，挑取重組菌接 種LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液0D600值達(dá)到0. 8時(shí)加入IPTG(購(gòu)自Promega公司)進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)(IPTG終濃度為lmmol/L)4小時(shí)，離心收集菌體并對(duì)其超聲破碎，對(duì)表達(dá)的PA2tl蛋白用 鎳柱(購(gòu)自GE公司)進(jìn)行親和層析純化，用純化的蛋白免疫新西蘭大耳白兔(免疫劑量為 0. 5mg/只，免疫三次，每次間隔兩周) ，第三次免疫兩周后取兔血清獲得對(duì)PA2tl的多克隆抗 體血清。對(duì)血清進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)，結(jié)果顯示抗體滴度可達(dá)1 10000。對(duì)于基因水平鑒定正確的PagA2tl基因插入突變株菌株用10%凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果如圖5所示。以抗PA2tl蛋白的兔抗血清做為一抗進(jìn)行對(duì)重組菌炭疽芽孢桿 菌(Bacillus anthraCiS)AP423進(jìn)行免疫印跡分析證明PA^1蛋白得到了表達(dá)，結(jié)果見圖6。 圖 5 和圖 6 中，M 蛋白 Marker ；1 :AP422 ；2 :AP423。實(shí)施例3、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP423的芽孢免疫效果驗(yàn)證以AP423芽胞免疫Balb/c小鼠，每只小鼠蹊部注射約IO9個(gè)芽胞，一共免疫三次， 兩次免疫時(shí)間間隔兩周，第三次免疫兩周后取血清進(jìn)行ELISA反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果見圖7，結(jié)果 表明血清滴度可以達(dá)到1600倍(ρ < 0. 01)。圖7中ck為免疫AP422芽胞免疫Balb/c小 鼠°
權(quán)利要求
一株能在芽孢表面展示PA20蛋白的炭疽桿菌株，是將pagA20基因插入到炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端獲得的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于所述PagA2tl基因的序列為自GeneID 2820165的5'端第20 186位核苷酸序列；所述bclA基因的序列為自GeneID =62823670 的5'端第1-369位核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的菌株，其特征在于所述能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的 炭疽芽孢桿菌株還經(jīng)過去除構(gòu)建過程中引入的抗生素標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的菌株，其特征在于所述炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)為減毒 舌疫苗菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于所述能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽 桿菌株為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)CGMCC Ns . 3403。
6.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽桿菌株的方法，是將 將PagA2tl基因插入到炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述PagA2tl基因的序列為自GeneID 2820165的5'端第20 186位核苷酸序列；所述bclA基因的序列為自GeneID =62823670 的5'端第1-369位核苷酸序列；所述PagA2tl基因通過同源重組的方法敲入所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述炭疽芽孢桿菌 (Bacillusanthracis)為所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP422 CGMC Ns · 1569。
9.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的能在芽孢表面展示PA2tl蛋白的炭疽桿菌株在制備 免疫制劑中的應(yīng)用；所述免疫制劑優(yōu)選為滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗或基因工程疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株能在芽胞表面展示PA20蛋白的炭疽桿菌株及其應(yīng)用。該菌株，是將pagA20基因插入到炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)芽胞蛋白bclA基因未端獲得的菌株。具體可為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)CGMCC №.3403。該菌株可作為宿主，用于制備免疫制劑，所述免疫制劑優(yōu)選為滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗或基因工程疫苗。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101798565SQ20101011562
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者劉純杰, 展德文, 王令春, 王艷春, 王芃, 袁盛凌, 陶好霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所